本發(fā)明涉及一種魚(yú)膠原蛋白的提取方法，屬于天然蛋白提取技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
膠原蛋白(collagen)是一種白色、不透明、無(wú)支鏈的纖維性蛋白質(zhì)，在動(dòng)物細(xì)胞中扮演結(jié)合組織的角色。膠原蛋白富含除色氨酸和半胱氨酸外的18種氨基酸，其中維持人體生長(zhǎng)所必需的氨基酸有7種。膠原蛋白中的甘氨酸占30%，脯氨酸和羥脯氨酸共占約25%，是各種蛋白質(zhì)中含量最高的，丙氨酸、谷氨酸的含量也比較高。同時(shí)，還含有在一般蛋白中少見(jiàn)的羥脯氨酸和焦谷氨酸和在其他蛋白質(zhì)幾乎不存在的羥基賴氨酸。所以，膠原蛋白的營(yíng)養(yǎng)十分豐富。魚(yú)膠原蛋白主要是從羅非魚(yú)、鱈魚(yú)新鮮皮和魚(yú)鱗中通過(guò)生物酶定向剪切技術(shù)提取得到，分子量在2000da～5000da長(zhǎng)度之間，具有很高的消化吸收性，熱穩(wěn)定性極好，具有極好生物親和性，能夠很好的發(fā)揮其滲透、保濕、修復(fù)等功能。
魚(yú)膠原蛋白主要含有i和v型膠原蛋白，分布在魚(yú)類(lèi)的皮、骨、鱗等處，是由3條肽鏈擰成的螺旋形纖維狀蛋白質(zhì)。其主要氨基酸組成為甘氨酸、脯氨酸、羥脯氨酸、丙氨酸，羥賴氨酸等，氨基酸組成與其它蛋白質(zhì)有顯著區(qū)別，甘氨酸的含量很高，幾乎占總氨基酸殘基的三分之一，即每隔2個(gè)其它氨基酸殘基(x，y)即有1個(gè)甘氨酸，故其肽鏈可用(gly-x-y)n來(lái)表示；其所含有的羥脯氨酸和羥賴氨酸殘基在其它蛋白質(zhì)中較為罕見(jiàn)。由于海洋生態(tài)環(huán)境的特殊性（如高壓、低溫等），使得魚(yú)膠原蛋白在氨基酸的組成和氨基酸的序列上與陸生動(dòng)物膠原蛋白相比都有一定的差異，從而使魚(yú)膠原蛋白擁有獨(dú)特生理功能和物化特性。魚(yú)膠原蛋白易溶于中性鹽溶液或稀酸，較易調(diào)制成可溶性膠原溶液，由于其魚(yú)膠原蛋白低抗原性的特點(diǎn)，使其在醫(yī)療和食品業(yè)領(lǐng)域中更受人們歡迎。
以2009年為例，魚(yú)類(lèi)總產(chǎn)量為2990萬(wàn)t，則廢棄?mèng)~骨的數(shù)量高達(dá)1000萬(wàn)t，這表明魚(yú)類(lèi)產(chǎn)品的副產(chǎn)品資源十分豐富。如果將廢棄?mèng)~骨進(jìn)行深加工，開(kāi)發(fā)出高科技產(chǎn)品，挖掘漁業(yè)產(chǎn)品組合方案的深度，則能大大提升我國(guó)的漁業(yè)產(chǎn)業(yè)發(fā)展水平，進(jìn)而占領(lǐng)更多的市場(chǎng)份額，具有十分廣闊的發(fā)展前景。因此從魚(yú)副產(chǎn)品中提取膠原蛋白不僅能夠充分利用資源，提高魚(yú)類(lèi)加工的附加值，而且可以減少環(huán)境污染，對(duì)促進(jìn)魚(yú)類(lèi)加工業(yè)的發(fā)展具有重要意義。
到目前為止，國(guó)內(nèi)外的研究者報(bào)道了很多膠原蛋白的提取方法。總的來(lái)說(shuō)，依據(jù)提取介質(zhì)的不同，魚(yú)類(lèi)膠原蛋白的提取方法可分為五類(lèi)：熱水法、酸法、堿法、鹽法以及酶法等。不論哪種方法，其基本原理都是根據(jù)膠原蛋白的特性改變蛋白質(zhì)所在的外界環(huán)境，把膠原蛋白從其他蛋白質(zhì)或基質(zhì)中分離出來(lái)。在很多情況下，單一的提取方法到不到預(yù)期目標(biāo)，所以在實(shí)際操作中，通常將多種提取方法相互結(jié)合。
