本發(fā)明涉及一種魚鱗膠原蛋白水解肽的制備方法。(二)
背景技術：
：1.魚鱗的組織成分魚鱗，簡而言之就是魚身上的鱗片，一般不食用。在日常生活中，通常將魚鱗刮下當廢棄物丟掉。魚鱗既是魚的真皮層變形物，又是魚體與外界接觸的邊緣組織。魚鱗作為一種特殊骨質(zhì)衍生物是魚類真皮層膠原質(zhì)經(jīng)長期進化而形成的。羥基磷灰石和蛋白質(zhì)排列成有規(guī)律的空間結構，是魚鱗的主要組成成分。魚鱗膠原蛋白質(zhì)約占魚鱗總重量的50％～70％，其中以膠原蛋白和魚鱗硬蛋白為主。因此，魚鱗中豐富的膠原蛋白為其提供了開發(fā)利用的資源。2.魚鱗的利用現(xiàn)狀中國是世界最大的淡水魚養(yǎng)殖國，而且是唯一養(yǎng)殖量大于捕撈量的國家。其中，養(yǎng)殖草魚的產(chǎn)量最多，占世界養(yǎng)殖總產(chǎn)量的90％以上。魚鱗作為魚產(chǎn)品加工過程中產(chǎn)生的下腳料之一，雖然含有豐富的蛋白質(zhì)，但受技術、觀念的限制，尚未得到充分利用，其中大部分被當做廢棄物扔掉，造成了環(huán)境污染和資源浪費。目前，魚鱗作為水產(chǎn)品加工過程中產(chǎn)生的廢棄物，還未得到有效利用。迄今為止，世界上對魚鱗的研究與利用主要包括以下幾個方面：提取魚鱗膠原蛋白；制備魚鱗膠原肽；提取卵磷脂；制備羥基磷灰石等。但上述制備工藝還不成熟，尚未形成完整的廢物利用體系。3.魚鱗膠原蛋白肽隨著世界水產(chǎn)行業(yè)的發(fā)展，水產(chǎn)加工業(yè)越來越受到人們關注，加工同時產(chǎn)生大量下腳料，為魚體重的30％～50％，這其中有5％約為魚鱗。這些魚鱗目前主要作為廢棄物丟棄，其中一小部分作為提取膠原蛋白的原料加以利用。魚鱗加工下腳料的主要成分為蛋白質(zhì)，大約占魚鱗總質(zhì)量的70％，主要包括膠原蛋白和魚鱗硬蛋白。膠原蛋白在蛋白質(zhì)中比重約為25％～30％，既是動物結締組織中的主要成分，也是哺乳動物體內(nèi)含量最多、分布最廣的功能性蛋白。膠原蛋白在細胞間信息的傳遞、組織的形成、成熟、以及傷口愈合、鈣化作用關節(jié)潤滑、血液凝固、和衰老等過程中也起到一定的作用。膠原蛋白作為生物科技產(chǎn)業(yè)最具關鍵性的原材料之一，在醫(yī)學材料、化妝品、食品工業(yè)等領域均有著廣泛應用。動物結締組織中的膠原蛋白經(jīng)適度水解后得到膠原肽。膠原肽具有良好的膠凝性、乳化性、增稠性和成膜性等功能特性，現(xiàn)已在食品、化妝品及醫(yī)藥行業(yè)中得到廣泛應用。2006年世界膠原肽的產(chǎn)量已達20萬噸，其中，豬、牛等哺乳動物的皮和骨作為主要生產(chǎn)原料。但隨著世界各國相繼出現(xiàn)的瘋牛病、口蹄疫等疾病，從水產(chǎn)品中獲得膠原蛋白肽被提上議程。目前，國內(nèi)外對于魚膠原肽的研究，主要有ACE抑制肽、抗氧化肽、促進學習記憶活性肽、抗冷凍肽等。我國淡水魚資源豐富，經(jīng)水產(chǎn)加工后每年可產(chǎn)生魚鱗65萬噸，其中我國每年魚鱗廢棄達30萬噸左右。草魚，是我國“四大家魚”之一，其養(yǎng)殖產(chǎn)量、消費量和產(chǎn)值均居淡水魚首位。草魚魚鱗約占魚體重3％～5％左右，計算下來每年大約可生產(chǎn)15.8萬噸魚鱗。我國雖然魚鱗資源豐富，但魚鱗加工企業(yè)存在規(guī)模小、分散的問題，所以我國對魚鱗的研究與開發(fā)利用相對滯后世界水平。