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      一種玉米II型二?;视王;D(zhuǎn)移酶及編碼該玉米II型DGAT的基因的制作方法

      文檔序號(hào):11400616閱讀:347來(lái)源:國(guó)知局
      一種玉米II型二?;视王;D(zhuǎn)移酶及編碼該玉米II型DGAT的基因的制造方法與工藝
      本發(fā)明涉及一種玉米二?;视王;D(zhuǎn)移酶及編碼該玉米二?;视王;D(zhuǎn)移酶的基因。
      背景技術(shù)
      :三酰甘油(triacylglyceroltriacylglycerol,tag)由非極性的甘油和脂肪酸組成,是植物油脂的主要組成部分,是植物體內(nèi)能量的主要儲(chǔ)存形式,同時(shí)也參與許多的生理生化過(guò)程。植物萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)的過(guò)程中三酰甘油作為碳源和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的主要供應(yīng)者。在多種植物中的研究表明,三酰甘油tag不但為種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)提供所需能量,在花粉發(fā)育和有性生殖過(guò)程中也發(fā)揮著重要作用。人類(lèi)日常生活當(dāng)中的食用油脂和化工產(chǎn)業(yè)的用油均以油料作物種子當(dāng)中所貯存的油類(lèi)為主要來(lái)源。全世界的植物油脂當(dāng)中大約有75%作為我們?nèi)粘I钪兴玫氖秤糜椭?,而且植物油脂包含多?shù)的單不飽和脂肪酸,例如油酸會(huì)比飽和脂肪酸的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值更高一些。營(yíng)養(yǎng)學(xué)和流行病學(xué)的相關(guān)研究表明,人們長(zhǎng)期的食用富含不飽和脂肪酸的食用油,可增加血液中高密度脂蛋白與低密度脂蛋白的比,從而起到降低人體血液中膽固醇,減少動(dòng)脈硬化的發(fā)生的作用。植物油脂的食用價(jià)值之外,植物油脂作為潛在的可再生的生物能源產(chǎn)品,應(yīng)用前景極其廣泛。植物油還是很多化工產(chǎn)品的重要原料,很多的脂肪酸例如月桂酸,斑鳩菊,芥酸在工業(yè)生產(chǎn)當(dāng)中有非常廣泛的應(yīng)用,根據(jù)統(tǒng)計(jì),世界上每年應(yīng)用于化工生產(chǎn)和制藥產(chǎn)業(yè)當(dāng)中的植物油量非常巨大;約占植物油脂總產(chǎn)量的1/3。伴隨著世界人口的持續(xù)增長(zhǎng)和經(jīng)濟(jì)的飛速發(fā)展,使人們對(duì)植物油脂的需求量不斷提高,這也促使著人們不斷的尋找可以增加油料作物產(chǎn)油量的有效方法和便捷的途徑。玉米是全世界最重要的糧食作物之一,其品質(zhì)和產(chǎn)量對(duì)全球糧食產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有至關(guān)重要的影響。高油玉米和普通玉米相比,具有多方面的優(yōu)越性。由于玉米油當(dāng)中含有較高比例的不飽和脂肪酸和維生素等成分,使其具有軟化血管和降低血壓等作用;高油玉米的蛋白質(zhì)的含量、賴(lài)氨酸含量和類(lèi)胡蘿卜素含也非常的高,因而是一種非常理想的保健用油。玉米油當(dāng)中的特殊組分和成分不僅對(duì)人類(lèi)和單胃的動(dòng)物的營(yíng)養(yǎng)改進(jìn)具有重要的意義,同時(shí)在家禽動(dòng)物的飼養(yǎng)方面也發(fā)揮了重要的作用。其較高的營(yíng)養(yǎng)成分和重要作用使高油玉米從單純的糧食或飼料作物逐漸轉(zhuǎn)變成為了兼用作物。與此同時(shí),玉米還有很高的生產(chǎn)潛力,每公頃的高油玉米的產(chǎn)量很可能超過(guò)多數(shù)的油料作物的產(chǎn)油量,與此同時(shí),高油玉米當(dāng)中,其除油分以外的產(chǎn)品,無(wú)論是數(shù)量還是質(zhì)量都有可能多于其他多數(shù)的糧食作物。