本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及一種檢測(cè)耳聾基因的引物及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：聽覺系統(tǒng)中外耳、中耳、內(nèi)耳結(jié)構(gòu)異常及聽覺傳導(dǎo)信號(hào)通路中的聽神經(jīng)和各級(jí)中樞發(fā)生病變，導(dǎo)致聽功能障礙，表現(xiàn)出不同程度的聽力下降，統(tǒng)稱為耳聾。耳聾的致病因素有很多，主要包括環(huán)境因素、遺傳因素及環(huán)境-遺傳相互作用。30％的遺傳性耳聾除了耳聾外，還伴有其他異常，稱為綜合征型耳聾(shi)。70％的遺傳性耳聾可單獨(dú)發(fā)生，稱為非綜合征型耳聾(nshi)，但是往往伴有前庭功能障礙。已知遺傳性非綜合征型耳聾有多種遺傳方式，最常見的是常染色體隱性遺傳(ar)，占75％～80％。雖然耳聾致病基因具有較高的基因和位點(diǎn)異質(zhì)性，但大部分的耳聾是由少數(shù)幾個(gè)基因的熱點(diǎn)突變引起的，包括gjb2、gjb3、slc26a4、線粒體基因(mtdna12srrna)等，這使遺傳性耳聾的基因診斷和篩查成為可能。傳統(tǒng)耳聾基因診斷方法包括限制性片段長度多態(tài)性分析(rflp)、限制性內(nèi)切酶酶切指紋-單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析(ref-sscp)、變性高效液相色譜法(dhplc)、實(shí)時(shí)熒光定量探針法、pcr結(jié)合sanger測(cè)序。但是限制性內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)有限，針對(duì)特定的基因能檢出的位點(diǎn)很少，導(dǎo)致檢出率低，且反應(yīng)條件嚴(yán)格，操作繁瑣。dhplc檢測(cè)率高，對(duì)未知突變的檢測(cè)準(zhǔn)確率達(dá)95％以上，對(duì)已知突變大于99％，靈敏度高，但是不能檢測(cè)純合突變，且無法得出具體的突變類型和突變位點(diǎn)。實(shí)時(shí)熒光定量探針則價(jià)格昂貴，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，靈敏度低。pcr結(jié)合sanger測(cè)序被認(rèn)為是突變檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)，但是一般一次只能對(duì)一個(gè)基因或一個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)，導(dǎo)致耳聾患者的檢出率不高?；蛐酒墙陙戆l(fā)展起來的一種高通量、自動(dòng)化的基因檢測(cè)方法，讓多基因、多位點(diǎn)同時(shí)檢測(cè)成為可能，但基因芯片成本昂貴，技術(shù)要求高。因此，尋找一種能一次性檢測(cè)多個(gè)基因熱點(diǎn)突變、可靠、經(jīng)濟(jì)、快速的技術(shù)尤為重要。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，多重pcr的應(yīng)用使得同時(shí)檢測(cè)多個(gè)突變位點(diǎn)成為可能，而引物的設(shè)計(jì)就尤為重要。但是采用常規(guī)方式進(jìn)行引物設(shè)計(jì)時(shí)可能面對(duì)gc含量高引起錯(cuò)配的問題，現(xiàn)有技術(shù)中主要是采用避開gc含量高區(qū)域或者直接使用高gc含量區(qū)域的方法進(jìn)行，但是避開高gc含量區(qū)域的方法不能解決某些位點(diǎn)沒有調(diào)整的空間，直接使用容易引起引物非特異性結(jié)合，干擾檢測(cè)。因此尋找一種有效設(shè)計(jì)引物的方法具有重要的意義。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的之一是提供一種引物，該引物可以特異性、靈敏的結(jié)合靶序列。本發(fā)明的目的之二是提供一種設(shè)計(jì)引物的方法，使用該方法設(shè)計(jì)引物能夠降低gc含量，提高引物的結(jié)合特異性。本發(fā)明的目的之三是提供一種檢測(cè)耳聾基因多態(tài)性的試劑盒，使用該試劑盒可以準(zhǔn)確、快速、高通量、低成本的實(shí)現(xiàn)多個(gè)耳聾多態(tài)位點(diǎn)的的一次性檢測(cè)。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：本發(fā)明提供了一種檢測(cè)耳聾基因gjb2點(diǎn)突變的引物，所述突變點(diǎn)為35delg，所述引物包括pcr擴(kuò)增引物和單堿基延伸引物，其中，pcr擴(kuò)增引物的序列如seqidno.1～2所示，單堿基延伸引物序列如seqidno.3所示。