本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種乙烯基改性魚鱗蛋白膜及其制備方法。
背景技術(shù)：
目前，膠原蛋白生產(chǎn)提取的主要來源于三類物質(zhì)：骨膠原、深海魚魚皮、魚鱗。其中骨膠原主要來自豬、牛、羊等動(dòng)物，原料易獲取，原料源穩(wěn)定，但是動(dòng)物骨提取的骨膠原含有較多脂肪，骨膠原純度稍低，美容性能稍差，并且由于宗教和動(dòng)物疾病的原因，動(dòng)物骨膠原的市場(chǎng)份額已經(jīng)越來越小。相對(duì)于骨膠原，魚皮膠原，魚鱗膠原兼具二者的優(yōu)勢(shì)；并且通過檢測(cè)，魚鱗膠原蛋白的羥脯氨酸含量高于其他原料，由于魚鱗中膠原蛋白與人皮膚膠原的結(jié)構(gòu)相似，兼容性好，由魚鱗制備的膠原蛋白產(chǎn)品，更容易被皮膚吸收。
對(duì)于膠原蛋白膜，國內(nèi)和國外的成型方法有很多種。國內(nèi)的大部分研究都采用澆鑄成膜的方法，而國外則較多采用機(jī)械擠出的方法。馬春輝等研究認(rèn)為，較為理想的制備膠原蛋白膜的工藝條件為：配制4.5％的膠原蛋白溶→依次加入0.4％淀粉、0.25％戊二醛、0.25％增塑劑增稠→真空脫氣→涂布于光滑玻璃板上→干燥→揭膜。羅愛平等認(rèn)為，用甘油、氯化鈣作交聯(lián)劑對(duì)于增強(qiáng)膠原蛋白膜的柔韌性、機(jī)械性能更佳，制膜工藝為：12％膠原蛋白溶液→熱處理(70～100℃，15min)→加入甘油、鈣交聯(lián)劑→溶解、混合→過濾→增稠→真空脫氣→涂布→烘干(60～70℃，5h)→疊加類脂層→再干燥→揭膜→乙醇溶液揮發(fā)處理→自然干燥。國外與國內(nèi)的成形方法則顯著不同，其操作要點(diǎn)為：酸溶脹真皮層→研磨成漿料→過濾、均化→擠出→凝聚→鞣制→增塑→干燥→成膜。這種方法雖然賦予了膠原蛋白膜機(jī)械強(qiáng)度，但同時(shí)這種優(yōu)良機(jī)械強(qiáng)度的膠原蛋白膜制備過程相對(duì)復(fù)雜，其中需要設(shè)備也較多。盧黃華等人用草魚的魚鱗中提取膠原蛋白，采用澆注成膜法制作膠原蛋白膜，具體實(shí)施步驟為：將魚鱗膠原蛋白制成2％膠原蛋白水溶液和2％殼聚糖(脫乙酰度不小于90.0％)水溶液按不同質(zhì)量比混合均勻，同時(shí)調(diào)節(jié)成膜條件，在冷凍高速離心機(jī)中800r/min高速攪拌10min。采用傾注法將配制好并經(jīng)過真空脫氣的成膜液水平放置于塑料圓盤中，經(jīng)古風(fēng)干燥后接膜即為樣品，樣品置于干燥器中保存?zhèn)溆谩Ｆ湓囼?yàn)驗(yàn)證得到：在成膜溫度為45℃，ph為5、膠原蛋白與殼聚糖的配比6：4時(shí)所制備的魚鱗膠膠原蛋白膜性能最好，抗張強(qiáng)度61.27mpa，斷裂伸長(zhǎng)率為5.17％。
綜上，現(xiàn)有技術(shù)中的魚鱗膠原蛋白膜的制備工藝繁瑣，成本高，而采用簡(jiǎn)單工藝制備得到的魚鱗膠膠原蛋白膜的機(jī)械性能差，不能滿足需要。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的主要目的是提供一種乙烯基改性魚鱗蛋白膜的制備方法，本發(fā)明通過紫外光照乙烯基膠原蛋白成膜，成功地制備一種機(jī)械性能優(yōu)異的膠原蛋白膜，該工藝簡(jiǎn)單、對(duì)環(huán)境無害，具有較好的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。
為解決上述問題，本發(fā)明提供了一種乙烯基改性魚鱗蛋白膜的制備方法，包括以下步驟：
(1)將魚鱗膠原蛋白溶解于酸性溶液中，得膠原蛋白溶液；
(2)在水浴條件下將甲基丙烯酸酐滴加到膠原蛋白溶液中，然后加入谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶，在50～60℃下反應(yīng)2～8h，得到乙烯基改性魚鱗蛋白乳液；