膠原蛋白提取分離前要進(jìn)行脫脂和去除雜蛋白，如果膠原蛋白中混入脂質(zhì)，則最終形成乳濁狀的膠原溶液，使得脂質(zhì)難以去除；膠原蛋白中混入雜蛋白，會(huì)影響到后續(xù)分離提取效率，從而影響到膠原成品的純度。脫脂在魚(yú)膠原蛋白的提取、分離過(guò)程中非常必要，現(xiàn)對(duì)目前已有的魚(yú)膠原蛋白脫脂方法包括有：(1)有機(jī)溶劑浸提法，是魚(yú)膠原蛋白脫脂最常用的方法，溶劑可回收，節(jié)約成本，減少環(huán)境污染，目前應(yīng)用較多的溶劑有甲醇、正己烷、乙醚、乙醇、異丙醇、丙酮等。例如利用乙醇、丙酮和正己烷，除去魚(yú)皮中所含的脂肪，提高了膠原的純度。但有機(jī)溶劑具有毒性，若去除不干凈將對(duì)人體有害。(2)堿性溶液脫脂法，堿性溶液可以與脂肪發(fā)生皂化反應(yīng)，有效地除去脂肪。如以魚(yú)鱗為原料，加入碳酸氫鈉溶液進(jìn)行脫脂，得到低脂的魚(yú)鱗膠原蛋白。但堿濃度必須嚴(yán)格控制，以免破壞魚(yú)膠原蛋白的三螺旋結(jié)構(gòu)。(3)co2超臨界處理器脫脂，co2超臨界處理可以避免這些缺點(diǎn)。用水解蛋白酶提取膠原蚤白后，水解液用co2超臨界脫脂，魚(yú)皮經(jīng)處理后，不僅很大程度地降低其油脂含量，同時(shí)還達(dá)到脫腥、脫色、脫臭的效果，提高了膠原的純度，并且可較好保持膠原的三螺旋結(jié)構(gòu)。(4)脂肪酶法，主要利用脂肪酶對(duì)油脂分子的水解作用易被乳化而除去。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是魚(yú)膠原蛋白在提取過(guò)程中脂類(lèi)物質(zhì)與蛋白分離過(guò)程中需要使用較多有機(jī)溶劑而導(dǎo)致的操作時(shí)間長(zhǎng)、污染嚴(yán)重的問(wèn)題；本發(fā)明通過(guò)采用了一種不使用有機(jī)溶劑的魚(yú)膠原蛋白提取工藝，實(shí)現(xiàn)了脂肪的去除分離，技術(shù)構(gòu)思主要是：首先通過(guò)在超聲作用下的研磨和均漿，使魚(yú)皮組織細(xì)胞充分破碎，使脂肪與蛋白在后續(xù)的堿處理和酶處理過(guò)程中能夠更多地被去除，可以得到低脂含量的粗提物，接下來(lái)，再將粗提物溶液通過(guò)經(jīng)過(guò)了親油改性的樹(shù)脂床，實(shí)現(xiàn)將低含量的脂類(lèi)吸附的目的。
技術(shù)方案是：
一種魚(yú)膠原蛋白的提取方法，包括如下步驟：
第1步，組織破碎：將魚(yú)皮解凍之后，加入水，使魚(yú)皮與水的重量比在10：0.2～1，將混合物進(jìn)行粉碎和研磨，在粉碎和研磨的同時(shí)外加超聲作用，得到漿料；
第2步，去除鹽溶性雜質(zhì)：將漿料與nacl溶液混合，攪拌均勻后浸泡，再經(jīng)過(guò)離心處理，去除上清，得到第一沉淀；
第3步，去除脂類(lèi)和堿溶性雜質(zhì)：將第一沉淀與堿溶液混合，攪拌均勻后浸泡，再經(jīng)過(guò)離心處理，去除上清，得到第二沉淀；
第4步，去除酸溶性雜質(zhì)：將第二沉淀與酸溶液混合，攪拌均勻后浸泡，再經(jīng)過(guò)離心處理，去除上清，得到第三沉淀；
第5步，酶解處理：第三沉淀與水混合，再加入第三沉淀重量1～5%的蛋白酶進(jìn)行酶解，反應(yīng)結(jié)束后升溫滅酶，經(jīng)過(guò)離心后，取上清液得到粗提物；
第6步，樹(shù)脂除脂處理：粗提物送入除脂樹(shù)脂床層中進(jìn)行吸附處理，得到除脂液；