本發(fā)明提供了一種設(shè)計(jì)引物的方法，使用a/t堿基替換連續(xù)g/c序列中的g/c。進(jìn)一步，所述的替換位于連續(xù)g/c的第三或第四個(gè)位置。在對(duì)相應(yīng)的g/c替換后要保證引物3’端有2～3個(gè)堿基與模板鏈互補(bǔ)配對(duì)，并且分析替換后的引物擴(kuò)增分析序列的特異性。本發(fā)明提供了序列seqidno.1～3所示的引物在制備檢測(cè)耳聾基因多態(tài)性的產(chǎn)品中的應(yīng)用。進(jìn)一步，所述產(chǎn)品包括芯片、核酸膜條、試劑盒。所述芯片包括固相載體以及固定在固相載體上的針對(duì)上述snp的寡核苷酸探針；所述核酸膜條包括基底和固定于所述基底上的寡核苷酸探針；所述試劑盒包括容器和針對(duì)上述snp的芯片或核酸膜條或pcr擴(kuò)增引物序列。所述固相載體包括無機(jī)載體和有機(jī)載體，所述無機(jī)載體包括但不限于有硅載體、玻璃載體、陶瓷載體等；所述有機(jī)載體包括聚丙烯薄膜、尼龍膜等；所述基底可以是任何適于固定寡核苷酸探針的基底，例如尼龍膜、硝酸纖維素膜、聚丙烯膜、玻璃片、硅膠晶片、微縮磁珠等。本發(fā)明提供了一種檢測(cè)耳聾基因多態(tài)性的試劑盒，所述試劑盒包括序列seqidno.1～3所示的引物。進(jìn)一步，所述試劑盒還包括pcr反應(yīng)體系、sap反應(yīng)體系和單堿基延伸反應(yīng)體系；其中，pcr反應(yīng)體系包括pcr緩沖液、25mmdntps、25mmmgcl2、5u/μlpcr酶；單堿基延伸反應(yīng)體系包括iplex緩沖液、iplex終止混合物、iplex酶。進(jìn)一步，所述試劑盒還包括dna提取試劑、陰性質(zhì)控品、陽性質(zhì)控品、純化樹脂、質(zhì)譜檢測(cè)芯片。在本發(fā)明的具體實(shí)施方式中，所述試劑盒還包括檢測(cè)其他耳聾基因snp位點(diǎn)的引物，所述耳聾基因包括(但不限于)slc26a4、gjb2、mtdna、gjb3c。進(jìn)一步，所述slc26a4、gjb2、mtdna、gjb3c的snp位點(diǎn)包括下述的一種或幾種：slc26a4基因上的1226g>a、1229c>t、1174a>t、1975g>c、2027t>a、2162c>t、2168a>g、919-2a>g、1707+5g>a、281c>t、589g>a；gjb2基因上的299_300delat、235delc、176_191del16、167delt、109g>a、508_511insaacg；mtdna基因上的1494c>t、1555a>g；gjb3基因上的538c>t、547g>a中的一種或幾種。在本發(fā)明的具體實(shí)施方式中，針對(duì)上述snp位點(diǎn)的引物序列如seqidno.4～48所示。其中，針對(duì)1226g>a、1229c>t、1174a>t的擴(kuò)增引物序列如seqidno.4～5所示，針對(duì)1226g>a的單堿基延伸引物序列如seqidno.6所示，針對(duì)1229c>t的單堿基延伸引物序列如seqidno.7所示，針對(duì)1174a>t的單堿基延伸引物序列如seqidno.8所示；針對(duì)1975g>c、2027t>a的擴(kuò)增引物序列如seqidno.9～10所示，針對(duì)1975g>c的單堿基延伸引物序列如seqidno.11所示，針對(duì)2027t>a的單堿基延伸引物序列如seqidno.12所示；針對(duì)2162c>t、2168a>g的擴(kuò)增引物序列如seqidno.13～14所示，針對(duì)2162c>t的單堿基延伸引物序列如seqidno.15所示，針對(duì)2168a>g的單堿基延伸引物序列如seqidno.16所示；針對(duì)919-2a>g的擴(kuò)增引物序列如seqidno.17～18所示，針對(duì)919-2a>g的單堿基延伸引物序列如seqidno.19所示；針對(duì)1707+5g>a的擴(kuò)增引物序列如seqidno.20～21所示，針對(duì)1707+5g>a的單堿基延伸引物序列如seqidno.22所示；針對(duì)281c>t的擴(kuò)增引物序列如seqidno.23～24所示，針對(duì)281c>t的單堿基延伸引物序列如seqidno.25所示；針對(duì)589g>a的擴(kuò)增引物序列如seqidno.26～27所示，針對(duì)589g>a的單堿基延伸引物序列如seqidno.28所示；針對(duì)299_300delat、235delc、176_191del16、167delt的擴(kuò)增引物序列如seqidno.29～30所示，針對(duì)299_300delat的單堿基延伸引物序列如seqidno.31所示，針對(duì)235delc的單堿基延伸引物序列如seqidno.32所示，針對(duì)176_191del16的單堿基延伸引物序列如seqidno.33所示；針對(duì)167delt的單堿基延伸引物序列如seqidno.34所示；針對(duì)109g>a的擴(kuò)增引物序列如seqidno.1～2所示，針對(duì)109g>a的單堿基延伸引物序列