在我國(guó)市場(chǎng)當(dāng)中銷(xiāo)售的玉米油,其大多數(shù)都是從國(guó)外進(jìn)口的,其高昂的價(jià)格導(dǎo)致玉米油在市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)中處于劣勢(shì)。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素:三酰甘油tag的組裝是由kennedy于1961年發(fā)現(xiàn)首先發(fā)現(xiàn)的,因此被稱(chēng)為kennedy途徑。在發(fā)育的種子當(dāng)中,三酰甘油tag以甘油骨架上附連3個(gè)脂肪酸的形式而存在。在肯尼迪途徑當(dāng)中,在甘油的sn-1、sn-2和sn-3位點(diǎn)的順序依次加入脂酰coa最終形成三酰甘油tag:首先,sn-甘油-3-磷酸被甘油-3-磷酸脂酰轉(zhuǎn)移酶(gpat)?;?,然后由磷脂酸脂酰轉(zhuǎn)移酶(lpaat)催化產(chǎn)生磷脂酸(pa),磷脂酸又被磷脂酸磷酸酯酶(pap)脫磷酸作用生成sn-1,2-甘油二酯(dag),最后由二脂酰甘油?;D(zhuǎn)移酶(dgat)?;纬蓆ag。三酰甘油生物合成主要在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上進(jìn)行,是膜結(jié)合類(lèi)的催化反應(yīng);dgat基因編碼的二酰甘油?;D(zhuǎn)移酶做為肯尼迪途徑之中唯一的一個(gè)限速酶;控制著三酰甘油合成的最后一步。因此該基因?qū)μ岣哂土献魑锏慕?jīng)濟(jì)效益有重要的作用。為了提高我國(guó)的玉米油產(chǎn)量,改善玉米油的市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力,本發(fā)明提供了一種玉米ii型二?;视王;D(zhuǎn)移酶及編碼該玉米ii型dgat的基因。本發(fā)明玉米ii型二?;视王;D(zhuǎn)移酶命名為zmdgat2.2,zmdgat2.2的氨基酸序列如seqidno:2所示。編碼上述玉米ii型二酰基甘油?;D(zhuǎn)移酶的基因核苷酸序列如seqidno:1中核苷酸序列所示。本發(fā)明提供了一種玉米ii型二酰基甘油?;D(zhuǎn)移酶(zmdgat2.2)及其dna片段為調(diào)控玉米油脂生成,提高玉米油脂產(chǎn)量和質(zhì)量奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。本發(fā)明有助于揭示玉米dgat基因在玉米生長(zhǎng)發(fā)育及響應(yīng)非生物脅迫過(guò)程中的作用,深入了解玉米dgat基因的功能,為玉米分子育種提供新的基因資源和理論依據(jù)。附圖說(shuō)明圖1是具體實(shí)施方式一低溫處理實(shí)驗(yàn)中zmdgat2.2基因在不同時(shí)間點(diǎn)葉片中表達(dá)分析的實(shí)時(shí)熒光定量pcr測(cè)試圖。圖2是具體實(shí)施方式一低溫處理實(shí)驗(yàn)中zmdgat2.2基因在不同時(shí)間點(diǎn)根系中表達(dá)分析的實(shí)時(shí)熒光定量pcr測(cè)試圖。圖3是具體實(shí)施方式一nacl處理實(shí)驗(yàn)中zmdgat2.2基因在不同時(shí)間點(diǎn)葉片中表達(dá)分析的實(shí)時(shí)熒光定量pcr測(cè)試圖。圖4是具體實(shí)施方式一nacl處理實(shí)驗(yàn)中zmdgat2.2基因在不同時(shí)間點(diǎn)根系中表達(dá)分析的實(shí)時(shí)熒光定量pcr測(cè)試圖。圖5是具體實(shí)施方式一nahco3處理實(shí)驗(yàn)中zmdgat2.2基因在不同時(shí)間點(diǎn)葉片中表達(dá)分析的實(shí)時(shí)熒光定量pcr測(cè)試圖。