糖尿病己經(jīng)成為世界上繼心腦血管疾病、惡性腫瘤之后第三位嚴重危害人類健康的慢性疾病，其中2型糖尿病(type2diabetesmellitus，T2DM)占糖尿病總發(fā)病率的90％～95％，是臨床上最常見的代謝紊亂疾病，因其患病率高、患者數(shù)多，且呈逐年增長趨勢，對人群健康構成嚴重威脅，已成為全球性的重要公共衛(wèi)生問題。臨床上α-葡萄糖苷酶抑制劑是治療糖尿病的主要手段之一，其中α-葡萄糖苷酶(EC3.2.1.20，α-glucosidase)是一種存在小腸絨毛粘膜細胞刷狀緣的酶類，通過水解α-1,4糖苷鍵，可以從淀粉和其它有關多糖的非還原端水解葡萄糖，人體對攝入的淀粉、蔗糖等碳水化合物的吸收利用，依賴于小腸內(nèi)該酶的活性。α-淀粉酶屬α-葡萄糖苷酶，是人體中碳水化合物轉(zhuǎn)化的關鍵酶之一，能催化α-1,4-糖苷鍵水解，人體對淀粉、糊精等碳水化合物的吸收依賴于小腸刷狀緣上該類酶的活性。研究發(fā)現(xiàn)，α-淀粉酶抑制劑對腸道內(nèi)唾液及胰α-淀粉酶的活性具有抑制效果，遏制食物中淀粉及其他碳水化合物的轉(zhuǎn)化利用，因此具有降低血糖的效果。而α-葡萄糖苷酶抑制劑可通過催化葡萄糖降解，來延緩葡萄糖的消化吸收，降低餐后血糖。鑒于此，以草魚魚鱗為研究對象，旨在研究草魚魚鱗中蛋白水解肽中具有抑制α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的降糖肽的制備工藝，為魚鱗進一步開發(fā)利用提供途徑，變廢為寶。(三)技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一種安全性好、易吸收，并且提取得率高，對α-葡萄糖苷酶與α-淀粉酶均有明顯抑制效果的魚鱗膠原蛋白水解肽的制備方法。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術方案：一種魚鱗膠原蛋白水解肽的制備方法，所述的制備方法按如下步驟進行：(1)原料預處理：將廢棄的魚鱗進行沖洗、浸泡、除雜，備用；(2)制備魚鱗粉：一次浸石灰水：取經(jīng)過步驟(1)預處理的魚鱗，以料液質(zhì)量比1：2～4浸于0.2wt％～0.4wt％石灰水中，在pH值為12～12.5、溫度為10～20℃下浸泡7～10天，期間更換新鮮的石灰水4～5次；浸堿處理：將一次浸石灰水后的魚鱗用清水洗滌干凈，以料液質(zhì)量比1：20～30投入1wt％～3wt％氫氧化鈉溶液中浸泡12～24h，然后倒去堿液，取出魚鱗，用清水沖洗、浸泡，直至堿液完全除去；浸酸處理：將浸堿處理后的魚鱗以料液質(zhì)量比1：20～30浸于1wt％～3wt％鹽酸溶液中，攪拌并用pH計監(jiān)測pH值，當鹽酸用盡時更換新鹽酸溶液，直至pH值保持在3～4之間并不再波動，然后倒去酸液，取出魚鱗，用清水沖洗至pH值為6～7；二次浸石灰水：將浸酸處理后的魚鱗以料液質(zhì)量比1：3～5浸于0.2wt％～0.4wt％石灰水中7～10天，且每隔3～5天更換一次新鮮的石灰水，浸石灰水完畢之后，取出魚鱗先用清水沖洗，再用pH值3～4的稀鹽酸溶液浸泡4～6h將石灰水完全除去，最后用清水洗滌使pH值為6～7，干燥后粉碎，得到魚鱗粉(40～300目，優(yōu)選200目)；(3)酶法提取魚鱗膠原蛋白：將步驟(2)所得魚鱗粉以料液質(zhì)量比1：10～40(優(yōu)選1：30～40)與去離子水混合，然后加入蛋白酶，在45～55℃、pH值6～10的條件下提取30