如seqidno.35所示；針對(duì)508_511insaacg的擴(kuò)增引物序列如seqidno.36～37所示，針對(duì)508_511insaacg的單堿基延伸引物序列如seqidno.38所示；針對(duì)1494c>t的擴(kuò)增引物序列如seqidno.39～40所示，針對(duì)1494c>t的單堿基延伸引物序列如seqidno.41所示；針對(duì)1555a>g的擴(kuò)增引物序列如seqidno.42～43所示，針對(duì)1555a>g的單堿基延伸引物序列如seqidno.44所示；針對(duì)538c>t、547g>a的擴(kuò)增引物序列如seqidno.45～46所示，針對(duì)538c>t的單堿基延伸引物序列如seqidno.47所示，針對(duì)547g>a的單堿基延伸引物序列如seqidno.48所示。在本發(fā)明的具體實(shí)施方式中，還使用普通方法設(shè)計(jì)了35delg的單堿基延伸引物序列如seqidno.49所示，通過與改進(jìn)后的引物(seqidno.3)進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)改進(jìn)后的引物具有能在較低的濃度產(chǎn)生較明顯的峰值，具有較高的結(jié)合特性。在本發(fā)明中，pcr擴(kuò)增引物為根據(jù)所選擇的待檢測(cè)的耳聾易感基因設(shè)計(jì)的特異性針對(duì)每種耳聾易感基因的引物，所述擴(kuò)增引物可擴(kuò)增包括突變位點(diǎn)在內(nèi)的一段dna序列，由5’端的tag序列和針對(duì)目標(biāo)區(qū)域的特異性引物序列組成，5’端tag序列優(yōu)選5-15個(gè)堿基。優(yōu)選的，tag序列選用序列acgttggatg。本發(fā)明采用多重pcr-單堿基延伸反應(yīng)-質(zhì)譜檢測(cè)相結(jié)合的方法檢測(cè)耳聾基因多態(tài)性位點(diǎn)的基因型。多重pcr即是在同一pcr反應(yīng)體系中加入2對(duì)或2對(duì)以上引物，同時(shí)擴(kuò)增出多個(gè)核酸片段的pcr反應(yīng)，其反應(yīng)原理、反應(yīng)試劑和操作過程與一般pcr相同。自1988年將多重pcr技術(shù)首先用以診斷杜氏肌營養(yǎng)不良征(dmd)以來，在許多相關(guān)領(lǐng)域尤其是核酸診斷方面，得到了廣泛深入的研究及應(yīng)用。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步發(fā)展了諸如巢式多重pcr、熒光定量多重pcr、差異顯示多重pcr等系列相關(guān)技術(shù)。由于多重pcr實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)較單一pcr要復(fù)雜得多，技術(shù)難度大，因而在建立多重pcr反應(yīng)體系時(shí)，必須對(duì)其中的主要成分和反應(yīng)條件進(jìn)行繁瑣的優(yōu)化。影響多重pcr擴(kuò)增效果的因素主要可分反應(yīng)體系和反應(yīng)條件二大類，其中反應(yīng)體系包括引物、緩沖液、模板和taqdna聚合酶、dntp和mg2+等，反應(yīng)條件包括退火溫度、循環(huán)數(shù)、輔助劑等。多重pcr反應(yīng)的優(yōu)化要比常規(guī)pcr復(fù)雜，通常情況是先進(jìn)行單一的pcr反應(yīng)，分別設(shè)定各引物對(duì)的最佳反應(yīng)條件，然后選擇公共的反應(yīng)條件進(jìn)行2重、3重……設(shè)定，在此過程中不斷調(diào)整反應(yīng)條件，直至所有的引物都能同時(shí)在這一條件下正確擴(kuò)增?；|(zhì)輔助激光解吸/離子化飛行時(shí)間質(zhì)譜(maldi-tofms)利用過量的低分子量有機(jī)酸作為基質(zhì)吸收激光能量，再將能量傳給分析的樣本，基質(zhì)-樣本之間發(fā)生電荷轉(zhuǎn)移使樣本氣化、離子化，從而形成單個(gè)負(fù)離子或正離子，離子在電場(chǎng)作用下，飛過自由漂移區(qū)到達(dá)質(zhì)譜儀，根據(jù)到達(dá)檢測(cè)器的飛行時(shí)間不同而被檢測(cè)，即質(zhì)譜儀根據(jù)樣本的質(zhì)荷比來檢測(cè)離子，并測(cè)得樣品的分子量。由于質(zhì)譜技術(shù)與多引物擴(kuò)增技術(shù)和單堿基延伸技術(shù)結(jié)合使用，可以在一個(gè)反應(yīng)體系中同時(shí)檢測(cè)多個(gè)突變位點(diǎn)，大大減輕了工作量，提高了檢測(cè)通量，并降低了檢測(cè)費(fèi)用。在本發(fā)明中，遺傳性耳聾基因檢測(cè)產(chǎn)品的樣本包括(但不限于)胎兒羊水、人外周血樣本、臍血、口腔拭子等。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和有益效果：本發(fā)明提供了一種低gc含量的引物，使用該引物可以解決因gc含量高而引起的引物非特異性結(jié)合的問題。