(3)向步驟(2)的乙烯基改性魚鱗蛋白乳液中加入光引發(fā)劑，在40～60℃下超聲波震蕩10～30min，混合均勻后，將溶液倒入聚四氟乙烯的模具中，放置在紫外交聯(lián)儀中，用紫外光進(jìn)行光照1～7h交聯(lián)成膜，取出自然晾干，得乙烯基改性魚鱗蛋白膜。
為了加入魚鱗膠原蛋白的溶解速率，首先將魚鱗膠原蛋白肽溶解于酸性溶液中，但是如果酸性溶液的ph值過低，則會(huì)對(duì)膠原蛋白造成破壞，為了為后續(xù)反應(yīng)提供溫和的反應(yīng)環(huán)境，優(yōu)選的，在步驟(1)中，所述酸性溶液為酸性緩沖液，所述酸性緩沖液為磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液、磷酸二氫鉀-氫氧化鈉緩沖液、鄰苯二甲酸氫鉀-氫氧化鈉緩沖液、檸檬酸-氫氧化鈉-鹽酸緩沖液、檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液、乙酸-乙酸鈉緩沖液、甘氨酸-鹽酸緩沖液、鄰苯二甲酸-鹽酸緩沖液和磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液中的一種。
根據(jù)本發(fā)明，甲基丙烯酸酐在加熱的條件下可以和膠原蛋白中的賴氨酸殘基中伯氨-nh2發(fā)生反應(yīng)生成酰胺鍵，使甲基丙烯酸酐中的c＝c引入到膠原蛋白結(jié)構(gòu)中。甲基丙烯酸酐用量的多少直接關(guān)系到接枝后c＝c雙鍵數(shù)目的多少，甲基丙烯酸酐用量太少，在膠原蛋白表面接枝形成的c＝c雙鍵數(shù)目就少，不會(huì)再膠原蛋白間形成交聯(lián)作用。一般情況下反應(yīng)時(shí)間和反應(yīng)溫度之間是有交互作用的，溫度高分子運(yùn)動(dòng)加快，反應(yīng)效率提升，反應(yīng)時(shí)間縮短；溫度低分子運(yùn)動(dòng)減慢，反應(yīng)效率降低，反應(yīng)時(shí)間增長(zhǎng)，優(yōu)選的，在步驟(2)中，所述甲基丙烯酸酐與所述膠原蛋白的質(zhì)量比為1：(2～15)；優(yōu)選為1：(5～12)。
谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶可催化蛋白質(zhì)分子內(nèi)的交聯(lián)與分子間的交聯(lián)，改善膠原蛋白的凝膠能力；優(yōu)選的，所述谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶與所述膠原蛋白的質(zhì)量比為(0.01～0.05)：1。
根據(jù)本發(fā)明，光引發(fā)劑能夠使茶氨酸與魚鱗蛋白肽在光照情況下，發(fā)生反應(yīng)，優(yōu)選的，所述光引發(fā)劑為安息香及其衍生物、2,2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮、硫雜蒽酮類、苯甲酮類等中的至少一種。
優(yōu)選的，所述光引發(fā)劑的在混合體系中的濃度為0.005～0.03％。
乙烯基改性魚鱗蛋白乳液在光引發(fā)劑的存在下能夠在紫外線下能夠發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，優(yōu)選的，在步驟(2)中，所述紫外燈的功率密度為50～100μw/cm2，紫外線的波長(zhǎng)為253.7～365nm。
所述魚鱗膠原蛋白的制備工藝，包括以下步驟：
a、取魚鱗，洗凈后，將魚鱗在含有碳酸鹽的溶液中浸泡3～5h，然后將魚鱗置于酸性溶液中，用微波處理，然后再用堿性溶液浸泡3～12h，然后洗滌至中性，過濾，得到濾液1和濾渣1；
b、將步驟a中的濾渣用酶制劑處理，洗滌過濾，得到濾液2和濾渣2；