第7步，精制處理：除脂液中加固體nacl，使nacl濃度為0.5～1.5mol/l，冷凍離心得鹽析后的膠原蛋白沉淀；再用0.5～1.5mol/l的醋酸對(duì)膠原沉淀物復(fù)溶后裝袋透析除去鹽離子，冷凍干燥得到精制魚(yú)膠原蛋白。
所述的第1步中，魚(yú)皮來(lái)源選自鯉魚(yú)、鯽魚(yú)、青魚(yú)、草魚(yú)、鰱魚(yú)、鳙魚(yú)或者羅非魚(yú)。
所述的第2步中，nacl溶液的質(zhì)量濃度4～10%，漿料與nacl溶液重量比1：5～10，浸泡時(shí)間是10～30h。
所述的第3步中，所述的堿溶液選自naoh溶液、koh溶劑、nahco3溶液或者k2co3溶液；堿溶液的質(zhì)量濃度2～5%，第一沉淀與堿溶液重量比1：7～12，浸泡時(shí)間20～35h。
所述的第4步中，所述的酸溶劑選自檸檬酸、乙酸或者草酸，酸溶劑的質(zhì)量濃度是5～12%，第二沉淀與酸溶液重量比1：4～8，浸泡時(shí)間是5～10h。
所述的第5步中，第三沉淀與水的重量比是1：15～35，蛋白酶是指木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、堿性蛋白酶或胰蛋白酶，酶解溫度是35～45℃，酶解時(shí)間是4～10h，酶解過(guò)程中通過(guò)hcl或者naoh控制反應(yīng)液ph在4～5；滅酶是指在90～95℃下處理5～15min。
所述的第6步中，除脂樹(shù)脂的制備方法是：按重量份計(jì)，在反應(yīng)釜中加入微晶纖維素10～15份、水150～200份、分散劑0.5～1份，加熱并攪拌均勻；再在氮?dú)鈿夥障?，加入甲基丙烯酸丁?～10份、甲基丙烯酸縮水甘油酯(gma)2～4份、交聯(lián)劑0.3～0.6份、致孔劑1.5～3份、水15～20份，升溫至75～85℃進(jìn)行反應(yīng)4～8h，反應(yīng)結(jié)束后，將固態(tài)物依次用乙醇和水洗滌之后，真空干燥、粉碎后，得到除脂樹(shù)脂。
所述的分散劑是聚乙烯醇；所述的交聯(lián)劑為乙二胺、丁二胺、碳化二亞胺、三羥甲基三聚氰胺、二羥甲基脲或氮丙啶；所述的致孔劑是乙酸乙酯。
所述的第6步中，樹(shù)脂的體積是粗提物體積的1/40～1/20，粗提物的流速是3～5bv/h，吸附過(guò)程溫度是20～35℃。
上述的除脂樹(shù)脂中，主要是通過(guò)微晶纖維素作為吸脂的主體成分，通過(guò)致孔劑處理后，使其表面大孔化，同時(shí)利用甲基丙烯酸丁酯單體接枝修飾提高吸脂效果，利用甲基丙烯酸縮水甘油酯單體修飾提高對(duì)蛋白的排斥力，提高了蛋白收率。
有益效果
本發(fā)明通過(guò)采用了一種不使用有機(jī)溶劑的魚(yú)膠原蛋白提取工藝，實(shí)現(xiàn)了脂肪的去除分離，技術(shù)構(gòu)思主要是：首先通過(guò)在超聲作用下的研磨和均漿，使魚(yú)皮組織細(xì)胞充分破碎，使脂肪與蛋白在后續(xù)的堿處理和酶處理過(guò)程中能夠更多地被去除，可以得到低脂含量的粗提物，接下來(lái)，再將粗提物溶液通過(guò)經(jīng)過(guò)了親油改性的樹(shù)脂床，實(shí)現(xiàn)將低含量的脂類(lèi)吸附的目的。制備得到的魚(yú)膠原蛋白具有純度高、脂肪含量少、水溶解性好的優(yōu)點(diǎn)。
附圖說(shuō)明
圖1是不同ph條件下的魚(yú)膠原蛋白的溶解性圖。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1
第1步，組織破碎：將鯽魚(yú)魚(yú)皮解凍之后，加入水，使魚(yú)皮與水的重量比在10：0.2，將混合物進(jìn)行粉碎和研磨，在粉碎和研磨的同時(shí)外加超聲作用，得到漿料；
