本發(fā)明涉及一種玉米二?；视王；D(zhuǎn)移酶及編碼該玉米二酰基甘油?；D(zhuǎn)移酶的基因。
背景技術(shù)：
：三酰甘油(triacylglyceroltriacylglycerol,tag)由非極性的甘油和脂肪酸組成，是植物油脂的主要組成部分，是植物體內(nèi)能量的主要儲(chǔ)存形式，同時(shí)也參與許多的生理生化過(guò)程。植物萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)的過(guò)程中三酰甘油作為碳源和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的主要供應(yīng)者。在多種植物中的研究表明，三酰甘油tag不但為種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)提供所需能量，在花粉發(fā)育和有性生殖過(guò)程中也發(fā)揮著重要作用。人類(lèi)日常生活當(dāng)中的食用油脂和化工產(chǎn)業(yè)的用油均以油料作物種子當(dāng)中所貯存的油類(lèi)為主要來(lái)源。全世界的植物油脂當(dāng)中大約有75％作為我們?nèi)粘Ｉ钪兴玫氖秤糜椭?，而且植物油脂包含多?shù)的單不飽和脂肪酸，例如油酸會(huì)比飽和脂肪酸的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值更高一些。營(yíng)養(yǎng)學(xué)和流行病學(xué)的相關(guān)研究表明，人們長(zhǎng)期的食用富含不飽和脂肪酸的食用油，可增加血液中高密度脂蛋白與低密度脂蛋白的比，從而起到降低人體血液中膽固醇，減少動(dòng)脈硬化的發(fā)生的作用。植物油脂的食用價(jià)值之外，植物油脂作為潛在的可再生的生物能源產(chǎn)品，應(yīng)用前景極其廣泛。植物油還是很多化工產(chǎn)品的重要原料，很多的脂肪酸例如月桂酸，斑鳩菊，芥酸在工業(yè)生產(chǎn)當(dāng)中有非常廣泛的應(yīng)用，根據(jù)統(tǒng)計(jì)，世界上每年應(yīng)用于化工生產(chǎn)和制藥產(chǎn)業(yè)當(dāng)中的植物油量非常巨大；約占植物油脂總產(chǎn)量的1/3。伴隨著世界人口的持續(xù)增長(zhǎng)和經(jīng)濟(jì)的飛速發(fā)展，使人們對(duì)植物油脂的需求量不斷提高，這也促使著人們不斷的尋找可以增加油料作物產(chǎn)油量的有效方法和便捷的途徑。玉米是全世界最重要的糧食作物之一，其品質(zhì)和產(chǎn)量對(duì)全球糧食產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有至關(guān)重要的影響。高油玉米和普通玉米相比，具有多方面的優(yōu)越性。由于玉米油當(dāng)中含有較高比例的不飽和脂肪酸和維生素等成分，使其具有軟化血管和降低血壓等作用；高油玉米的蛋白質(zhì)的含量、賴(lài)氨酸含量和類(lèi)胡蘿卜素含也非常的高，因而是一種非常理想的保健用油。玉米油當(dāng)中的特殊組分和成分不僅對(duì)人類(lèi)和單胃的動(dòng)物的營(yíng)養(yǎng)改進(jìn)具有重要的意義，同時(shí)在家禽動(dòng)物的飼養(yǎng)方面也發(fā)揮了重要的作用。其較高的營(yíng)養(yǎng)成分和重要作用使高油玉米從單純的糧食或飼料作物逐漸轉(zhuǎn)變成為了兼用作物。與此同時(shí)，玉米還有很高的生產(chǎn)潛力，每公頃的高油玉米的產(chǎn)量很可能超過(guò)多數(shù)的油料作物的產(chǎn)油量，與此同時(shí)，高油玉米當(dāng)中，其除油分以外的產(chǎn)品，無(wú)論是數(shù)量還是質(zhì)量都有可能多于其他多數(shù)的糧食作物。在我國(guó)市場(chǎng)當(dāng)中銷(xiāo)售的玉米油，大多數(shù)都是從國(guó)外進(jìn)口的，其高昂的價(jià)格導(dǎo)致玉米油在市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)中處于劣勢(shì)。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：三酰甘油tag的組裝是由kennedy于1961年發(fā)現(xiàn)首先發(fā)現(xiàn)的，因此被稱(chēng)為kennedy途徑。在發(fā)育的種子當(dāng)中，三酰甘油tag以甘油骨架上附連3個(gè)脂肪酸的形式而存在。在肯尼迪途徑當(dāng)中，在甘油的sn-1、sn-2和sn-3位點(diǎn)的順序依次加入脂酰coa最終形成三酰甘油tag：首先，sn-甘油-3-磷酸被甘油-3-磷酸脂酰轉(zhuǎn)移酶(gpat)?；?，然后由磷脂酸脂酰轉(zhuǎn)移酶(lpaat)催化產(chǎn)生磷脂酸(pa)，磷脂酸又被磷脂酸磷酸酯酶(pap)脫磷酸作用生成sn-1,2-甘油二酯(dag)，最后由二脂酰甘油?；D(zhuǎn)移酶(dgat)酰基化形成tag。