c、將濾液1和濾液2合并，用微孔濾膜過濾，得到濾液3，對(duì)濾液3進(jìn)行噴霧干燥，得到魚鱗膠原蛋白。
根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明首先將魚鱗用碳酸鹽的溶液處理，碳酸鹽溶液能夠疏松魚鱗中致密的膠原蛋白纖維，從而方便后續(xù)處理，提高后續(xù)處理的效率，優(yōu)選的，所述含有碳酸鹽的溶液為碳酸鹽的水溶液，優(yōu)選為碳酸鈉和或碳酸鉀的水溶液。
根據(jù)本發(fā)明，在步驟a中，所述酸性溶液為ph至小于7的任何溶劑，可以為酸的水溶液、強(qiáng)酸弱堿鹽的水溶液、苯酚及其衍生物溶液，優(yōu)選為酸的水溶液，由于本發(fā)明中提取的膠原蛋白最終是制作成面膜，敷在臉上，所述酸優(yōu)選為對(duì)人體無害的酸，優(yōu)選為濃度小于0.1m鹽酸、檸檬酸、醋酸、乳酸中的至少一種。
根據(jù)本發(fā)明，微波處理能夠使膠原蛋白的三螺旋結(jié)構(gòu)被破壞，其中的氫鍵和疏水鍵斷裂，能夠增加酸溶解的效率，優(yōu)選的，在步驟a中，所述微波處理的功率為400～900w；所述微波處理的時(shí)間為0.5～15min。
優(yōu)選的，在步驟a中，所述堿性溶液為堿金屬氫氧化物和/或堿土金屬氫氧化物的水溶液。
優(yōu)選的，在步驟b中，所述酶制劑處理的具體步驟為：在步驟a中的濾渣中加15～20倍量水，調(diào)節(jié)控制ph值在6.5～7.5、溫度在45～55℃，加入酶制劑1，該酶制劑1與濾渣比例為(0.5～3.0)∶100，攪拌0.5～1.5h，保溫1～4h，然后滅活酶制劑1；控制ph值在1.0～3.0、溫度在55～70℃下加入酶制劑2，該酶制劑2與濾渣比例為(0.1～3.0)∶100，攪拌1～3h后，滅活酶制劑2。
在步驟b中，所述酶制劑1和酶制劑2各自為中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶中的至少一種。
本發(fā)明通過微孔濾膜過濾能夠除去溶液中的大分子，優(yōu)選的，在步驟c中，所述微孔濾膜為孔徑為20-50μm的混合纖維素微孔濾膜。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下技術(shù)效果：本發(fā)明通過甲基丙烯酸酐對(duì)魚鱗膠原蛋白進(jìn)行改性，形成了機(jī)械性能較好的乙烯基膠原蛋白膜，使得碳碳雙鍵接枝在膠原蛋白的分子鏈上，進(jìn)而交聯(lián)在膠原蛋白表面形成致密的結(jié)構(gòu)，提高了膠原蛋白膜的機(jī)械性能。且本發(fā)明工藝簡(jiǎn)單，改性效果好，制備的改性魚皮膠原蛋白用于食品、藥品和化妝品領(lǐng)域包裝膜的制作。
具體實(shí)施方式
為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
實(shí)施例1
本發(fā)明提供了一種乙烯基改性魚鱗蛋白膜的制備方法，包括以下步驟：
(1)將魚鱗依次用碳酸鈉溶液、磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液溶液中、氫氧化鈉溶液和酶制劑處理，將酸處理和堿處理后的加入17倍量水中，調(diào)節(jié)控制ph值在7、溫度在50℃，加入中性蛋白酶，該中性蛋白酶與濾渣比例為2.3∶100，攪拌1h，保溫2h，然后滅活中性蛋白酶；控制ph值在2、溫度在60℃下加入木瓜蛋白酶，該木瓜蛋白酶與濾渣比例為2.3∶100，攪拌2h后，滅活木瓜蛋白酶，過濾干燥后，即得到魚鱗膠原蛋白。將魚鱗膠原蛋白溶解于磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液中，得膠原蛋白溶液；
(2)在水浴條件下將甲基丙烯酸酐滴加到膠原蛋白溶液中，然后加入谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶，在55℃下反應(yīng)6h，得到乙烯基改性魚鱗蛋白乳液；