min～9h(優(yōu)選30min～2h)，之后經(jīng)離心(3000～5000r/min，15～30min)，上清液用截留分子量為3000～5000Da的超濾膜進行脫鹽濃縮后，冷凍干燥，得到魚鱗膠原蛋白；所述的蛋白酶選自復合風味蛋白酶(標稱活力500LAPU/g)、堿性蛋白酶(標稱活力2.4AU-A/g)、復合蛋白酶(標稱活力1.5AU-N/g)或中性蛋白酶(標稱活力0.8AU-N/g)，均可商購獲得；所述蛋白酶的質(zhì)量用量為魚鱗粉質(zhì)量的1％～6％(優(yōu)選1.5％～3％)；最優(yōu)選的提取條件為：溫度50℃，pH值6.5，提取時間1h，料液比1：35，所述蛋白酶為復合蛋白酶(標稱活力1.5AU-N/g)，其質(zhì)量用量為魚鱗粉質(zhì)量的3％；(4)酶解制備魚鱗膠原蛋白水解肽：取步驟(3)所得魚鱗膠原蛋白，以料液質(zhì)量比1：5～40(優(yōu)選1：30～40)與去離子水混合，然后加入復合蛋白酶(標稱活力1.5AU-N/g)，在pH值5.5～7.5、40～60℃的條件下恒溫酶解20min～8h(優(yōu)選2～4h)，之后滅酶(100℃，15min)，經(jīng)離心(3000～5000r/min，15～30min)，上清液減壓濃縮后，冷凍干燥，得到魚鱗膠原蛋白水解肽；所述復合蛋白酶的質(zhì)量用量為魚鱗膠原蛋白質(zhì)量的1％～5％(優(yōu)選2％～4％)；最優(yōu)選的酶解制備條件為：溫度50℃，pH值6.5，提取時間3h，料液比1：35，復合蛋白酶(標稱活力1.5AU-N/g)的質(zhì)量用量為魚鱗膠原蛋白質(zhì)量的4％。與現(xiàn)有工藝相比，本發(fā)明的優(yōu)勢體現(xiàn)在：(1)魚鱗膠原蛋白作為天然的生物資源，具有合成高分子材料無法比擬的生物相容性和生物可降解性，可廣泛應用在醫(yī)藥，如治療真皮損傷或缺陷、美容整形、改善睡眠、增強機體免疫力等方面中的作用已獲得共識。一般膠原蛋白粉是以牛皮、牛骨、豬皮、豬骨或魚皮等為原料制成的，但由于陸生動物各種疫病較多，以牛或豬的皮骨為原料生產(chǎn)的膠原蛋白有受疫病污染之虞；且牛、豬或魚的皮骨，因原料富含脂肪會影響萃取率及產(chǎn)品澄清度，致使后續(xù)利用受到影響。魚鱗膠原蛋白比畜禽膠原蛋白更安全、更易吸收，因而更受市場歡迎。(2)魚鱗加工下腳料的主要成分為蛋白質(zhì)，大約占魚鱗總質(zhì)量的70％，目前國內(nèi)近一半的魚鱗廢棄沒有利用，已利用的主要集中在魚膠原肽的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽、抗氧化肽、促進學習記憶活性肽、抗冷凍肽等，關于抑制糖吸收的降糖肽鮮有研究。(3)本發(fā)明對酶法制備魚鱗膠原蛋白水解肽的方法進行了篩選與優(yōu)化，魚鱗膠原蛋白水解肽的得率可達5.708％。分別以水解度、對α-葡萄糖苷酶的抑制率、對α-淀粉酶的抑制率為篩選指標，優(yōu)化了酶法制備魚鱗膠原蛋白水解肽的最佳水解條件，優(yōu)選復合蛋白酶作為水解酶，復合蛋白酶的最佳作用條件，即pH值6.5，溫度50℃的條件下，優(yōu)選酶解條件為：酶解時間3h，酶與底物濃度比4％，料液比1：35，在此條件下，水解度為42.34％，對α-葡萄糖苷酶的抑制率為52.17％，對α-淀粉酶的抑制率為59.61％。該工藝條件溫和，綠色環(huán)保，符合保健食品的生產(chǎn)要求。且保存工藝簡單，易放大生產(chǎn)。