圖6是具體實(shí)施方式一nahco3處理實(shí)驗(yàn)中zmdgat2.2基因在不同時(shí)間點(diǎn)根系中表達(dá)分析的實(shí)時(shí)熒光定量pcr測(cè)試圖。圖7是具體實(shí)施方式一aba處理實(shí)驗(yàn)中zmdgat2.2基因在不同時(shí)間點(diǎn)葉片中表達(dá)分析的實(shí)時(shí)熒光定量pcr測(cè)試圖。圖8是具體實(shí)施方式一aba處理實(shí)驗(yàn)中zmdgat2.2基因在不同時(shí)間點(diǎn)根系中表達(dá)分析的實(shí)時(shí)熒光定量pcr測(cè)試圖。圖9是具體實(shí)施方式一peg處理實(shí)驗(yàn)中zmdgat2.2基因在不同時(shí)間點(diǎn)葉片中表達(dá)分析的實(shí)時(shí)熒光定量pcr測(cè)試圖。圖10是具體實(shí)施方式一peg處理實(shí)驗(yàn)中zmdgat2.2基因在不同時(shí)間點(diǎn)根系中表達(dá)分析的實(shí)時(shí)熒光定量pcr測(cè)試圖。圖11是具體實(shí)施方式一zmdgat2.2基因在不同玉米組織中的qrt-pcr分析結(jié)果圖。圖12是具體實(shí)施方式一玉米zmdgat2.2基因酶學(xué)功能實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖。具體實(shí)施方式具體實(shí)施方式一:玉米ii型二酰基甘油?;D(zhuǎn)移酶命名為zmdgat2.2,zmdgat2.2的氨基酸序列如seqidno:2所示。編碼zmdgat2.2的基因核苷酸序列如seqidno:1中核苷酸序列所示。本實(shí)施方式zmdgat2.2全長(zhǎng)由999bp組成,含有332個(gè)氨基酸,大小為37.1kda,等電點(diǎn)為9.6。zmdgat蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)均包含4種構(gòu)象,為α-螺旋(alphahelix)、延伸鏈(extendedstrand)、β-折疊(betaturn)和無(wú)規(guī)則卷曲(randomcoil),且這4種構(gòu)象貫穿了整個(gè)氨基酸鏈。zmdgat2.2的α-螺旋包含103個(gè)氨基酸,占31.02%;延伸鏈含有76個(gè)氨基酸,占22.89%;β-折疊含有40個(gè)氨基酸,占12.05%;無(wú)規(guī)則卷曲含有113個(gè)氨基酸,占34.04%。zmdgat2.2基因的啟動(dòng)子區(qū)域包含abre作用元件;zmdgat2.2包含1個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域。本實(shí)施方式采用trizol(invitrogen公司)法提取玉米組織部位的總rna,具體步驟如下:a.將研缽及105℃高溫2h后的玉米組織,放入-20℃中半小時(shí),向離心管中加入1mltrizolrna提取液,取大約100mg液氮冷凍迅速三次研磨后的玉米組織加入離心管中,顛倒混勻;置于-80℃的冰箱內(nèi)30min,以使玉米組織部位的rna充分裂解釋放。b.將裂解液取出,置于冰上至其融化后,加入200μl的氯仿,充分混勻,靜置15min,12000r/min,4℃離心15min;取上清液約300μl移入新的離心管,然后加入等體積的異丙醇,震蕩混勻后置于-20℃冰箱內(nèi)2h,取出后,12000r/min4℃離心15min;c.緩慢倒掉異丙醇,12000r/min4℃離心15min后將液體倒凈,可見(jiàn)管底有少量膠狀沉淀產(chǎn)生;在沉淀中加入1ml70%的乙醇溶液(含depc)洗滌rna沉淀,將rna沉淀輕輕彈起,充分混勻;d.1200rpm4℃離心10min,倒掉離心管內(nèi)的乙醇溶液,將離心管置于工作臺(tái)室溫晾數(shù)分鐘,直到管內(nèi)乙醇完全揮發(fā);e.用50μl1%depc溶解rna,并用微量分光光度計(jì)檢測(cè)檢測(cè)rna濃度,利用凝膠電泳檢測(cè)rna質(zhì)量。反轉(zhuǎn)錄:參照invitrogen公司的試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。