三酰甘油生物合成主要在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上進(jìn)行，是膜結(jié)合類(lèi)的催化反應(yīng)；dgat基因編碼的二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶做為肯尼迪途徑之中唯一的一個(gè)限速酶；控制著三酰甘油合成的最后一步。因此該基因?qū)μ岣哂土献魑锏慕?jīng)濟(jì)效益有重要的作用。為了提高我國(guó)的玉米油產(chǎn)量，改善玉米油的市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力，本發(fā)明提供了一種玉米ii型二?；视王；D(zhuǎn)移酶及編碼該玉米ii型dgat的基因。本發(fā)明玉米ii型二?；视王；D(zhuǎn)移酶命名為zmdgat2.1，zmdgat2.1的氨基酸序列如seqidno：2所示。編碼上述玉米ii型二?；视王；D(zhuǎn)移酶的基因核苷酸序列如seqidno：1中核苷酸序列所示。本發(fā)明提供了一種玉米ii型二?；视王；D(zhuǎn)移酶(zmdgat2.1)及其dna片段為調(diào)控玉米油脂生成，提高玉米油脂產(chǎn)量和質(zhì)量奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。本發(fā)明有助于揭示玉米dgat基因在玉米生長(zhǎng)發(fā)育及響應(yīng)非生物脅迫過(guò)程中的作用，深入了解玉米dgat基因的功能，為玉米分子育種提供新的基因資源和理論依據(jù)。附圖說(shuō)明圖1是具體實(shí)施方式一低溫處理實(shí)驗(yàn)中zmdgat2.1基因在不同時(shí)間點(diǎn)葉片中表達(dá)分析的實(shí)時(shí)熒光定量pcr測(cè)試圖。圖2是具體實(shí)施方式一低溫處理實(shí)驗(yàn)中zmdgat2.1基因在不同時(shí)間點(diǎn)根系中表達(dá)分析的實(shí)時(shí)熒光定量pcr測(cè)試圖。圖3是具體實(shí)施方式一nacl處理實(shí)驗(yàn)中zmdgat2.1基因在不同時(shí)間點(diǎn)葉片中表達(dá)分析的實(shí)時(shí)熒光定量pcr測(cè)試圖。圖4是具體實(shí)施方式一nacl處理實(shí)驗(yàn)中zmdgat2.1基因在不同時(shí)間點(diǎn)根系中表達(dá)分析的實(shí)時(shí)熒光定量pcr測(cè)試圖。圖5是具體實(shí)施方式一nahco3處理實(shí)驗(yàn)中zmdgat2.1基因在不同時(shí)間點(diǎn)葉片中表達(dá)分析的實(shí)時(shí)熒光定量pcr測(cè)試圖。圖6是具體實(shí)施方式一nahco3處理實(shí)驗(yàn)中zmdgat2.1基因在不同時(shí)間點(diǎn)根系中表達(dá)分析的實(shí)時(shí)熒光定量pcr測(cè)試圖。圖7是具體實(shí)施方式一aba處理實(shí)驗(yàn)中zmdgat2.1基因在不同時(shí)間點(diǎn)葉片中表達(dá)分析的實(shí)時(shí)熒光定量pcr測(cè)試圖。圖8是具體實(shí)施方式一aba處理實(shí)驗(yàn)中zmdgat2.1基因在不同時(shí)間點(diǎn)根系中表達(dá)分析的實(shí)時(shí)熒光定量pcr測(cè)試圖。圖9是具體實(shí)施方式一peg處理實(shí)驗(yàn)中zmdgat2.1基因在不同時(shí)間點(diǎn)葉片中表達(dá)分析的實(shí)時(shí)熒光定量pcr測(cè)試圖。圖10是具體實(shí)施方式一peg處理實(shí)驗(yàn)中zmdgat2.1基因在不同時(shí)間點(diǎn)根系中表達(dá)分析的實(shí)時(shí)熒光定量pcr測(cè)試圖。圖11是具體實(shí)施方式一zmdgat2.1基因在不同玉米組織中的qrt-pcr分析結(jié)果圖。圖12是具體實(shí)施方式一玉米zmdgat2.1基因酶學(xué)功能實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖。具體實(shí)施方式具體實(shí)施方式一：玉米ii型二?；视王；D(zhuǎn)移酶命名為zmdgat2.1，zmdgat2.1的氨基酸序列如seqidno：2所示。編碼zmdgat2.1的基因核苷酸序列如seqidno：1中核苷酸序列所示。本實(shí)施方式zmdgat2.1全長(zhǎng)由1314bp組成，含有437個(gè)氨基酸，大小為48.6kda，等電點(diǎn)為10.6。zmdgat蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)均包含4種構(gòu)象，為α-螺旋(alphahelix)、延伸鏈(extendedstrand)、β-折疊(betaturn)和無(wú)規(guī)則卷曲(randomcoil)，且這4種構(gòu)象貫穿了整個(gè)氨基酸鏈。zmdgat2.1的α-螺旋包含92個(gè)氨基酸，占25.63％；延伸鏈含有92個(gè)氨基酸，占21.05％；β-折疊含有48個(gè)氨基酸，占10.98％；無(wú)規(guī)則卷曲含有185個(gè)氨基酸，占42.23％。zmdgat2.1基因的啟動(dòng)子區(qū)域包含ltr和myb結(jié)合元件；zmdgat2.1包含4個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域。