(四)附圖說明圖1為實施例第3.1節(jié)中考馬斯亮藍法測蛋白質(zhì)含量標準工作曲線；圖2為實施例第3.4.5節(jié)中Folin-Phonel法測蛋白質(zhì)含量的標準工作曲線；圖3為實施例第3.4.6.1節(jié)中不同水解時間魚鱗膠原蛋白的水解度；圖4為實施例第3.4.6.1節(jié)中不同水解時間水解蛋白肽對α-葡萄糖苷酶抑制率影響；圖5為實施例第3.4.6.1節(jié)中不同水解時間酶法水解蛋白肽對α-淀粉酶抑制率影響；圖6為實施例第3.4.6.2節(jié)中不同料液比酶法提取蛋白質(zhì)的水解效果；圖7為實施例第3.4.6.2節(jié)中不同料液比水解蛋白肽對α-葡萄糖苷酶抑制率影響；圖8為實施例第3.4.6.2節(jié)中不同料液比水解蛋白肽對α-淀粉酶抑制率影響；圖9為實施例第3.4.6.3節(jié)中不同濃度酶法提取蛋白質(zhì)的水解效果；圖10為實施例第3.4.6.3節(jié)中不同濃度酶法水解蛋白肽對α-葡萄糖苷酶抑制率影響；圖11為實施例第3.4.6.3節(jié)中不同濃度酶法水解蛋白肽對α-淀粉酶抑制率影響。(五)具體實施方式下面結合具體實施例對本發(fā)明進行進一步描述，但本發(fā)明的保護范圍并不僅限于此。實施例1.實驗材料與儀器農(nóng)貿(mào)市場收集的廢棄草魚魚鱗；氫氧化鈣；氫氧化鈉；鹽酸。數(shù)顯恒溫水浴鍋，HH-2；篩網(wǎng)；高速離心機，DL-5M型，湖南星科科學儀器有限公司；水域恒溫搖床，ZHWY-200B型，上海智成分析儀器制造有限公司；冷凍恒溫培養(yǎng)搖床，ZHWY-2102C型，上海智成分析儀器制造有限公司；數(shù)控超聲波清洗器：KQ2200DE型，昆山市超聲儀器有限公司；數(shù)顯恒溫磁力攪拌器：86-2型，杭州儀表電機有限公司；電子天平：AL104型，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；PH計：DELTA320型，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；可見分光光度計：721型，上海元析儀器有限公司；電熱恒溫水槽：DK-8D型，上海森信實驗儀器有限公司；潔凈工作臺：VS-840K-U型，蘇州安泰空氣技術有限公司；高壓蒸汽滅菌鍋：ES-315型。2.實驗方法2.1原料預處理將在市場上收集的廢棄新鮮草魚魚鱗用清水反復沖洗，浸泡，以除去粘液和污物，仔細剔除混入的其它雜質(zhì)，最后將干凈的魚鱗置于陰涼處自然風干。在開始實驗之前應將干魚鱗在水中浸泡使其恢復柔軟狀態(tài)。實驗氣溫在20℃左右時，清水浸泡魚鱗為1～2天，但在浸泡過程中必須經(jīng)常換水，以免發(fā)生腐敗。2.2魚鱗處理工藝取經(jīng)預處理的魚鱗，浸于濃度為0.3wt％的石灰水中。石灰水濃度可隨氣溫變化適當調(diào)節(jié)，例如：氣溫較高時石灰水濃度可稍微低些，氣溫低時濃度要稍微高些。魚鱗與石灰水的料液質(zhì)量比為1：3，pH值區(qū)間為12～12.5，溫度最好調(diào)節(jié)在15℃，浸泡時間約7～10天。浸石灰水的目的是除去魚鱗內(nèi)部的部分色素和魚鱗表面上尚未沖洗掉的粘液污物以及光鱗物質(zhì)。在浸石灰水過程中要注意及時更換新鮮的石灰水，在7～10天的浸泡期間大約更換4～5次，以免發(fā)臭。草魚的魚鱗有一層很厚的皮脂和色素，浸石灰水之后進行脫色處理。