第2步，去除鹽溶性雜質(zhì)：將漿料與4wt%nacl溶液混合，漿料與nacl溶液重量比1：5，攪拌均勻后浸泡，浸泡時(shí)間是10h，再經(jīng)過(guò)離心處理，去除上清，得到第一沉淀；
第3步，去除脂類(lèi)和堿溶性雜質(zhì)：將第一沉淀與2wt%naoh溶液混合，第一沉淀與堿溶液重量比1：7，攪拌均勻后浸泡，浸泡時(shí)間20h，再經(jīng)過(guò)離心處理，去除上清，得到第二沉淀；
第4步，去除酸溶性雜質(zhì)：將第二沉淀與5wt%檸檬酸溶液混合，第二沉淀與酸溶液重量比1：4，攪拌均勻后浸泡，浸泡時(shí)間是5h，再經(jīng)過(guò)離心處理，去除上清，得到第三沉淀；
第5步，酶解處理：第三沉淀與水混合，第三沉淀與水的重量比是1：15，再加入第三沉淀重量1%的木瓜蛋白酶進(jìn)行酶解，酶解溫度是35℃，酶解時(shí)間是4h，酶解過(guò)程中通過(guò)hcl或者naoh控制反應(yīng)液ph在4～5，反應(yīng)結(jié)束后在90℃下處理5min滅酶，經(jīng)過(guò)離心后，取上清液得到粗提物；
第6步，樹(shù)脂除脂處理：粗提物送入除脂樹(shù)脂床層中進(jìn)行吸附處理，得到除脂液，樹(shù)脂的體積是粗提物體積的1/40，粗提物的流速是3bv/h，吸附過(guò)程溫度是20℃；
第7步，精制處理：除脂液中加固體nacl，使nacl濃度為0.5mol/l，冷凍離心得鹽析后的膠原蛋白沉淀；再用0.5mol/l的醋酸對(duì)膠原沉淀物復(fù)溶后裝袋透析除去鹽離子，冷凍干燥得到精制魚(yú)膠原蛋白。
所述的第6步中，除脂樹(shù)脂的制備方法是：按重量份計(jì)，在反應(yīng)釜中加入微晶纖維素10份、水150份、分散劑聚乙烯醇0.5份，加熱并攪拌均勻；再在氮?dú)鈿夥障?，加入甲基丙烯酸丁?份、甲基丙烯酸縮水甘油酯(gma)2份、交聯(lián)劑乙二胺0.3份、致孔劑乙酸乙酯1.5份、水15份，升溫至75℃進(jìn)行反應(yīng)4h，反應(yīng)結(jié)束后，將固態(tài)物依次用乙醇和水洗滌之后，真空干燥、粉碎后，得到除脂樹(shù)脂。
實(shí)施例2
第1步，組織破碎：將鯽魚(yú)魚(yú)皮解凍之后，加入水，使魚(yú)皮與水的重量比在10：1，將混合物進(jìn)行粉碎和研磨，在粉碎和研磨的同時(shí)外加超聲作用，得到漿料；
第2步，去除鹽溶性雜質(zhì)：將漿料與10wt%nacl溶液混合，漿料與nacl溶液重量比1：10，攪拌均勻后浸泡，浸泡時(shí)間是30h，再經(jīng)過(guò)離心處理，去除上清，得到第一沉淀；
第3步，去除脂類(lèi)和堿溶性雜質(zhì)：將第一沉淀與5wt%naoh溶液混合，第一沉淀與堿溶液重量比1：12，攪拌均勻后浸泡，浸泡時(shí)間35h，再經(jīng)過(guò)離心處理，去除上清，得到第二沉淀；
第4步，去除酸溶性雜質(zhì)：將第二沉淀與12wt%檸檬酸溶液混合，第二沉淀與酸溶液重量比1：8，攪拌均勻后浸泡，浸泡時(shí)間是10h，再經(jīng)過(guò)離心處理，去除上清，得到第三沉淀；
第5步，酶解處理：第三沉淀與水混合，第三沉淀與水的重量比是1：35，再加入第三沉淀重量5%的木瓜蛋白酶進(jìn)行酶解，酶解溫度是45℃，酶解時(shí)間是10h，酶解過(guò)程中通過(guò)hcl或者naoh控制反應(yīng)液ph在4～5，反應(yīng)結(jié)束后在95℃下處理15min滅酶，經(jīng)過(guò)離心后，取上清液得到粗提物；
第6步，樹(shù)脂除脂處理：粗提物送入除脂樹(shù)脂床層中進(jìn)行吸附處理，得到除脂液，樹(shù)脂的體積是粗提物體積的1/20，粗提物的流速是5bv/h，吸附過(guò)程溫度是35℃；