本實(shí)施方式采用trizol(invitrogen公司)法提取玉米組織部位的總rna，具體步驟如下：a.將研缽及105℃高溫2h后的玉米組織，放入-20℃中半小時(shí)，向離心管中加入1mltrizolrna提取液，取大約100mg液氮冷凍迅速三次研磨后的玉米組織加入離心管中，顛倒混勻；置于-80℃的冰箱內(nèi)30min，以使玉米組織部位的rna充分裂解釋放。b.將裂解液取出，置于冰上至其融化后，加入200μl的氯仿，充分混勻，靜置15min，12000r/min，4℃離心15min；取上清液約300μl移入新的離心管，然后加入等體積的異丙醇，震蕩混勻后置于-20℃冰箱內(nèi)2h，取出后，12000r/min4℃離心15min；c.緩慢倒掉異丙醇，12000r/min4℃離心15min后將液體倒凈，可見(jiàn)管底有少量膠狀沉淀產(chǎn)生；在沉淀中加入1ml70％的乙醇溶液(含depc)洗滌rna沉淀，將rna沉淀輕輕彈起，充分混勻；d.1200rpm4℃離心10min，倒掉離心管內(nèi)的乙醇溶液，將離心管置于工作臺(tái)室溫晾數(shù)分鐘，直到管內(nèi)乙醇完全揮發(fā)；e.用50μl1％depc溶解rna，并用微量分光光度計(jì)檢測(cè)檢測(cè)rna濃度，利用凝膠電泳檢測(cè)rna質(zhì)量。反轉(zhuǎn)錄：參照invitrogen公司的試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。反轉(zhuǎn)錄得到的cdna用內(nèi)參基因18srrna進(jìn)行擴(kuò)增驗(yàn)證其質(zhì)量，內(nèi)參引物序列為：18s-f：agtttgaggcaataacaggtct；18s-r：gatgaaatttcccaagattacc。基因全長(zhǎng)pcr擴(kuò)增：以玉米根系cdna為模板進(jìn)行pcr擴(kuò)增，并在c端插入增強(qiáng)子。pcr上游引物f1：5’-agaatggggctggcagtggcgg-3’；下游引物r1：5’-tcaaagaactcttaactgaagatcaggg-3’。pcr反應(yīng)體系：10×pcrbuffer2μl2mmdntps2μl25mmmgcl21.6μl模板1μlprimerf1μlprimerr1μlkod-plus0.4μlpcr-gradewater11μlpcr反應(yīng)程序：預(yù)變性94℃2min；35個(gè)循環(huán)：94℃、15s，55℃、30s，68℃、2min。利用基因全長(zhǎng)克隆方法，運(yùn)用相同溶液比例的體系和反應(yīng)條件，擴(kuò)大反應(yīng)體系，進(jìn)行pcr產(chǎn)物富集，本實(shí)施方式采用購(gòu)自天根生物技術(shù)公司的膠回收試劑盒(dp210)進(jìn)行產(chǎn)物富集。然后測(cè)序，獲得核苷酸序列如seqidno：1所示。表達(dá)載體構(gòu)建由于kod高保真酶克隆出全長(zhǎng)的產(chǎn)物為平末端，連接t載體和酵母表達(dá)載體(pyes2.1)的連接方式均是粘性末端連接的方式，因此在構(gòu)建載體之前對(duì)pcr富集產(chǎn)物進(jìn)行加a，按照以下體系進(jìn)行混合：pcr產(chǎn)物15μldatp4μltaqdnapolymerase1μl將混合體系置于72℃的條件下反應(yīng)20～30min。構(gòu)建表達(dá)載體：用克隆到的玉米zmdgat2.1基因的全長(zhǎng)編碼區(qū)構(gòu)建酵母表達(dá)載體在酵母中進(jìn)行異源表達(dá)。玉米zmdgat2.1基因全長(zhǎng)cds的pcr產(chǎn)物片段與載體進(jìn)行連接的方式是通過(guò)粘性末端連接。反應(yīng)體系及反應(yīng)條件如下：將反應(yīng)體系溫和混合充分置于室溫(22～30℃)30min，反應(yīng)結(jié)束立即置于冰上或放于-20℃條件下保存。大腸桿菌轉(zhuǎn)化：a.加入2μl的酵母表達(dá)體系混合物于50μl的感受態(tài)細(xì)胞當(dāng)中，冰浴30min。b.于42℃水浴當(dāng)中熱激30s，結(jié)束后立刻置于冰上。c.加入250μl的室溫的soc培養(yǎng)基，置于37℃，200rpm條件下?lián)u1h。d.涂不同體積(10μl，50μl，100μl)的菌液于選擇培養(yǎng)基上，37℃條件下過(guò)夜培養(yǎng)。e.挑取10個(gè)單菌落，利用載體兩端引物和基因的引物對(duì)菌落進(jìn)行陽(yáng)性菌落的驗(yàn)證.將驗(yàn)證成功的陽(yáng)性菌落進(jìn)行質(zhì)粒提取，并進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序成功進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)，本實(shí)施方式采用購(gòu)自天根生物技術(shù)公司的質(zhì)粒提取試劑盒(dp105)進(jìn)行質(zhì)粒的提取。