將浸石灰水后的魚鱗用清水洗滌干凈后，投入2wt％氫氧化鈉溶液中浸泡16h，魚鱗與氫氧化鈉溶液的重量之比約為1：25，這個過程可把魚鱗黑色皮脂層去掉，而且色素也會溶于氫氧化鈉溶液中。然后倒去廢液，取出魚鱗，用清水反復沖洗，待大部分堿液除去后，再浸入清水中，不斷換水，以確保堿液完全除去。浸堿結束之后，再用2wt％鹽酸溶液再次浸泡魚鱗，經(jīng)常攪拌，及時用pH計檢測pH值大小，以檢查鹽酸是否已經(jīng)用盡，是否需要更換新鹽酸溶液。經(jīng)pH值確認待堿質(zhì)完全除去后，該反應漸漸減慢，應逐步將鹽酸濃度減小以免損壞魚鱗。最后鹽酸溶液的pH值將保持在3～4之間，魚鱗片柔軟透明，pH值不再波動，表示堿質(zhì)已完全除去。取出魚鱗后用清水反復沖洗使pH值到達6左右。為了能得到更純粹的魚鱗，除去魚鱗內(nèi)部的有機雜質(zhì)，還需要再進行一次浸石灰水，石灰水的濃度仍為0.3wt％，浸泡時間7～10天，且每隔3～5天要換一次新的石灰水。經(jīng)一次處理后，脫去堿質(zhì)的魚鱗已經(jīng)發(fā)生膨脹，所以這次除去魚鱗內(nèi)部雜質(zhì)就比沒脫堿時更容易。浸石灰水完畢之后，先用清水反復沖洗，再用稀鹽酸溶液(pH在3～4之間)浸泡5h將石灰水完全除去，然后用清水洗滌使pH值到6左右，干燥后粉碎，得到魚鱗粉，作為后續(xù)試驗原料。2.3魚鱗粉顆粒大小對魚鱗膠原蛋白得率的影響取0.2g經(jīng)處理的魚鱗粉(40目，100目，200目，300目)，按料液質(zhì)量比1：30各自分別加入2wt％鹽酸及2wt％醋酸的混合溶液中，20℃放置12h，100℃水浴30min，8000r/min離心20min，取上清，考馬斯亮藍法測蛋白吸光度。2.4魚鱗膠原蛋白含量測定采用考馬斯亮藍法?？捡R斯亮藍G-250染色液：稱取考馬斯亮藍G-25050mg溶于25ml95％wt乙醇，再量取體積分數(shù)為85％磷酸60ml加入燒杯，轉(zhuǎn)入500ml容量瓶，定容，抽濾，得考馬斯亮藍G-250溶液；標準樣品：0.5mg/ml牛血清蛋白。3結果3.1考馬斯亮藍標準曲線分別吸取0.01～0.08ml標準蛋白質(zhì)溶液于10ml試管中，各試管補加蒸餾水至0.5ml。各管加入3ml考馬斯亮藍G-250溶液，每加完一管立即在渦旋混合器上混合，不要太劇烈，放置10～15min，于595nm處測定其吸光度。以標準蛋白濃度為橫坐標，用吸光度值為縱坐標作圖，即可得一條標準曲線，如圖1。3.2魚鱗顆粒大小對蛋白得率影響，如表1。表1不同目數(shù)魚鱗膠原蛋白得率過篩目數(shù)魚鱗膠原蛋白得率％40目2.11100目3.40200目4.16300目4.19從上述試驗結果可知，過篩目數(shù)越高，魚鱗膠原蛋白得率也越高，但200目以后魚鱗膠原蛋白得率上升趨于平緩，且粒徑越小，制備要求越高，故實驗以過200目篩為最優(yōu)目數(shù)。3.3魚鱗膠原蛋白酶法提取工藝3.3.1酶種類優(yōu)化準確稱取1g第2.2節(jié)中所得魚鱗粉，分別加入一定量去離子水(料液質(zhì)量比1：20)和2％的復合風味蛋白酶、堿性蛋白酶、復合蛋白酶、中性蛋白酶。其中復合風味蛋白酶(無錫聯(lián)合恒洲化工有限公司，pH6.0，50℃，標稱活力500LAPU/g)，堿性蛋白酶(無錫聯(lián)合恒洲化工有限公司，pH8.0，55℃，標稱活力2.4AU-A/g)，復合蛋白酶(無錫聯(lián)合恒洲化工有限公司，pH6.0，50℃，標稱活力1.5AU-N/g)，中性蛋白酶(無錫聯(lián)合恒洲化工有限公司，pH6.0，45℃，標稱活力0.8AU-N/g)。