第7步，精制處理：除脂液中加固體nacl，使nacl濃度為1.5mol/l，冷凍離心得鹽析后的膠原蛋白沉淀；再用1.5mol/l的醋酸對(duì)膠原沉淀物復(fù)溶后裝袋透析除去鹽離子，冷凍干燥得到精制魚(yú)膠原蛋白。
所述的第6步中，除脂樹(shù)脂的制備方法是：按重量份計(jì)，在反應(yīng)釜中加入微晶纖維素15份、水200份、分散劑聚乙烯醇1份，加熱并攪拌均勻；再在氮?dú)鈿夥障拢尤爰谆┧岫□?0份、甲基丙烯酸縮水甘油酯(gma)4份、交聯(lián)劑乙二胺0.6份、致孔劑乙酸乙酯3份、水20份，升溫至85℃進(jìn)行反應(yīng)8h，反應(yīng)結(jié)束后，將固態(tài)物依次用乙醇和水洗滌之后，真空干燥、粉碎后，得到除脂樹(shù)脂。
實(shí)施例3
第1步，組織破碎：將鯽魚(yú)魚(yú)皮解凍之后，加入水，使魚(yú)皮與水的重量比在10：0.6，將混合物進(jìn)行粉碎和研磨，在粉碎和研磨的同時(shí)外加超聲作用，得到漿料；
第2步，去除鹽溶性雜質(zhì)：將漿料與6wt%nacl溶液混合，漿料與nacl溶液重量比1：7，攪拌均勻后浸泡，浸泡時(shí)間是20h，再經(jīng)過(guò)離心處理，去除上清，得到第一沉淀；
第3步，去除脂類(lèi)和堿溶性雜質(zhì)：將第一沉淀與4wt%naoh溶液混合，第一沉淀與堿溶液重量比1：11，攪拌均勻后浸泡，浸泡時(shí)間26h，再經(jīng)過(guò)離心處理，去除上清，得到第二沉淀；
第4步，去除酸溶性雜質(zhì)：將第二沉淀與5～12wt%檸檬酸溶液混合，第二沉淀與酸溶液重量比1：6，攪拌均勻后浸泡，浸泡時(shí)間是8h，再經(jīng)過(guò)離心處理，去除上清，得到第三沉淀；
第5步，酶解處理：第三沉淀與水混合，第三沉淀與水的重量比是1：20，再加入第三沉淀重量3%的木瓜蛋白酶進(jìn)行酶解，酶解溫度是40℃，酶解時(shí)間是7h，酶解過(guò)程中通過(guò)hcl或者naoh控制反應(yīng)液ph在4～5，反應(yīng)結(jié)束后在92℃下處理10min滅酶，經(jīng)過(guò)離心后，取上清液得到粗提物；
第6步，樹(shù)脂除脂處理：粗提物送入除脂樹(shù)脂床層中進(jìn)行吸附處理，得到除脂液，樹(shù)脂的體積是粗提物體積的1/30，粗提物的流速是4bv/h，吸附過(guò)程溫度是25℃；
第7步，精制處理：除脂液中加固體nacl，使nacl濃度為1mol/l，冷凍離心得鹽析后的膠原蛋白沉淀；再用1mol/l的醋酸對(duì)膠原沉淀物復(fù)溶后裝袋透析除去鹽離子，冷凍干燥得到精制魚(yú)膠原蛋白。
所述的第6步中，除脂樹(shù)脂的制備方法是：按重量份計(jì)，在反應(yīng)釜中加入微晶纖維素12份、水170份、分散劑聚乙烯醇0.7份，加熱并攪拌均勻；再在氮?dú)鈿夥障?，加入甲基丙烯酸丁?份、甲基丙烯酸縮水甘油酯(gma)3份、交聯(lián)劑乙二胺0.5份、致孔劑乙酸乙酯2份、水17份，升溫至80℃進(jìn)行反應(yīng)7h，反應(yīng)結(jié)束后，將固態(tài)物依次用乙醇和水洗滌之后，真空干燥、粉碎后，得到除脂樹(shù)脂。
對(duì)照例1
與實(shí)施例3的區(qū)別在于：在樹(shù)脂除脂的制備中未加入單體甲基丙烯酸丁酯，其重量由甲基丙烯酸縮水甘油酯代替。
第1步，組織破碎：將鯽魚(yú)魚(yú)皮解凍之后，加入水，使魚(yú)皮與水的重量比在10：0.6，將混合物進(jìn)行粉碎和研磨，在粉碎和研磨的同時(shí)外加超聲作用，得到漿料；