反轉(zhuǎn)錄得到的cdna用內(nèi)參基因18srrna進(jìn)行擴(kuò)增驗(yàn)證其質(zhì)量,內(nèi)參引物序列為:18s-f:agtttgaggcaataacaggtct;18s-r:gatgaaatttcccaagattacc?;蛉L(zhǎng)pcr擴(kuò)增:以玉米根系cdna為模板進(jìn)行pcr擴(kuò)增,并在c端插入增強(qiáng)子。pcr上游引物f1:5’-gagatgggcgcggatggcggg-3’;下游引物r1:5’-tcataggactcttagatgaaggccagg-3’。pcr反應(yīng)體系:10×pcrbuffer2μl2mmdntps2μl25mmmgcl21.6μl模板1μlprimerf1μlprimerr1μlkod-plus0.4μlpcr-gradewater11μlpcr反應(yīng)程序:預(yù)變性94℃2min;35個(gè)循環(huán):94℃、15s,55℃、30s,68℃、2min。利用基因全長(zhǎng)克隆方法,運(yùn)用相同溶液比例的體系和反應(yīng)條件,擴(kuò)大反應(yīng)體系,進(jìn)行pcr產(chǎn)物富集,本實(shí)施方式采用購(gòu)自天根生物技術(shù)公司的膠回收試劑盒(dp210)進(jìn)行產(chǎn)物富集。然后測(cè)序,獲得核苷酸序列如seqidno:1所示。表達(dá)載體構(gòu)建:由于kod高保真酶克隆出全長(zhǎng)的產(chǎn)物為平末端,連接t載體和酵母表達(dá)載體(pyes2.1)的連接方式均是粘性末端連接的方式,因此在構(gòu)建載體之前對(duì)pcr富集產(chǎn)物進(jìn)行加a,按照以下體系進(jìn)行混合:pcr產(chǎn)物15μldatp4μltaqdnapolymerase1μl將混合體系置于72℃的條件下反應(yīng)20~30min。構(gòu)建表達(dá)載體:具體構(gòu)建步驟:用克隆到的玉米zmdgat2.2基因的全長(zhǎng)編碼區(qū)構(gòu)建酵母表達(dá)載體在酵母中進(jìn)行異源表達(dá)。玉米zmdgat2.2基因全長(zhǎng)cds的pcr產(chǎn)物片段與載體進(jìn)行連接的方式是通過(guò)粘性末端連接。反應(yīng)體系及反應(yīng)條件如下:將反應(yīng)體系溫和混合充分置于室溫(22~30℃)30min,反應(yīng)結(jié)束立即置于冰上或放于-20℃條件下保存。大腸桿菌轉(zhuǎn)化:a.加入2μl的酵母表達(dá)體系混合物于50μl的感受態(tài)細(xì)胞當(dāng)中,冰浴30min。b.于42℃水浴當(dāng)中熱激30s,結(jié)束后立刻置于冰上。c.加入250μl的室溫的soc培養(yǎng)基,置于37℃,200rpm條件下?lián)u1h。d.涂不同體積(10μl,50μl,100μl)的菌液于選擇培養(yǎng)基上,37℃條件下過(guò)夜培養(yǎng)。e.挑取10個(gè)單菌落,利用載體兩端引物和基因的引物對(duì)菌落進(jìn)行陽(yáng)性菌落的驗(yàn)證.將驗(yàn)證成功的陽(yáng)性菌落進(jìn)行質(zhì)粒提取,并進(jìn)行測(cè)序,測(cè)序成功進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn),本實(shí)施方式采用購(gòu)自天根生物技術(shù)公司的質(zhì)粒提取試劑盒(dp105)進(jìn)行質(zhì)粒的提取。并且利用載體的正向引物與基因的反向引物,載體的反向引物與基因的正向引物對(duì)基因片段插入方向進(jìn)行驗(yàn)證,并利用基因的正反向引物利用pcr試驗(yàn)方法進(jìn)一步證實(shí)進(jìn)行驗(yàn)證載體連接是否成功。半乳糖誘導(dǎo)玉米zmdgat2.2基因在酵母當(dāng)中的表達(dá):由于半乳糖可以誘導(dǎo)包含gal1啟動(dòng)子的目標(biāo)蛋白的表達(dá),將已經(jīng)以葡萄糖為碳源生長(zhǎng)的菌液離心,去除上清,換新的培養(yǎng)基并加入半乳糖以誘導(dǎo)目標(biāo)蛋白表達(dá),重組蛋白質(zhì)可以在半乳糖誘導(dǎo)后不到4h內(nèi)檢測(cè)??