本發(fā)明提供了一種設(shè)計(jì)引物的方法，該方法為將第三或第四個(gè)連續(xù)的g/c替換為a/t，并同時(shí)保證3’端有2～3個(gè)左右堿基與模板鏈互補(bǔ)配對(duì)。本發(fā)明提供了一種檢測(cè)遺傳性耳聾基因的試劑盒，包括高效特異性的擴(kuò)增引物和單堿基延伸引物，這些擴(kuò)增引物和延伸引物經(jīng)過精心設(shè)計(jì)，檢測(cè)準(zhǔn)確性和靈敏度高；在位置比較接近的snp位點(diǎn)，設(shè)計(jì)一對(duì)引物，提高了擴(kuò)增效率，降低了成本。本發(fā)明的試劑盒可以一次性檢測(cè)遺傳性耳聾基因上的多個(gè)snp位點(diǎn)，多個(gè)snp位點(diǎn)的檢測(cè)在同一管中完成，檢測(cè)時(shí)間短，操作簡單，成本低，便于耳聾基因篩查的推廣。附圖說明圖1是采用新引物檢測(cè)樣本中35delg的質(zhì)譜峰圖，其中，圖a是采用1倍引物用量檢測(cè)樣本1的質(zhì)譜峰圖，圖b是采用1倍引物用量檢測(cè)樣本2的質(zhì)譜峰圖。圖2是采用常規(guī)引物檢測(cè)樣本中35delg的質(zhì)譜峰圖，其中，圖a是采用1倍用量引物檢測(cè)樣本1的質(zhì)譜峰圖，圖b是采用1倍引物用量檢測(cè)樣本2的質(zhì)譜峰圖，圖c是采用5倍引物用量檢測(cè)樣本1的質(zhì)譜峰圖，圖d是采用5倍引物用量檢測(cè)樣本2的質(zhì)譜峰圖。圖3是采用一代測(cè)序檢測(cè)樣本中35delg的質(zhì)譜峰圖，其中，圖a是樣本1的質(zhì)譜峰圖，圖b是樣本2的質(zhì)譜峰圖。具體實(shí)施方式下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。以下實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如sambrook等人，分子克?。簩?shí)驗(yàn)室手冊(cè)(newyork:coldspringharborlaboratorypress,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例11、多態(tài)位點(diǎn)的選擇本發(fā)明選擇的多態(tài)性位點(diǎn)均具有很高的多態(tài)性信息含量，包含中國人群中耳聾基因熱點(diǎn)突變位點(diǎn)，整體上使單倍型多樣性大大提升。通過大規(guī)模的測(cè)序篩查，以及現(xiàn)有技術(shù)中報(bào)道的耳聾致病基因在中國人群中的多態(tài)性調(diào)查和文獻(xiàn)研究，入選本發(fā)明的22個(gè)位點(diǎn)見表1。表1本發(fā)明涉及的所有20個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)2、樣本的采集在被檢測(cè)者知情同意的情況下，使用血斑采集卡收集35delg陽性和陰性的樣本2例，晾干備用。3、樣本的檢測(cè)(1)針對(duì)選定的耳聾基因的snp位點(diǎn)，通過引物的設(shè)計(jì)原則與實(shí)際情況結(jié)合，設(shè)計(jì)對(duì)應(yīng)區(qū)域特異性的擴(kuò)增引物和位點(diǎn)特異性的單堿基延伸引物，并在擴(kuò)增引物5’端增加通用tag序列。本發(fā)明設(shè)計(jì)了大量檢測(cè)遺傳性耳聾基因突變的相關(guān)位點(diǎn)的引物，然后通過大量的實(shí)驗(yàn)篩選出特異性強(qiáng)、靈敏度高的引物，最終篩選出相關(guān)dna突變效果最佳的引物，引物序列如下：針對(duì)35delg的引物序列：正向引物序列：acgttggatgtcttttccagagcaaaccgc(seqidno.1)，反向引物序列：acgttggatgacaaagtcggcctgctcatc(seqidno.2)，單堿基延伸引物序列：tgcagacgatcctgaggg(seqidno.3)，單堿基延伸引物序列：tgcagacgatcctggggg(seqidno.49)；針對(duì)1226g>a、1229c>t、1174a>t的引物序列：正向引物序列：acgttggatgctgttgttcctacctgtgtc(seqidno.4)，反向引物序列：acgttggatggtaggatcgttgtcatccag(seqidno.5)，1226g>a的單堿基延伸引物序列：caccactgctctttccc(seqidno.6)，1229c>t的單堿基延伸引物序列：ctcctggacggcc(seqidno.7)，1174a>t的單堿基延伸引物序列：ttgcctttgggatcagc(seqidno.8)；針對(duì)1975g>c、2027t>a的引物序列：正向引物序列：acgttggatgcagaaaaccagaaccttacc(seqidno.9)，反向引物序列：acgttggatgacgttcccaaagtgccaatc(seqidno.10)，1975g>c的單堿基延