并且利用載體的正向引物與基因的反向引物，載體的反向引物與基因的正向引物對(duì)基因片段插入方向進(jìn)行驗(yàn)證，并利用基因的正反向引物利用pcr試驗(yàn)方法進(jìn)一步證實(shí)進(jìn)行驗(yàn)證載體連接是否成功。半乳糖誘導(dǎo)玉米zmdgat2.1基因在酵母當(dāng)中的表達(dá)：由于半乳糖可以誘導(dǎo)包含gal1啟動(dòng)子的目標(biāo)蛋白的表達(dá)，將已經(jīng)以葡萄糖為碳源生長(zhǎng)的菌液離心，去除上清，換新的培養(yǎng)基并加入半乳糖以誘導(dǎo)目標(biāo)蛋白表達(dá)，重組蛋白質(zhì)可以在半乳糖誘導(dǎo)后不到4h內(nèi)檢測(cè)。可以在2h內(nèi)在含棉子糖由半乳糖誘導(dǎo)培養(yǎng)的細(xì)胞中檢測(cè)到蛋白質(zhì)的形成。具體操作步驟如下：a.挑取缺陷型釀酒酵母菌株h1246的單菌落，于10ml的ypd培養(yǎng)基當(dāng)中，30℃，150rpm條件下過(guò)夜培養(yǎng)。b.測(cè)定過(guò)夜培養(yǎng)菌液的od600的值，將過(guò)夜培養(yǎng)菌液的od600的值調(diào)整為每50ml誘導(dǎo)培養(yǎng)基為0.4，繼續(xù)在30℃，150rpm條件下?lián)u菌2～4h。c.在2500rpm室溫條件下離心使酵母細(xì)胞聚于管底，去上清，用40ml1×te重懸細(xì)胞，用2ml的1×liac/0.5×te重懸酵母細(xì)胞。d.將酵母細(xì)胞于室溫條件下放置10min。e.每個(gè)轉(zhuǎn)化內(nèi)加入1μgzmdgat2.1/pyes2.1質(zhì)粒和100μg的變性的鮭魚(yú)精dna和100μl步驟d中的酵母懸浮液。f.在混合液當(dāng)中加入700μl的1×liac/40％peg-3350/1×te充分混合；將反應(yīng)體系置于30℃條件下30min后加入88μldmso與反應(yīng)體系充分混合，在42℃條件下培養(yǎng)7min，離心機(jī)瞬離10s，去上清。g.將細(xì)胞用1ml的1×te重懸后離心去上清。h.重懸細(xì)胞于50～100μl的1×te當(dāng)中涂板，于30℃條件下進(jìn)行培養(yǎng)。酶學(xué)功能實(shí)驗(yàn)：陷型釀酒酵母菌株h1246完全喪失形成脂類(lèi)的功能，將玉米zmdgat2.1基因轉(zhuǎn)入到缺陷型釀酒酵母菌株h1246菌株中，通過(guò)提取轉(zhuǎn)基因菌株的脂類(lèi)，觀察酵母菌株是否具有形成脂類(lèi)的功能，進(jìn)而說(shuō)明玉米zmdgat2.1基因的酶學(xué)功能：a.分別挑取玉米zmdgat2.1的轉(zhuǎn)基因菌株的單菌落、擬南芥dgat1基因的轉(zhuǎn)基因菌株的單菌落(陽(yáng)性對(duì)照)、含藻類(lèi)dgat2基因的轉(zhuǎn)基因菌株的單菌落(陽(yáng)性對(duì)照)、含空載體的轉(zhuǎn)基因菌株的單菌落(陰性對(duì)照)、陷型釀酒酵母菌株h1246的單菌落(陰性對(duì)照)于5ml的ypd液體培養(yǎng)基當(dāng)中，30℃，150rpm條件下，過(guò)夜培養(yǎng)。b.第二天取一定體積的菌液于室溫，2000rpm條件下離心3min，去上清，加入20ml的sc(含葡萄糖和棉籽糖)，繼續(xù)過(guò)夜搖菌。c.取一定體積的菌液離心去上清，用1～2ml的sc(含10％棉籽糖和10％半乳糖)沖洗菌液，將菌液加入到50ml的sc(含棉籽糖和半乳糖)，搖菌18～36h；離心菌液，去上清，用1ml滅菌的去離子水進(jìn)行沖洗，離心去上清。d.在收集的菌液當(dāng)中加入1ml的甲醇溶液，加入0.5ml的玻璃珠，利用細(xì)胞破碎儀，力度10，破碎10min。e.將混合液轉(zhuǎn)移到玻璃管當(dāng)中，加入2ml的氯仿和1ml的氯仿：甲醇(2：1)的混合液，和1ml的0.034％的mgcl2溶液，渦旋震蕩充分混勻。f.將體系于室溫，2000rpm，室溫條件下離心3min。g.取下層有機(jī)相于新管當(dāng)中，加入1ml的2m的kcl：甲醇＝4：1的混合液當(dāng)中，2000rpm，室溫條件下離心5min；然后取下層有機(jī)相置于一新管中，置于通風(fēng)櫥內(nèi)利用氮吹儀將其吹干。h.在吹干的管中加入200μl的氯仿：甲醇(2：1)的混合液當(dāng)中；點(diǎn)樣于層析膠板上，半小時(shí)后將其置于裝有己烷：乙醚：乙酸＝70：30：1混合液的層析缸內(nèi)，跑板45min左右，至層析液距層析板頂端1cm左右處，將板取出，置于通風(fēng)櫥內(nèi)晾6～8h。i.將充分晾干的層析膠板置于裝有固體碘的層析缸內(nèi)，觀看層析條帶，獲得酶學(xué)功能驗(yàn)證結(jié)果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)入了未連接基因片段的空載體的ev(emptyvector)作為陰性對(duì)照的菌體當(dāng)中，未見(jiàn)三酰甘油tag條帶生成；作為陽(yáng)性對(duì)照的過(guò)表達(dá)擬南芥dgat1基因的ad1菌株和過(guò)表達(dá)藻類(lèi)dgat2基因的td2菌株，在薄層液相色譜板上可以看到tag條帶的形成；過(guò)表達(dá)玉米zmdgat2.1基因的轉(zhuǎn)基因菌株，出現(xiàn)了清晰可見(jiàn)的tag條帶(如圖12所示)。