在各種酶最適溫度與pH條件下分別提取6h后測定蛋白含量及提取得率。表2不同酶提取魚鱗膠原蛋白效果酶種類溫度℃pH蛋白濃度mg/l提取得率％堿性蛋白酶6090.0910.18中性蛋白酶5070.1530.305復合風味蛋白酶506.50.2330.466復合蛋白酶506.50.2740.55結果顯示，在各酶最適宜條件下，復合蛋白酶活性最強，提取得率最高，故選取復合蛋白酶解蛋白質(zhì)。3.3.2單因素試驗(1)提取時間對酶法提取影響準確稱取1g第2.2節(jié)中所得魚鱗粉，分別加入一定量去離子水(料液質(zhì)量比1：20)和2％的復合蛋白酶，溫度50℃、pH為6.5條件下分別提取30min、1h、2h、3h、4h、5h、6h、7h、8h、9h后測定蛋白含量及提取得率。表3提取時間對酶法提取影響提取時間蛋白濃度mg/ml提取得率％30min0.2170.4341h1.3852.82h1.2092.423h0.7731.554h0.6521.35h0.3950.796h0.2740.557h0.2100.428h0.0270.0539h0.1290.026結果顯示，在復合蛋白酶最適宜條件下，反應1h后提取得率最高，隨著時間延長提取率反而下降。(2)酶與底物濃度比對酶法提取影響準確稱取1g第2.2節(jié)中所得魚鱗粉，分別加入一定量去離子水(料液質(zhì)量比1：20)和1％、1.5％、2％、3％、4％、5％、6％的復合蛋白酶，在溫度50℃、pH為6.5條件下提取1h后，測定蛋白含量及提取率。表4酶與底物濃度比對酶法提取影響酶與底物濃度比蛋白濃度mg/l提取率％1％0.3200.641.5％0.6091.222％1.1212.243％1.1352.274％1.1502.295％0.7571.516％0.2740.55結果顯示，蛋白與不同濃度復合蛋白酶液，在最適宜條件下，反應1h后，2％濃度下提取率最高。(3)料液比對酶法提取的影響準確稱取1g第2.2節(jié)中所得魚鱗粉，分別加入5、10、15、20、25、30、35、40ml的去離子水和2％的復合蛋白酶，在溫度50℃、pH為6.5條件下提取24h后。分別測定料液比1：10、1：15、1：20、1：25、1：30、1：35、1：40g/ml下蛋白含量及提取率。表5料液比對酶法提取的影響結果顯示，料液比1：10至1：40時，蛋白提取率隨之上升，但料液比為1：25之后提取率與料液比1：25時相差不大。3.3.3多因素正交試驗(1)確定試驗因素及水平數(shù)根據(jù)單因素試驗反應的結果，設計提取時間A(30min、1h、2h)、酶與底物濃度比B(1.5％、2％、3％)，料液比C(1：30、1：35、1：40)的三因素三水平進行分析。試驗結果如表6。表6多因素正交試驗結果分析故優(yōu)選的最佳酶解條件：A2B3C2，即反應時間1h，酶與底物濃度比3％，料液比1：35，在此提取條件下，魚鱗膠原蛋白的提取得率為5.708％。3.4魚鱗膠原蛋白水解肽的制備工藝3.4.1制備流程取適量酶法提取蛋白后的魚鱗膠原蛋白溶液→Folin-Phonel法測蛋白濃度→恒溫酶解→100℃滅酶15min→取適量上清液測定水解度、α-葡萄糖苷酶抑制及α-淀粉酶抑制率抑制率。α-葡萄糖苷酶的活性測定方法：反應體系為1.5mL1M碳酸鈉、100μL酶液、1.7mL磷酸緩沖液(pH4.3)、0.2mLpNPG(4-硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷，購自Sigma-Aldrich)。