所述甲基丙烯酸酐與所述膠原蛋白的質(zhì)量比為1：10；所述谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶與所述膠原蛋白的質(zhì)量比為0.03：1；
(3)向步驟(2)的乙烯基改性魚鱗蛋白乳液中加入安息香及其衍生物光引發(fā)劑，所述安息香及其衍生物光引發(fā)劑的在混合體系中的濃度為0.009％，在50℃下超聲波震蕩20min，混合均勻后，將溶液倒入聚四氟乙烯的模具中，放置在紫外交聯(lián)儀中，用紫外光進(jìn)行光照4h交聯(lián)成膜，所述紫外燈的功率密度為60μw/cm2，紫外線的波長(zhǎng)為287.3nm，取出自然晾干，得乙烯基改性魚鱗蛋白膜。
實(shí)施例2
本發(fā)明提供了一種乙烯基改性魚鱗蛋白膜的制備方法，包括以下步驟：
(1)將魚鱗依次用碳酸鉀溶液、磷酸二氫鉀-氫氧化鈉緩沖液中、氫氧化鉀溶液和酶制劑處理，將酸處理和堿處理后的加入15倍量水中，調(diào)節(jié)控制ph值在6.5、溫度在45℃，加入木瓜蛋白酶，該木瓜蛋白酶與濾渣比例為0.6∶100，攪拌0.5h，保溫1h，然后滅活木瓜蛋白酶；控制ph值在1.0、溫度在55℃下加入胰蛋白酶，該胰蛋白酶與濾渣比例為0.4∶100，攪拌2h后，滅活胰蛋白酶，過濾干燥后，即得到魚鱗膠原蛋白。
將魚鱗膠原蛋白溶解于磷酸二氫鉀-氫氧化鈉緩沖液中，得膠原蛋白溶液；
(2)在水浴條件下將甲基丙烯酸酐滴加到膠原蛋白溶液中，然后加入谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶，在50℃下反應(yīng)2h，得到乙烯基改性魚鱗蛋白乳液；
所述甲基丙烯酸酐與所述膠原蛋白的質(zhì)量比為1：4；所述谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶與所述膠原蛋白的質(zhì)量比為0.05：1；
(3)向步驟(2)的乙烯基改性魚鱗蛋白乳液中加入光引發(fā)劑2,2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮，所述光引發(fā)劑2,2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮的在混合體系中的濃度為0.005％，在40℃下超聲波震蕩10min，混合均勻后，將溶液倒入聚四氟乙烯的模具中，放置在紫外交聯(lián)儀中，用紫外光進(jìn)行光照1h交聯(lián)成膜，所述紫外燈的功率密度為50μw/cm2，紫外線的波長(zhǎng)為253.7nm，取出自然晾干，得乙烯基改性魚鱗蛋白膜。
實(shí)施例3
本發(fā)明提供了一種乙烯基改性魚鱗蛋白膜的制備方法，包括以下步驟：
(1)將魚鱗依次用碳酸鈉溶液、檸檬酸-氫氧化鈉-鹽酸緩沖液中、氫氧化鈉溶液和酶制劑處理，將酸處理和堿處理后的加入16倍量水中，調(diào)節(jié)控制ph值在7.1、溫度在52℃，加入中性蛋白酶，該中性蛋白酶1與濾渣比例為2.4∶100，攪拌1.2h，保溫4h，然后滅活中性蛋白酶；控制ph值在2.5、溫度在60℃下加入胃蛋白酶，該胃蛋白酶與濾渣比例為1.2∶100，攪拌2h后，滅活胃蛋白酶，過濾干燥后，即得到魚鱗膠原蛋白。
將魚鱗膠原蛋白溶解于檸檬酸-氫氧化鈉-鹽酸緩沖液中，得膠原蛋白溶液；
(2)在水浴條件下將甲基丙烯酸酐滴加到膠原蛋白溶液中，然后加入谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶，在60℃下反應(yīng)4h，得到乙烯基改性魚鱗蛋白乳液；
所述甲基丙烯酸酐與所述膠原蛋白的質(zhì)量比為1：4；