因此證明，玉米zmdgat2.1基因具有形成脂類(lèi)的功能，且弱于擬南芥當(dāng)中dgat的酶活性，表明玉米zmdgat2.1基因具有在體外催化合成脂類(lèi)(tag)的功能。非生物脅迫實(shí)驗(yàn)：選取玉米自交系合344籽粒飽滿，大小一致的種子，用自來(lái)水沖洗干凈，采用10％naclo3消毒10min，蒸餾水洗凈，浸種12h后催芽，將種子放在培養(yǎng)箱中22℃暗培養(yǎng)24h，待種子長(zhǎng)出約1.5cm的根后，將種子種在打好孔的泡沫板，懸浮于種植1/2ms營(yíng)養(yǎng)液當(dāng)中，在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為22℃，16h光照/8h黑暗。在玉米幼苗長(zhǎng)到三葉一心期，進(jìn)行非生物脅迫處理，包括低溫處理(4℃)、nacl(200mmol·l-1)、nahco3處理(100mmol·l-1)、aba(100μmol·l-1)處理和干旱處理(20％peg6000)。分別在處理后0、12、24、48和72h取樣，每種處理選取3棵植株，取根和葉片組織各約200mg，液氮速凍后于-80℃保存。實(shí)時(shí)熒光定量pcr反應(yīng)在實(shí)時(shí)熒光定量pcr儀上進(jìn)行。反應(yīng)體系為：實(shí)時(shí)定量pcr反應(yīng)程序：預(yù)變性95℃3min；40個(gè)循環(huán)：95℃、60s，95℃、15s，55℃、30s，72℃、60s。每個(gè)樣品3次重復(fù)。用2-δδct方法展開(kāi)基因的相對(duì)表達(dá)量分析。上游引物f2：5’-tggcacaccattccccttcc-3’；下游引物r2：5’-ggactcttagatgaaggccaggat-3’。低溫處理實(shí)驗(yàn)：對(duì)玉米自交系合344的根葉進(jìn)行4℃的低溫處理，進(jìn)行實(shí)時(shí)定量分析，在玉米的葉部組織和根部組織當(dāng)中，zmdgat2.1基因表現(xiàn)出上調(diào)表達(dá)趨勢(shì)，zmdgat2.1基因在12h的表達(dá)量達(dá)到峰值，根部組織當(dāng)中zmdgat2.1基因在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均上調(diào)表達(dá)，zmdgat2.1基因在24h和72h上調(diào)表達(dá)，且在72h達(dá)到峰值，在低溫的脅迫下的其他時(shí)間點(diǎn)呈現(xiàn)下調(diào)表達(dá)的趨勢(shì)，zmdgat2.1基因在低溫脅迫處理?xiàng)l件下的不同組織部位和不同時(shí)期表現(xiàn)出不同的反應(yīng)，顯示了低溫脅迫過(guò)程的復(fù)雜機(jī)制(如圖1～2所示)。nacl處理實(shí)驗(yàn)：玉米的葉片組織和根部組織在nacl的脅迫處理下，在大部分的時(shí)間點(diǎn)上，葉片組織和根部組織中的zmdgat2.1基因均有顯著上調(diào)表達(dá)的趨勢(shì)，其中zmdgat2.1基因呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，其表達(dá)量在48h達(dá)到峰值；在玉米根部組織當(dāng)中，zmdgat2.1基因在多個(gè)時(shí)間點(diǎn)呈現(xiàn)上調(diào)表達(dá)趨勢(shì)，zmdgat2.1基因呈現(xiàn)波動(dòng)表達(dá)趨勢(shì)，且在12h的表達(dá)量達(dá)到了峰值(如圖3～4所示)。nahco3處理實(shí)驗(yàn)：當(dāng)玉米的根部組織和葉片組織接受堿脅迫的時(shí)候，玉米的zmdgat2.1基因在根和葉中的受誘導(dǎo)機(jī)制和程度不同，在葉片組織當(dāng)中zmdgat2.1基因在48和72h均有上調(diào)趨勢(shì)，但是兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)zmdgat2.1基因的表達(dá)量存在差異，zmdgat2.1基因在48h和72h的表達(dá)量呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢(shì)，72h的表達(dá)量約為48h的2倍。在堿脅迫的根部組織當(dāng)中，zmdgat2.1基因在各時(shí)間點(diǎn)呈現(xiàn)上調(diào)表達(dá)的趨勢(shì)，zmdgat2.1基因的表達(dá)量呈現(xiàn)先生后降的趨勢(shì)，且在12h時(shí)間點(diǎn)表達(dá)量達(dá)到峰值，顯著高于其他時(shí)間點(diǎn)上調(diào)表達(dá)量(如圖5～6所示)。