反應溫度55℃、反應時間180min、底物濃度10mmol/L，以蒸餾水調(diào)零，以不加酶的反應體系為背景組(A背景)，以不加多糖的反應體系為空白組(A空白)，計算多糖對α-葡萄糖苷酶的抑制率為：抑制率(％)＝[1-(A樣-A背景)/A空白]×100％。α-淀粉酶抑制率的測定如下表7：表7α-淀粉酶抑制率測定的試劑各管于37℃水浴30min后，加入3mLDNS，經(jīng)沸水浴10min，冷卻后取0.5mL反應液加蒸餾水4.5mL，于A520處測吸光值。α-淀粉酶抑制率按下式計算：式中：I——α-淀粉酶抑制率；A1，A2——對照1，2號管于A520處測吸光值；A0——樣品管于A520處測吸光值。3.4.2魚鱗膠原蛋白溶液的水溶性蛋白質(zhì)總量的測定取四支1.5ml離心管，并標號0、1、2、3。其中，0號管中加入蒸餾水1.0ml，1、2和3三支管中準確加入預定濃度未水解的已作處理的魚鱗膠原蛋白溶液1.0ml，在12000rpm的速度下離心10min，分別對上清液作一定的稀釋，取稀釋液0.50ml加入到四支15ml試管中，分別加入4ml福林試劑D液，于室溫下靜置10min，然后加福林試劑E液0.5ml并混勻，于40℃下保溫20min，室溫冷卻，在680nm下測定各管溶液的吸光度，0號為空白組。根據(jù)Folin-Phonel法測蛋白的標準曲線和稀釋倍數(shù)算出蛋白含量。3.4.3魚鱗膠原蛋白溶液中TCA可溶性短肽的含量測定取四支1.5ml離心管，并標號0、1、2、3。其中，0號管中加入蒸餾水0.5ml，1、2、3三支離心管中準確加入預定濃度已經(jīng)過處的理魚鱗膠原蛋白溶液0.5ml，所有四支管均加入0.5ml10％TCA溶液，搖勻后離心(12000rpm，10min)，以下按3.4.2自“分別對上清液作一定的稀釋，取稀釋液0.50ml加入到四支15ml試管中……測定吸光度”進行操作。根據(jù)Folin-Phonel法測蛋白的標準曲線和稀釋倍數(shù)算出TCA可溶性短肽含量。3.4.4水解度測定水解度(degreeofhydrolysis，DH)是理解和衡量蛋白水解程度和效果的重要參數(shù)，且對于建立生物大分子的功能、生物活性以及感官特性與水解作用之間的關系具有重要作用。目前有很多測定蛋白質(zhì)水解度的方法，主要是根據(jù)四個原則：①測定自由α-氨基、②測定可溶性蛋白、③滴定釋放的質(zhì)子以及④通過滲透壓測定法測定蛋白溶液的冰點。本實驗根據(jù)測定可溶性蛋白質(zhì)的原理來測定魚鱗膠原蛋白的水解度。蛋白質(zhì)經(jīng)過水解，形成不同長度的短肽，溶解性增加，然后通過可溶性蛋白(含短肽)的含量變化來衡量蛋白質(zhì)水解的程度。水解度用的是福林酚法，(水解后的多肽濃度-水解前的多肽濃度)/水解前蛋白濃度，多肽測定都經(jīng)過100℃水浴15min，冷卻，10％TCA沉淀的步驟。本實驗運用Folin-Phonel法對可溶性蛋白質(zhì)含量進行測定，魚鱗膠原蛋白的水解度可用下式來計算：3.4.5標準曲線繪制Folin-Phonel標準曲線：y＝0.10713x-0.1245，R2＝0.9991，如圖2。3.4.6單因素試驗3.4.6.1水解時間對魚鱗膠原蛋白水解肽的影響Folin-Phonel法檢測酶法提取的魚鱗膠原蛋白濃度。