(3)向步驟(2)的乙烯基改性魚鱗蛋白乳液中加入光引發(fā)劑硫雜蒽酮類，所述光引發(fā)劑硫雜蒽酮類的在混合體系中的濃度為0.03％，在60℃下超聲波震蕩30min，混合均勻后，將溶液倒入聚四氟乙烯的模具中，放置在紫外交聯(lián)儀中，用紫外光進(jìn)行光照7h交聯(lián)成膜，所述紫外燈的功率密度為100μw/cm2，紫外線的波長(zhǎng)為365nm，取出自然晾干，得乙烯基改性魚鱗蛋白膜。
實(shí)施例4
本發(fā)明提供了一種乙烯基改性魚鱗蛋白膜的制備方法，包括以下步驟：
(1)將魚鱗依次用碳酸鉀溶液、鄰苯二甲酸氫鉀-氫氧化鈉緩沖液中、氫氧化鉀溶液和酶制劑處理，將酸處理和堿處理后的加入17倍量水中，調(diào)節(jié)控制ph值在6.8、溫度在52℃，加入中性蛋白酶，該中性蛋白酶與濾渣比例為2.3∶100，攪拌1h，保溫2h，然后滅活中性蛋白酶；控制ph值在2.6、溫度在65℃下加入木瓜蛋白酶，該木瓜蛋白酶與濾渣比例為1.4∶100，攪拌2h后，滅活木瓜蛋白酶，過濾干燥后，即得到魚鱗膠原蛋白。將魚鱗膠原蛋白溶解于鄰苯二甲酸氫鉀-氫氧化鈉緩沖液中，得膠原蛋白溶液；
(2)在水浴條件下將甲基丙烯酸酐滴加到膠原蛋白溶液中，然后加入谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶，在52℃下反應(yīng)3h，得到乙烯基改性魚鱗蛋白乳液；
所述谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶與所述膠原蛋白的質(zhì)量比為0.03：1；
(3)向步驟(2)的乙烯基改性魚鱗蛋白乳液中加入硫雜蒽酮類光引發(fā)劑，所述硫雜蒽酮類光引發(fā)劑的在混合體系中的濃度為0.006％，在45℃下超聲波震蕩15min，混合均勻后，將溶液倒入聚四氟乙烯的模具中，放置在紫外交聯(lián)儀中，用紫外光進(jìn)行光照4h交聯(lián)成膜，所述紫外燈的功率密度為60μw/cm2，紫外線的波長(zhǎng)為282.3nm，取出自然晾干，得乙烯基改性魚鱗蛋白膜。
實(shí)施例5
本發(fā)明提供了一種乙烯基改性魚鱗蛋白膜的制備方法，包括以下步驟：
(1)本發(fā)明還提供了所述魚鱗膠原蛋白的制備方法為：將魚鱗依次用碳酸鈉溶液、乙酸-乙酸鈉緩沖液中、氫氧化鈉溶液和酶制劑處理，將酸處理和堿處理后的加入20倍量水中，調(diào)節(jié)控制ph值在7.2、溫度在55℃，加入木瓜蛋白酶，該木瓜蛋白酶與濾渣比例為2.8∶100，攪拌1.2h，保溫3h，然后滅活木瓜蛋白酶；控制ph值在2.0、溫度在60℃下加入胰蛋白酶，該胰蛋白酶與濾渣比例為2.5∶100，攪拌2h后，滅活胰蛋白酶，過濾干燥后，即得到魚鱗膠原蛋白。將魚鱗膠原蛋白溶解于乙酸-乙酸鈉緩沖液中，得膠原蛋白溶液；
(2)在水浴條件下將甲基丙烯酸酐滴加到膠原蛋白溶液中，然后加入谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶，在60℃下反應(yīng)8h，得到乙烯基改性魚鱗蛋白乳液；
所述甲基丙烯酸酐與所述膠原蛋白的質(zhì)量比為1：10；和所述谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶與所述膠原蛋白的質(zhì)量比為0.05：1；
(3)向步驟(2)的乙烯基改性魚鱗蛋白乳液中加入光引發(fā)劑安息香及其衍生物，所述光引發(fā)劑安息香及其衍生物的在混合體系中的濃度為0.02％，在55℃下超聲波震蕩20min，混合均勻后，將溶液倒入聚四氟乙烯的模具中，放置在紫外交聯(lián)儀中，用紫外光進(jìn)行光照4h交聯(lián)成膜，所述紫外燈的功率密度為60μw/cm2，紫外線的波長(zhǎng)為324.5nm，取出自然晾干，得乙烯基改性魚鱗蛋白膜。
上述描述僅是對(duì)本發(fā)明部分實(shí)施例的描述，并非對(duì)本發(fā)明范圍的任何限定，本行業(yè)的普通技術(shù)人員可根據(jù)本發(fā)明對(duì)上述實(shí)施例做出改進(jìn)或修改，但均屬于本發(fā)明保護(hù)范圍。