伸引物序列：gtgccaatccatagcctt(seqidno.11)，2027t>a的單堿基延伸引物序列：agaaccttaccacccgc(seqidno.12)；針對(duì)2162c>t、2168a>g的引物序列：正向引物序列：acgttggatgccctcttgagatttcacttg(seqidno.13)，反向引物序列：acgttggatgaatgcgggttctttgacgac(seqidno.14)，2162c>t的單堿基延伸引物序列：aaggacacattctttttga(seqidno.15)，2168a>g的單堿基延伸引物序列：ctgtagatagagtatagcatca(seqidno.16)；針對(duì)919-2a>g的引物序列：正向引物序列：acgttggatgatttggttgacaaacaagg(seqidno.17)，反向引物序列：acgttggatgggctccatatgaaatggcag(seqidno.18)，單堿基延伸引物序列：ggcagtagcaattatcgtc(seqidno.19)；針對(duì)1707+5g>a的引物序列：正向引物序列：acgttggatggaagtctcaaaagaggttag(seqidno.20)，反向引物序列：acgttggatgttctatggcaatgtcgatgg(seqidno.21)，單堿基延伸引物序列：aatgtatcaagtccacagtaa(seqidno.22)；針對(duì)281c>t引物序列：正向引物序列：acgttggatgcaacatcttaccttgcagcg(seqidno.23)，反向引物序列：acgttggatgataccgagtcaaggaatggc(seqidno.24)，單堿基延伸引物序列：gaagtcatttcgggagttagta(seqidno.25)；針對(duì)589g>a的引物序列：正向引物序列：acgttggatgacagctagagtcctgattgc(seqidno.26)，反向引物序列：acgttggatgcttgtaagttcattacctg(seqidno.27)，單堿基延伸引物序列：gtaagttcattacctgtataattc(seqidno.28)；針對(duì)299_300delat、235delc、176_191del16、167delt的引物序列：正向引物序列：acgttggatgtgatctcctcgatgtcctta(seqidno.29)，反向引物序列：acgttggatgaggccgactttgtctgcaac(seqidno.30)，299_300delat的單堿基延伸引物序列：tgatgaacttcctcttcttctc(seqidno.31)，235delc的單堿基延伸引物序列：cgaagatcagctgcagg(seqidno.32)，176_191del16的單堿基延伸引物序列：gggaagtagtgatcgtagc(seqidno.33)167delt的單堿基延伸引物序列：cgactttgtctgcaacaccc(seqidno.34)；針對(duì)109g>a的引物序列：正向引物序列：acgttggatgtcttttccagagcaaaccgc(seqidno.1)，反向引物序列：acgttggatgacaaagtcggcctgctcatc(seqidno.2)，單堿基延伸引物序列：acaactcctttgcagccacaa(seqidno.35)；針對(duì)508_511insaacg的引物序列：正向引物序列：acgttggatgatgtcatgtacgacggcttc(seqidno.36)，反向引物序列：acgttggatgaagcagtccacagtgttggg(seqidno.37)，單堿基延伸引物序列：agtgttgggacaaggccaggcgtt(seqidno.38)；針對(duì)1494c>t的引物序列：正向引物序列：acgttggatgagttgaacagggccctgaag(seqidno.39)，反向引物序列：acgttggatgcctctatataaatgcgtaggg(seqidno.40)，單堿基延伸引物序列：ctactttgaagtatacttgaggag(seqidno.41)；針對(duì)1555a>g的引物序列：正向引物序列：acgttggatgcactttccagtacacttacc(seqidno.42)，反向引物序列：acgttggatgaccctcctcaagtatacttc(seqidno.43)，單堿基延伸引物序列：aacccctacgcatttatatagaggag(seqidno.44)；針對(duì)538c>t、547g>a的引物序列：正向引物序列：acgttggatgatggtgagtacgatgcagac(seqidno.45)，反向引物序列：acgttggatgctggtgcagtgtgccaacgt(seqidno.46)，538c>t的單堿基延伸引物序列：cgtggactgctacattgcc(seqidno.47)，547g>a的單堿基延伸引物序列：ggtaggtgaagattttcttct(seqidno.48).(2)實(shí)驗(yàn)步驟a.