酶法提取的魚鱗膠原蛋白(0.50g)按料液比1：40，在50℃下恒溫用復合蛋白酶(3％)酶解不同時間后100℃滅酶15min，取適量上清液測定水解度(圖3)、α-葡萄糖苷酶抑制率(圖4)及α-淀粉酶抑制率(圖5)。由圖3可知，酶法提取的魚鱗膠原蛋白在復合蛋白酶最適宜條件下，魚鱗膠原蛋白水解度隨著反應時間的延長而升高，其中反應開始后3h內(nèi)升高速度最快，反應3h后速度下降，反應7h水解度雖有升高趨勢但以趨于平緩。由圖4可知，酶法提取的魚鱗膠原蛋白水解肽對α-葡萄糖苷酶抑制率在0-4h內(nèi)隨著反應時間的延長而升高，4h后隨著反應時間的延長而降低。由圖5可知，酶法提取的魚鱗膠原蛋白水解肽對α-淀粉酶抑制率在0-3h內(nèi)隨著反應時間的延長而升高，3h時抑制率高達60.8％，3h后隨著反應時間的延長而降低，但有輕微波動。3.4.6.2料液比對魚鱗膠原蛋白水解肽的影響Folin-Phonel法檢測酶法提取的魚鱗膠原蛋白濃度。酶法提取的魚鱗膠原蛋白(0.50g)在50℃下恒溫用復合蛋白酶(3％)酶解3h后，100℃滅酶15min，取適量上清液測定水解度(圖6)、α-葡萄糖苷酶抑制率(圖7)及α-淀粉酶抑制率(圖8)。由圖6可知，酶法提取的魚鱗膠原蛋白水解度均隨著料液比的增大而升高，其中料液比為1：5～1：25范圍內(nèi)上升速度最快，然后增加速度下降，1：35～1：40料液比范圍內(nèi)水解度雖有升高趨勢但以趨于平緩。由圖7可知，酶法提取的魚鱗膠原蛋白水解肽對α-葡萄糖苷酶的抑制率隨著料液比的增大而升高，其中料液比為1：5～1：30范圍內(nèi)上升速度最快；料液比1：35～1：40范圍內(nèi)水解肽對α-葡萄糖苷酶的抑制率雖有升高趨勢但以趨于平緩。由圖8可知，酶法提取的魚鱗膠原蛋白水解肽對α-淀粉酶的抑制率隨著料液比的增大而升高，其中料液比在1：5～1：30范圍內(nèi)升高速度最快，料液比1：35～1：40范圍內(nèi)上升趨勢趨于平緩。3.4.6.3酶與底物濃度比對魚鱗膠原蛋白水解肽的影響Folin-Phonel法檢測酶法提取的魚鱗膠原蛋白濃度。酶法提取的魚鱗膠原蛋白(0.50g)在50℃下恒溫用不同濃度復合蛋白酶酶解2h后，100℃滅酶15min，取適量上清液測定水解度(圖9)、α-葡萄糖苷酶抑制率(圖10)及α-淀粉酶抑制率(圖11)。由圖9可知，酶法提取的魚鱗膠原蛋白水解度隨著酶的濃度增大而升高，到達一定頂點后隨濃度升高而下降。酶法提取的蛋白在3％濃度的酶作用下水解度最高。由圖10可知，酶法提取的魚鱗膠原蛋白水解肽對α-葡萄糖苷酶的抑制率均先隨著酶與底物濃度比的增大而升高，到達最高點時，隨濃度增加而下降。水解肽對α-葡萄糖苷酶的抑制率在酶與底物濃度比為3％時最高。由圖11可知，酶法提取的魚鱗膠原蛋白水解肽對α-淀粉酶的抑制率均先隨著酶與底物濃度比的增大而升高，到達最高點時，隨濃度增加而下降。水解肽對α-淀粉酶的抑制率在酶與底物濃度比為3％時最高。3.4.7正交試驗根據(jù)單因素試驗反應的結果，設計酶解時間A(2h、3h、4h)、酶與底物濃度比B(2％、3％、4％)與料液比C(1：30、1：35、1：40)的三因素三水平進行分析，以水解肽對α-葡萄糖苷酶的抑制率作為指標，結果見表8。表8多因素正交試驗結果分析故優(yōu)選的最佳酶解條件：A2B3C2，即酶解時間3h，酶與底物濃度比4％，料液比1：35，在此酶解條件下，魚鱗膠原蛋白水解肽的水解度為42.34％，對α-葡萄糖苷酶的抑制率為52.17％，對α-淀粉酶的抑制率為59.61％。當前第1頁1 2 3