aba處理實(shí)驗(yàn)：在玉米的葉片組織和根部組織中，經(jīng)受aba脅迫條件下，zmdgat2.1基因在不同時(shí)間點(diǎn)呈現(xiàn)上調(diào)表達(dá)的趨勢(shì)，在葉片組織中，受到aba脅迫時(shí)，zmdgat2.1基因在12h時(shí)間點(diǎn)的上調(diào)趨勢(shì)相比于其他時(shí)間點(diǎn)最為明顯，在其他時(shí)間點(diǎn)表達(dá)量較低；且在24h、72h均無(wú)上調(diào)表達(dá)趨勢(shì)，在24h時(shí)間點(diǎn)，zmdgat2.1基因無(wú)上調(diào)表達(dá)趨勢(shì)，在根部組織當(dāng)中，zmdgat2.1基因同樣被aba脅迫誘導(dǎo)，zmdgat2.1基因在24h表達(dá)最高，在6h上調(diào)表達(dá)量次之，在其他時(shí)間點(diǎn)均無(wú)上調(diào)表達(dá)趨勢(shì)。zmdgat2.1基因在受aba脅迫的條件下受誘導(dǎo)，表明zmdgat2.1基因在參與aba激素脅迫過(guò)程當(dāng)中具有重要的作用(如圖7～8所示)。peg處理實(shí)驗(yàn)：在玉米的葉片組織和根部組織當(dāng)中，在經(jīng)受干旱脅迫下，葉片中zmdgat2.1基因在12和48h有明顯上調(diào)的趨勢(shì)，在其他時(shí)間點(diǎn)無(wú)上調(diào)趨勢(shì)，在根中zmdgat2.1基因的上調(diào)明顯，且在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均有上調(diào)趨勢(shì)，zmdgat2.1基因在受脅迫的早期表達(dá)量比較高，6h時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)量達(dá)到峰值，12h時(shí)間點(diǎn)表達(dá)量次之，zmdgat2.1基因表達(dá)量逐漸降低；zmdgat2.1基因在干旱脅迫當(dāng)中的表現(xiàn)表明，其在調(diào)控作物對(duì)干旱逆境環(huán)境的響應(yīng)顯著，但響應(yīng)機(jī)制存在差異，對(duì)作物抵抗逆境脅迫具有重要作用(如圖9～10所示)。不同玉米組織qrt-pcr分析：對(duì)玉米不同的生育時(shí)期樣品進(jìn)行取樣，取樣時(shí)期分別為幼苗期、拔節(jié)期、灌漿前胚乳、大喇叭口期和種子期。樣品液氮速凍于-80℃保存，進(jìn)行rna提取，反轉(zhuǎn)錄成cdna，進(jìn)行qrt-pcr，實(shí)驗(yàn)方法同上。實(shí)時(shí)定量結(jié)果顯示，玉米dgat2.1基因在灌漿前的胚乳當(dāng)中表達(dá)較高；是幼苗期的28倍；是拔節(jié)期的19倍；是大喇叭口期的11倍；是種子時(shí)期的24倍(如圖11所示)?？梢?jiàn)相同基因在不同組織部位的表達(dá)水平也存在差異，說(shuō)明在基因完成其功能的過(guò)程當(dāng)中，是一個(gè)極其復(fù)雜的過(guò)程，其作用機(jī)制還有待研究和證實(shí)。玉米dgat2.1基因根據(jù)玉米數(shù)據(jù)庫(kù)下載的cds序列設(shè)計(jì)全長(zhǎng)引物，經(jīng)過(guò)梯度pcr和更換pcr酶等實(shí)驗(yàn)方法的嘗試并未獲得基因全長(zhǎng)，因此根據(jù)orf(openreadingframe)開(kāi)放閱讀框預(yù)測(cè)結(jié)果，選擇第二個(gè)翻譯起始位點(diǎn)進(jìn)行基因全長(zhǎng)的克隆，克隆出長(zhǎng)度為1002bp的基因片段(如seqidno：3所示)。驗(yàn)證結(jié)果顯示：所選菌落均包含連接成功且方向正確的酵母表達(dá)載體。zmdgat2.1驗(yàn)證產(chǎn)物長(zhǎng)度為1002bp。選取1-2個(gè)陽(yáng)性zmdgat2.1/pyes2.1酵母表達(dá)載體送去測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序分析，測(cè)序結(jié)果正確。經(jīng)過(guò)驗(yàn)證的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到陷型釀酒酵母菌株h1246菌株進(jìn)行異源表達(dá)。結(jié)果表明，zmdgat2.1基因的表達(dá)能夠恢復(fù)酵母突變體形成脂類(lèi)的表型，說(shuō)明zmdgat2.1基因編碼的蛋白具有合成脂類(lèi)的酶學(xué)功能。zmdgat2.1在胚乳形成期間發(fā)育較高；在本發(fā)明的基礎(chǔ)上，利用植物中dgat同源基因的時(shí)空表達(dá)特異性和功能差異，對(duì)其進(jìn)行分別調(diào)控，對(duì)實(shí)現(xiàn)精確調(diào)控高等植物種子油脂合成途徑具有重要意義。zmdgat2.1對(duì)多種非生物脅迫處理有響應(yīng)，說(shuō)明其在作物對(duì)逆境脅迫的抗性方面有一定的作用，可以豐富作物抗逆育種的基因資源。序列表<110>黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)<120>一種玉米ii型二酰基甘油?