樣品dna的提取(使用tiangen血斑dna提取試劑盒提取dna)1)向樣品中分別加入200μl緩沖液ga和20μl蛋白酶k，渦旋震蕩10s混勻后，放入預(yù)熱至56℃的恒溫震蕩器中，900rpm恒溫震蕩1h。2)短暫離心后，加入200μl緩沖液gb，震蕩10s充分混勻。將離心管放入預(yù)熱至70℃的恒溫震蕩器中，900rpm恒溫震蕩10min。3)短暫離心后，加入100μl無水乙醇，充分顛倒混勻。4)將盡可能多的裂解液轉(zhuǎn)移到對(duì)應(yīng)放置的離心柱中(已標(biāo)記樣本編號(hào))。轉(zhuǎn)移后的原離心管蓋好蓋子暫放回原位，不可立即丟棄。全部樣本轉(zhuǎn)移完畢，核對(duì)對(duì)應(yīng)位置的離心柱和原離心管編號(hào)是否一致，確保分柱準(zhǔn)確無誤。5)短暫離心后，將離心管中的所得溶液和絮狀沉淀全部加入吸附柱中，12,000rpm離心30s。棄廢液，將吸附柱放回收集管中。6)向吸附柱中加入500μl緩沖液gd，12,000rpm離心30s，棄廢液，將吸附柱放回收集管中。7)加入700μl漂洗液pw，12,000rpm離心30s，棄廢液，將吸附柱放回收集管中。8)加入500μl漂洗液pw，12,000rpm離心30s，棄廢液，最后12,000rpm離心2min。9)將吸附柱置于新的1.5ml離心管(標(biāo)記樣品編號(hào))中，室溫放置5min，向膜中央加入50μltb緩沖液。室溫放置5min，之后12,000rpm離心2min，收集dna溶液，-20℃保存dna備用。b.多重pcr反應(yīng)1)pcr反應(yīng)體系配制pcr反應(yīng)體系按照表2進(jìn)行配制，然后每孔加入3μl，將pcr反應(yīng)mix分加到384孔板的樣本孔中。表2多重pcr擴(kuò)增反應(yīng)體系2)將配制好的pcr反應(yīng)體系上pcr儀進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)條件如表3所示。表3多重pcr擴(kuò)增反應(yīng)條件c.pcr產(chǎn)物處理通過sap酶處理pcr產(chǎn)物，sap酶處理體系按照表4進(jìn)行配制，然后按照每孔2μl，將反應(yīng)體系加到pcr產(chǎn)物中(注意：pcr產(chǎn)物使用前請(qǐng)輕微震蕩離心)，然后瞬時(shí)離心并按照表4中的反應(yīng)程序進(jìn)行反應(yīng)。表4sap反應(yīng)體系及反應(yīng)條件d.延伸反應(yīng)延伸反應(yīng)體系按照表5進(jìn)行配制，然后按照每孔2μl，將延伸反應(yīng)體系加到經(jīng)sap處理的產(chǎn)物中(注意：處理產(chǎn)物使用前請(qǐng)輕微震蕩離心)，然后瞬時(shí)離心并按照表6中的反應(yīng)程序進(jìn)行反應(yīng)。表5延伸反應(yīng)體系成分終濃度試劑體積(μl)nanopureh2o0.619iplexgoldbuffer0.222×0.2iplexterminationmix1×0.2延伸引物混合物0.94iplexenzyme1×0.041總體積(μl)2表6延伸反應(yīng)條件e.延伸產(chǎn)物純化(樹脂脫鹽處理)1)每反應(yīng)孔添加潔凈樹脂(resin)6mg和16μlddh2o。2)用膜把板封好，放在旋轉(zhuǎn)器上顛倒搖勻15min，以3200g(標(biāo)準(zhǔn)板離心機(jī)的2000rpm)將板離心5min。f.上機(jī)檢測(cè)1)使用基納公司massarraytmrs1000點(diǎn)樣儀轉(zhuǎn)移至檢測(cè)芯片。2)使用基納公司massarraytm分析儀進(jìn)行檢測(cè)。4、使用基因檢測(cè)金標(biāo)準(zhǔn)一代測(cè)序法對(duì)樣本1和2進(jìn)行檢測(cè)。5、結(jié)果結(jié)果如圖1-3所示，使用新引物檢測(cè)與基因檢測(cè)金標(biāo)準(zhǔn)一代測(cè)序結(jié)果一致。使用普通方法設(shè)計(jì)的常規(guī)引物(seqidno.49)特異性較差，在正常用量的情況下，產(chǎn)物峰較低，增加至5倍使用量后，效果明顯改善；而改進(jìn)后的引物(seqidno.3)則具有較好的特異性，正常用量就具有較明顯的產(chǎn)物峰。實(shí)施例2一種遺傳性耳聾基因檢測(cè)試劑盒根據(jù)snp位點(diǎn)與遺傳性耳聾的相關(guān)性，本發(fā)明提供了一種基于檢測(cè)snp位點(diǎn)的基因型來診斷耳聾的試劑盒，試劑盒組分包括多重pcr反應(yīng)體系、sap酶處理體系、單堿基延伸反應(yīng)體系、dna提取試劑、陰性質(zhì)控品，陽性質(zhì)控品，純化樹脂，質(zhì)譜檢測(cè)芯片、使用說明書或標(biāo)簽。