第2步，去除鹽溶性雜質(zhì)：將漿料與6wt%nacl溶液混合，漿料與nacl溶液重量比1：7，攪拌均勻后浸泡，浸泡時(shí)間是20h，再經(jīng)過(guò)離心處理，去除上清，得到第一沉淀；
第3步，去除脂類(lèi)和堿溶性雜質(zhì)：將第一沉淀與4wt%naoh溶液混合，第一沉淀與堿溶液重量比1：11，攪拌均勻后浸泡，浸泡時(shí)間26h，再經(jīng)過(guò)離心處理，去除上清，得到第二沉淀；
第4步，去除酸溶性雜質(zhì)：將第二沉淀與5～12wt%檸檬酸溶液混合，第二沉淀與酸溶液重量比1：6，攪拌均勻后浸泡，浸泡時(shí)間是8h，再經(jīng)過(guò)離心處理，去除上清，得到第三沉淀；
第5步，酶解處理：第三沉淀與水混合，第三沉淀與水的重量比是1：20，再加入第三沉淀重量3%的木瓜蛋白酶進(jìn)行酶解，酶解溫度是40℃，酶解時(shí)間是7h，酶解過(guò)程中通過(guò)hcl或者naoh控制反應(yīng)液ph在4～5，反應(yīng)結(jié)束后在92℃下處理10min滅酶，經(jīng)過(guò)離心后，取上清液得到粗提物；
第6步，樹(shù)脂除脂處理：粗提物送入除脂樹(shù)脂床層中進(jìn)行吸附處理，得到除脂液，樹(shù)脂的體積是粗提物體積的1/30，粗提物的流速是4bv/h，吸附過(guò)程溫度是25℃；
第7步，精制處理：除脂液中加固體nacl，使nacl濃度為1mol/l，冷凍離心得鹽析后的膠原蛋白沉淀；再用1mol/l的醋酸對(duì)膠原沉淀物復(fù)溶后裝袋透析除去鹽離子，冷凍干燥得到精制魚(yú)膠原蛋白。
所述的第6步中，除脂樹(shù)脂的制備方法是：按重量份計(jì)，在反應(yīng)釜中加入微晶纖維素12份、水170份、分散劑聚乙烯醇0.7份，加熱并攪拌均勻；再在氮?dú)鈿夥障拢尤爰谆┧峥s水甘油酯(gma)6份、交聯(lián)劑乙二胺0.5份、致孔劑乙酸乙酯2份、水17份，升溫至80℃進(jìn)行反應(yīng)7h，反應(yīng)結(jié)束后，將固態(tài)物依次用乙醇和水洗滌之后，真空干燥、粉碎后，得到除脂樹(shù)脂。
對(duì)照例2
與實(shí)施例3的區(qū)別在于：在樹(shù)脂除脂的制備中未加入單體甲基丙烯酸縮水甘油酯，其重量由甲基丙烯酸丁酯代替。
第1步，組織破碎：將鯽魚(yú)魚(yú)皮解凍之后，加入水，使魚(yú)皮與水的重量比在10：0.6，將混合物進(jìn)行粉碎和研磨，在粉碎和研磨的同時(shí)外加超聲作用，得到漿料；
第2步，去除鹽溶性雜質(zhì)：將漿料與6wt%nacl溶液混合，漿料與nacl溶液重量比1：7，攪拌均勻后浸泡，浸泡時(shí)間是20h，再經(jīng)過(guò)離心處理，去除上清，得到第一沉淀；
第3步，去除脂類(lèi)和堿溶性雜質(zhì)：將第一沉淀與4wt%naoh溶液混合，第一沉淀與堿溶液重量比1：11，攪拌均勻后浸泡，浸泡時(shí)間26h，再經(jīng)過(guò)離心處理，去除上清，得到第二沉淀；
第4步，去除酸溶性雜質(zhì)：將第二沉淀與5～12wt%檸檬酸溶液混合，第二沉淀與酸溶液重量比1：6，攪拌均勻后浸泡，浸泡時(shí)間是8h，再經(jīng)過(guò)離心處理，去除上清，得到第三沉淀；
第5步，酶解處理：第三沉淀與水混合，第三沉淀與水的重量比是1：20，再加入第三沉淀重量3%的木瓜蛋白酶進(jìn)行酶解，酶解溫度是40℃，酶解時(shí)間是7h，酶解過(guò)程中通過(guò)hcl或者naoh控制反應(yīng)液ph在4～5，反應(yīng)結(jié)束后在92℃下處理10min滅酶，經(jīng)過(guò)離心后，取上清液得到粗提物；
第6步，樹(shù)脂除脂處理：粗提物送入除脂樹(shù)脂床層中進(jìn)行吸附處理，得到除脂液，樹(shù)脂的體積是粗提物體積的1/30，粗提物的流速是4bv/h，吸附過(guò)程溫度是25℃；