；D(zhuǎn)移酶及編碼該玉米ii型dgat的基因<130>zmdgat2.1<141>2017-06-30<160>9<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>1314<212>dna<213>zeamays<400>1atggggctggcagtggcggtgggcaggcggccgacgcagcggtccggtgtctcccgttct60cgctgcgctggcaagagacccactgccgccgagccccgacaccaccggcaccgcacggag120ggaagaaaagaaagaaatcccgggggatcacgtcgttatcagcgaccagattcagacgcg180agccgagcgggggaggcggaccacactagaactagaaccctctctacggctctactacgc240tacgccccatcccgcccggaccggaccggacccaccttcctccacctctctgcccgccgc300cggccgacccgaatgggggcgggaaccaataatggcctgagcaacggcgccgccgcaggg360cagcgcgcggacgacgggaccacggtgttccggggcacggcgtactcgccgctacggacc420acggtggcgctcgcgctgtggctcggggccatccacttcaacgccttcctcgtcctcgcc480tcgctcttcctcttcccgcgccgcgtcgccgcactggtgctggcgacgcagctcttcttc540atgttcctgccgctcagtgataagagcagactgggccgcaagatcgccaggttcataagc600aagtacgtcattgggtattttcccgtcactttgcacgtggaagactatggcgcctttgat660cccaacagggcttatgtgttcggttatgagcctcattctgttttgcccatagctgttggg720atcctcggggaccttgttggattcatgccgctaccaaagatgaagattcttgcaagcagt780gcggtgttctacaccccgttcctaaggcaaatatggacatggttggggttggctcctgcg840tcgagaaagagtttctactcctaccttggagctggttatagctgtattatagtgccagga900ggtgtgcaggaaatacttcatatggatcatgattcagaggttgcttttcttaaaccaaga960aaaggttttgttaagatagctattgagatgggttgccctgtagtccccgtttttgctttc1020ggacagagctatgtttacaaatggtggaggccaggtggcaagttaattgtcaagattgct1080agagcaatcaaattttctccaataatcttctggggaaaactggggactcccatccctttt1140gcaacaccaatgcatgtgattgttggaaggccaattgaggttgtaaagaatcctcaacct1200accattgatgagataaaccaagtccacggacagttcgttgttgcgatgcaagatctgttc1260gagaaatacaagagcagaactggataccctgatcttcagttaagagttctttga1314<210>2<211>437<212>prt<213>zeamays<400>2metglyleualavalalavalglyargargprothrglnargsergly151015valserargserargcysalaglylysargprothralaalaglupro202530arghishisarghisargthrgluglyarglysgluargasnprogly354045glyserargargtyrglnargproaspseraspalaserargalagly505560glualaasphisthrargthrargthrleuserthralaleuleuarg65707580tyralaproserargproaspargthrglyprothrpheleuhisleu859095seralaargargargprothrargmetglyalaglythrasnasngly100105110leuserasnglyalaalaalaglyglnargalaaspaspglythrthr115120125valpheargglythralatyrserproleuargthrthrvalalaleu130135140alaleutrpleuglyalailehispheasnalapheleuvalleuala145150155160serleupheleupheproargargvalalaalaleuvalleualathr165170175glnleuphephemetpheleuproleuserasplysserargleugly180185190arglysilealaargpheileserlystyrvalileglytyrphepro195200205valthrleuhisvalgluasptyrglyalapheaspproasnargala210215220tyrvalpheglytyrgluprohisservalleuproilealavalgly225230235240ileleuglyaspleuvalglyphemetproleuprolysmetlysile245250255leualaserseralavalphetyrthrpropheleuargglniletrp260265270thrtrpleuglyleualaproalaserarglysserphetyrsertyr275280285leuglyalaglytyrsercysileilevalproglyglyvalglnglu290295300ileleuhismetasphisaspsergluvalalapheleulysproarg305310315320lysglyphevallysilealaileglumetglycysprovalvalpro325330335valphealapheglyglnsertyrvaltyrlystrptrpargprogly340345350glylysleuilevallysilealaargalailelyspheserproile355360365ilephetrpglylysleuglythrproileprophealathrpromet370375380hisvalilevalglyargproilegluvalvallysasnproglnpro385390395400thrileaspgluileasnglnvalhisglyglnphevalvalalamet405410415glnaspleupheglulystyrlysserargthrglytyrproaspleu420425430glnleuargvalleu435<210>3<211>1002<212>dna<213>zeamays<400>3atgggggcgggaaccaataatggcctgagcaacggcgccgccgcagggcagcgcgcggac60gacgggaccacggtgttccggggcacggcgtactcgccgctacggaccacggtggcgctc120gcgctgtggctcggggccatccacttcaacgccttcctcgtcctcgcctcgctcttcctc180ttcccgcgccgcgtcgccgcactggtgctggcgacgcagctcttcttcatgttcctgccg240ctcagtgataagagcagactgggccgcaagatcgccaggttcataagcaagtacgtcatt300gggtattttcccgtcactttgcacgtggaagactatggcgcctttgatcccaacagggct360tatgtgttcggttatgagcctcattctgttttgcccatagctgttgggatcctcggggac420cttgttggattcatgccgctaccaaagatgaagattcttgcaagcagtgcggtgttctac480accccgttcctaaggcaaatatggacatggttggggttggctcctgcgtcgagaaagagt540ttctactcctaccttggagctggttatagctgtattatagtgccaggaggtgtgcaggaa600atacttcatatggatcatgattcagaggttgcttttcttaaaccaagaaaaggttttgtt660aagatagctattgagatgggttgccctgtagtccccgtttttgctttcggacagagctat720gtttacaaatggtggaggccaggtggcaagttaattgtcaagattgctagagcaatcaaa780ttttctccaataatcttctggggaaaactggggactcccatcccttttgcaacaccaatg840catgtgattgttggaaggccaattgaggttgtaaagaatcctcaacctaccattgatgag900ataaaccaagtccacggacagttcgttgttgcgatgcaagatctgttcgagaaatacaag960agcagaactggataccctgatcttcagttaagagttctttga1002<210>4<211>22<212>dna<213>artificialsequence<220><223>反轉(zhuǎn)錄內(nèi)參上游引物18s-f。<400>4agtttgaggcaataacaggtct22<210>5<211>22<212>dna<213>artificialsequence<220><223>反轉(zhuǎn)錄內(nèi)參下游引物18s-r。<400>5gatgaaatttcccaagattacc22<210>6<211>22<212>dna<213>artificialsequence<220><223>基因全長(zhǎng)pcr擴(kuò)增上游引物f1。<400>6agaatggggctggcagtggcgg22<210>7<211>28<212>dna<213>artificialsequence<220><223>基因全長(zhǎng)pcr擴(kuò)增下游引物r1。<400>7tcaaagaactcttaactgaagatcaggg28<210>8<211>20<212>dna<213>artificialsequence<220><223>實(shí)時(shí)定量pcr上游引物f2。<400>8tggcacaccattccccttcc20<210>9<211>24<212>dna<213>artificialsequence<220><223>實(shí)時(shí)定量pcr下游引物r2。<400>9ggactcttagatgaaggccaggat24當(dāng)前第1頁(yè)12