多重pcr體系包括pcr擴(kuò)增引物、pcr緩沖液、25mmdntps、25mmmgcl2、5u/μlpcr酶，pcr擴(kuò)增引物序列如seqidno.1～2、seqidno.4～5、seqidno.9～10、seqidno.13～14、seqidno.17～18、seqidno.20～21、seqidno.23～24、seqidno.26～27、seqidno.29～30、seqidno.36～37、seqidno.39～40、seqidno.42～43、seqidno.45～46所示；sap酶處理體系包括sap緩沖液、sap酶；單堿基延伸反應(yīng)體系包括單堿基延伸引物、iplex緩沖液、iplex終止混合物、iplex酶，單堿基延伸引物序列如seqidno.3、seqidno.6～8、seqidno.11～12、seqidno.15～16、seqidno.19、seqidno.22、seqidno.25、seqidno.28、seqidno.31～35、seqidno.38、seqidno.41、seqidno.44、seqidno.47～48所示；dna提取試劑包括提取緩沖液、蛋白酶、漂洗液。實(shí)施例3一種遺傳性耳聾基因檢測(cè)試劑盒根據(jù)snp位點(diǎn)與遺傳性耳聾的相關(guān)性，本發(fā)明提供了一種基于檢測(cè)snp位點(diǎn)的基因型來診斷耳聾的試劑盒，試劑盒組分包括多重pcr反應(yīng)體系、sap酶處理體系、單堿基延伸反應(yīng)體系、dna提取試劑、陰性質(zhì)控品，陽性質(zhì)控品，純化樹脂，質(zhì)譜檢測(cè)芯片、使用說明書或標(biāo)簽。多重pcr體系包括pcr擴(kuò)增引物、pcr緩沖液、25mmdntps、25mmmgcl2、5u/μlpcr酶，pcr擴(kuò)增引物序列如seqidno.1～2、seqidno.4～5、seqidno.9～10、seqidno.13～14、seqidno.17～18、seqidno.20～21、seqidno.23～24、seqidno.26～27、seqidno.29～30、seqidno.36～37、seqidno.39～40、seqidno.42～43；sap酶處理體系包括sap緩沖液、sap酶；單堿基延伸反應(yīng)體系包括單堿基延伸引物、iplex緩沖液、iplex終止混合物、iplex酶，單堿基延伸引物序列如seqidno.3、seqidno.6～8、seqidno.11～12、seqidno.15～16、seqidno.19、seqidno.22、seqidno.25、seqidno.28、seqidno.31～35、seqidno.38、seqidno.41、seqidno.44所示；dna提取試劑包括提取緩沖液、蛋白酶、漂洗液。上述實(shí)施例的說明只是用于理解本發(fā)明的方法及其核心思想。應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行若干改進(jìn)和修飾，這些改進(jìn)和修飾也將落入本發(fā)明權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)。sequencelisting<110>北京博奧醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所有限公司<120>一種檢測(cè)耳聾基因的引物及其應(yīng)用<160>49<170>patentinversion3.5<210>1<211>30<212>dna<213>人工序列<400>1acgttggatgtcttttccagagcaaaccgc30<210>2<211>30<212>dna<213>人工序列<400>2acgttggatgacaaagtcggcctgctcatc30<210>3<211>18<212>dna<213>人工序列<400>3tgcagacgatcctgaggg18<210>4<211>30<212>dna<213>人工序列<400>4acgttggatgctgttgttcctacctgtgtc30<210>5<211>30<212>dna<213>人工序列<400>5acgttggatggtaggatcgttgtcatccag30<210>6<211>17<212>dna<213>人工序列<400>6caccactgctctttccc17<210>7<211>13<212>dna<213>人工序列<400>7ctcctggacggcc13<210>8<211>17<212>dna<213>人工序列<400>8ttgcctttgggatcagc17<210>9<211>30<212>dna<213>人工序列<400>9acgttggatgcagaaaaccagaaccttacc30<210>10<211>30<212>dna<213>人工序列<400>10acgttggatgacgttcccaaagtgccaatc30<210>11<211>18<212>dna<213>人工序列<400>11gtgccaatccatagcctt18<210>12<211>17<212>dna<213>人工序列<400>12agaaccttaccacccgc17<210>13<211>30<212>dna<213>人工序列<400>13acgttggatgccctcttgagatttcacttg30<210>14<211>30<212>dna<213>人工序列<400>14acgttggatgaatgcgggttctttgacgac30<210>15<211>19<212>dna<213>人工序列<400>15aaggacacattctttttga19<210>16<211>22<212>dna<213>人工序列<400>16ctgtagatagagtatagcatca22<210>17<211>29<212>dna<213>人工序列<400>17acgttggatgatttggttgacaaacaagg29<210>18<211>30<212>dna<213>人工序列<400>18acgttggatgggctccatatgaaatggcag30<210>19<211>19<212>dna<213>人工序列<400>19ggcagtagcaattatcgtc19<210>20<211>30<212>dna<213>人工序列<400>20acgttggatggaagtctcaaaagaggttag30<210>21<211>30<212>dna<213>人工序列<400>21acgttggatgttctatggcaatgtcgatgg30<210>22<211>21<212>dna<213>人工序列<400>22aatgtatcaagtccacagtaa21<210>23<211>30<212>dna<213>人工序列<400>23acgttggatgcaacatcttaccttgcagcg30<210>24<211>30<212>dna<213>人工序列<400>24acgttggatgataccgagtcaaggaatggc30<210>25<211>22<212>dna<213>人工序列<400>25gaagtcatttcgggagttagta22<210>26<211>30<212>dna<213>人工序列<400>26acgttggatgacagctagagtcctgattgc30<210>27<211>29<212>dna<213>人工序列<400>27acgttggatgcttgtaagttcattacctg29<210>28<211>24<212>dna<213>人工序列<400>28gtaagttcattacctgtataattc24<210>29<211>30<212>dna<213>人工序列<400>29acgttggatgtgatctcctcgatgtcctta30<210>30<211>30<212>dna<213>人工序列<400>30acgttggatgaggccgactttgtctgcaac30<210>31<211>22<212>dna<213>人工序列<400>31tgatgaacttcctcttcttctc22<210>32<211>17<212>dna<213>人工序列<400>32cgaagatcagctgcagg17<210>33<211>19<212>dna<213>人工序列<400>33gggaagtagtgatcgtagc19<210>34<211>20<212>dna<213>人工序列<400>34cgactttgtctgcaacaccc20<210>35<211>21<212>dna<213>人工序列<400>35acaactcctttgcagccacaa21<210>36<211>30<212>dna<213>人工序列<400>36acgttggatgatgtcatgtacgacggcttc30<210>37<211>30<212>dna<213>人工序列<400>37acgttggatgaagcagtccacagtgttggg30<210>38<211>24<212>dna<213>人工序列<400>38agtgttgggacaaggccaggcgtt24<210>39<211>30<212>dna<213>人工序列<400>39acgttggatgagttgaacagggccctgaag30<210>40<211>31<212>dna<213>人工序列<400>40acgttggatgcctctatataaatgcgtaggg31<210>41<211>24<212>dna<213>人工序列<400>41ctactttgaagtatacttgaggag24<210>42<211>30<212>dna<213>人工序列<400>42acgttggatgcactttccagtacacttacc30<210>43<211>30<212>dna<213>人工序列<400>43acgttggatgaccctcctcaagtatacttc30<210>44<211>26<212>dna<213>人工序列<400>44aacccctacgcatttatatagaggag26<210>45<211>30<212>dna<213>人工序列<400>45acgttggatgatggtgagtacgatgcagac30<210>46<211>30<212>dna<213>人工序列<400>46acgttggatgctggtgcagtgtgccaacgt30<210>47<211>19<212>dna<213>人工序列<400>47cgtggactgctacattgcc19<210>48<211>21<212>dna<213>人工序列<400>48ggtaggtgaagattttcttct21<210>49<211>18<212>dna<213>人工序列<400>49tgcagacgatcctggggg18當(dāng)前第1頁12