第7步，精制處理：除脂液中加固體nacl，使nacl濃度為1mol/l，冷凍離心得鹽析后的膠原蛋白沉淀；再用1mol/l的醋酸對(duì)膠原沉淀物復(fù)溶后裝袋透析除去鹽離子，冷凍干燥得到精制魚(yú)膠原蛋白。
所述的第6步中，除脂樹(shù)脂的制備方法是：按重量份計(jì)，在反應(yīng)釜中加入微晶纖維素12份、水170份、分散劑聚乙烯醇0.7份，加熱并攪拌均勻；再在氮?dú)鈿夥障?，加入甲基丙烯酸丁?份、交聯(lián)劑乙二胺0.5份、致孔劑乙酸乙酯2份、水17份，升溫至80℃進(jìn)行反應(yīng)7h，反應(yīng)結(jié)束后，將固態(tài)物依次用乙醇和水洗滌之后，真空干燥、粉碎后，得到除脂樹(shù)脂。
對(duì)照例3
與實(shí)施例3的區(qū)別在于：第1步中未加入超聲處理。
第1步，組織破碎：將鯽魚(yú)魚(yú)皮解凍之后，加入水，使魚(yú)皮與水的重量比在10：0.6，將混合物進(jìn)行粉碎和研磨，得到漿料；
第2步，去除鹽溶性雜質(zhì)：將漿料與6wt%nacl溶液混合，漿料與nacl溶液重量比1：7，攪拌均勻后浸泡，浸泡時(shí)間是20h，再經(jīng)過(guò)離心處理，去除上清，得到第一沉淀；
第3步，去除脂類(lèi)和堿溶性雜質(zhì)：將第一沉淀與4wt%naoh溶液混合，第一沉淀與堿溶液重量比1：11，攪拌均勻后浸泡，浸泡時(shí)間26h，再經(jīng)過(guò)離心處理，去除上清，得到第二沉淀；
第4步，去除酸溶性雜質(zhì)：將第二沉淀與5～12wt%檸檬酸溶液混合，第二沉淀與酸溶液重量比1：6，攪拌均勻后浸泡，浸泡時(shí)間是8h，再經(jīng)過(guò)離心處理，去除上清，得到第三沉淀；
第5步，酶解處理：第三沉淀與水混合，第三沉淀與水的重量比是1：20，再加入第三沉淀重量3%的木瓜蛋白酶進(jìn)行酶解，酶解溫度是40℃，酶解時(shí)間是7h，酶解過(guò)程中通過(guò)hcl或者naoh控制反應(yīng)液ph在4～5，反應(yīng)結(jié)束后在92℃下處理10min滅酶，經(jīng)過(guò)離心后，取上清液得到粗提物；
第6步，樹(shù)脂除脂處理：粗提物送入除脂樹(shù)脂床層中進(jìn)行吸附處理，得到除脂液，樹(shù)脂的體積是粗提物體積的1/30，粗提物的流速是4bv/h，吸附過(guò)程溫度是25℃；
第7步，精制處理：除脂液中加固體nacl，使nacl濃度為1mol/l，冷凍離心得鹽析后的膠原蛋白沉淀；再用1mol/l的醋酸對(duì)膠原沉淀物復(fù)溶后裝袋透析除去鹽離子，冷凍干燥得到精制魚(yú)膠原蛋白。
所述的第6步中，除脂樹(shù)脂的制備方法是：按重量份計(jì)，在反應(yīng)釜中加入微晶纖維素12份、水170份、分散劑聚乙烯醇0.7份，加熱并攪拌均勻；再在氮?dú)鈿夥障?，加入甲基丙烯酸丁?份、甲基丙烯酸縮水甘油酯(gma)3份、交聯(lián)劑乙二胺0.5份、致孔劑乙酸乙酯2份、水17份，升溫至80℃進(jìn)行反應(yīng)7h，反應(yīng)結(jié)束后，將固態(tài)物依次用乙醇和水洗滌之后，真空干燥、粉碎后，得到除脂樹(shù)脂。
得率測(cè)定
采用凱氏定氮法分別測(cè)定第5步得到的粗提物和精制魚(yú)膠原蛋白中的蛋白質(zhì)含量，折算為蛋白質(zhì)量，計(jì)算樹(shù)脂吸附得率，采用如下公式計(jì)算：
樹(shù)脂吸附得率=精制魚(yú)膠原蛋白中的蛋白質(zhì)含量×精制魚(yú)膠原蛋白重量/（粗提物中的蛋白質(zhì)含量粗提物重量）×100%。
從上表中可以看出，采用樹(shù)脂吸附脂類(lèi)雜質(zhì)時(shí)，可以保證有較多的蛋白透過(guò)樹(shù)脂，使魚(yú)膠原蛋白的攝取率較高；實(shí)施例3相對(duì)于對(duì)照例2來(lái)說(shuō)，通過(guò)在樹(shù)脂制備中加入甲基丙烯酸縮水甘油酯可以提高對(duì)蛋白的排斥力，避免樹(shù)脂吸附蛋白，使收率提高。
紫外光譜分析
采用紫外光譜分析所提膠原蛋白紫外吸收峰。用0.5m醋酸溶液溶解膠原蛋白樣品，配制成濃度1mg/ml的膠原溶液。在室溫下用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定吸光度。掃描波長(zhǎng)范圍200～400nm，波長(zhǎng)精度1nm。
以上實(shí)施例和對(duì)照例制備得到的魚(yú)膠原蛋白樣品的最大吸收波長(zhǎng)如下：
從上表中可以看出，最大吸收波長(zhǎng)峰均在230nm處，符合i型膠原的特征紫外吸收。其中，實(shí)施例13中的紫外光吸收曲線上無(wú)雜峰，顯示魚(yú)膠原蛋白純度較高。
氨基酸組成分析
膠原蛋白樣品的氨基酸組成采用高效液相色譜法測(cè)定。測(cè)定條件：sopiumaminoacidanalysis色譜柱，梯度洗脫，a相為ph=3.00的0.2mol/l檸檬酸鈉水溶液，b相為ph=9.80的0.2mol/l硼酸鈉水溶液，洗脫液流速0.4ml/min，柱溫為65℃。
羥基化率%=羥脯氨酸殘基數(shù)×100/（脯氨酸殘基數(shù)+羥脯氨酸殘基數(shù)）
溶解性測(cè)定
氮溶解指數(shù)（nsi）可以被用來(lái)確定蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物的溶解性。取0.01g/ml海鱸魚(yú)膠原蛋白肽溶液的上清液。采用全自動(dòng)凱氏定氮儀測(cè)定上清液和膠原蛋白肽樣品中的氮含量，得到其在各ph下的水溶性蛋白含量。繪制出nsi-ph曲線，作為不同組分膠原蛋白肽在不同ph下的溶解性指標(biāo)。
氮溶解指數(shù)nsi按下式計(jì)算：
nsi（%）=a/b×100%
其中，a為上清液中蛋白質(zhì)含量（g/g）；b為樣品中的總蛋白含量（g/g）。
不同的ph條件下的溶解性如圖1所示，從圖中可以看出，實(shí)施例1～3中制備得到的魚(yú)膠原蛋白具有較好的溶解性，說(shuō)明其中雜質(zhì)含量少。
溶解性數(shù)據(jù)如下表所示：
表中可以看出，實(shí)施例3相對(duì)于對(duì)照例1來(lái)說(shuō)，由于未采用甲基丙烯酸丁酯單體對(duì)微晶纖維素改性處理，使得其對(duì)于脂肪的吸附性較低，導(dǎo)致有較多的脂肪會(huì)存在于提取得到的蛋白中，使溶解性較差。而實(shí)施例3相對(duì)于對(duì)照例3來(lái)說(shuō)，由于沒(méi)有采用超聲對(duì)組織破碎過(guò)程進(jìn)行處理，導(dǎo)致脂肪在后續(xù)的酸堿、酶解處理過(guò)程中不能被去除，導(dǎo)致后續(xù)的樹(shù)脂除脂工藝負(fù)荷較大，不能完全將脂肪去除，從而導(dǎo)致溶解性較差。
脂肪含量測(cè)定
采用氯仿-甲醇提取法測(cè)定魚(yú)膠原蛋白中的脂肪含量，如果如下：
從表中可以看出，采用上述工藝得到的魚(yú)膠原蛋白具有較低的脂肪含量，實(shí)施例3相對(duì)于對(duì)照例1來(lái)說(shuō)，通過(guò)甲基丙烯酸丁酯單體對(duì)微晶纖維素改性處理可以有效地提高對(duì)脂肪的去除率；同樣地，采用超聲預(yù)處理可以減輕后續(xù)樹(shù)脂除脂工藝的負(fù)荷。