梢栽?h內(nèi)在含棉子糖由半乳糖誘導(dǎo)培養(yǎng)的細(xì)胞中檢測(cè)到蛋白質(zhì)的形成。具體操作步驟如下:a.挑取缺陷型釀酒酵母菌株h1246的單菌落,于10ml的ypd培養(yǎng)基當(dāng)中,30℃,150rpm條件下過(guò)夜培養(yǎng)。b.測(cè)定過(guò)夜培養(yǎng)菌液的od600的值,將過(guò)夜培養(yǎng)菌液的od600的值調(diào)整為每50ml誘導(dǎo)培養(yǎng)基為0.4,繼續(xù)在30℃,150rpm條件下?lián)u菌2~4h。c.在2500rpm室溫條件下離心使酵母細(xì)胞聚于管底,去上清,用40ml1×te重懸細(xì)胞,用2ml的1×liac/0.5×te重懸酵母細(xì)胞。d.將酵母細(xì)胞于室溫條件下放置10min。e.每個(gè)轉(zhuǎn)化內(nèi)加入1μgzmdgat2.2/pyes2.1質(zhì)粒和100μg的變性的鮭魚(yú)精dna和100μl步驟d中的酵母懸浮液。f.在混合液當(dāng)中加入700μl的1×liac/40%peg-3350/1×te充分混合;將反應(yīng)體系置于30℃條件下30min后加入88μldmso與反應(yīng)體系充分混合,在42℃條件下培養(yǎng)7min,離心機(jī)瞬離10s,去上清。g.將細(xì)胞用1ml的1×te重懸后離心去上清。h.重懸細(xì)胞于50~100μl的1×te當(dāng)中涂板,于30℃條件下進(jìn)行培養(yǎng)。酶學(xué)功能實(shí)驗(yàn):陷型釀酒酵母菌株h1246完全喪失形成脂類(lèi)的功能,將玉米zmdgat2.2基因轉(zhuǎn)入到陷型釀酒酵母菌株h1246菌株中,通過(guò)提取轉(zhuǎn)基因菌株的脂類(lèi),觀察酵母菌株是否具有形成脂類(lèi)的功能,進(jìn)而說(shuō)明玉米zmdgat2.2基因的酶學(xué)功能:a.分別挑取玉米zmdgat2.2的轉(zhuǎn)基因菌株的單菌落、擬南芥dgat1基因的轉(zhuǎn)基因菌株的單菌落(陽(yáng)性對(duì)照)、含藻類(lèi)dgat2基因的轉(zhuǎn)基因菌株的單菌落(陽(yáng)性對(duì)照)、含空載體的轉(zhuǎn)基因菌株的單菌落(陰性對(duì)照)、陷型釀酒酵母菌株h1246的單菌落(陰性對(duì)照)于5ml的ypd液體培養(yǎng)基當(dāng)中,30℃,150rpm條件下,過(guò)夜培養(yǎng)。b.第二天取一定體積的菌液于室溫,2000rpm條件下離心3min,去上清,加入20ml的sc(含葡萄糖和棉籽糖),繼續(xù)過(guò)夜搖菌。c.取一定體積的菌液離心去上清,用1~2ml的sc(含10%棉籽糖和10%半乳糖)沖洗菌液,將菌液加入到50ml的sc(含棉籽糖和半乳糖),搖菌18~36h;離心菌液,去上清,用1ml滅菌的去離子水進(jìn)行沖洗,離心去上清。d.在收集的菌液當(dāng)中加入1ml的甲醇溶液,加入0.5ml的玻璃珠,利用細(xì)胞破碎儀,力度10,破碎10min。e.將混合液轉(zhuǎn)移到玻璃管當(dāng)中,加入2ml的氯仿和1ml的氯仿:甲醇(2:1)的混合液,和1ml的0.034%的mgcl2溶液,渦旋震蕩充分混勻。f.將體系于室溫,2000rpm,室溫條件下離心3min。g.取下層有機(jī)相于新管當(dāng)中,加入1ml的2m的kcl:甲醇=4:1的混合液當(dāng)中,2000rpm,室溫條件下離心5min;然后取下層有機(jī)相置于一新管中,置于通風(fēng)櫥內(nèi)利用氮吹儀將其吹干。h.在吹干的管中加入200μl的氯仿:甲醇(2:1)的混合液當(dāng)中;點(diǎn)樣于層析膠板上,半小時(shí)后將其置于裝有己烷:乙醚:乙酸=70:30:1混合液的層析缸內(nèi),跑板45min左右,至層析液距層析板頂端1cm左右處,將板取出,置于通風(fēng)櫥內(nèi)晾6~8h。i.將充分晾干的層析膠板置于裝有固體碘的層析缸內(nèi),觀看層析條帶,獲得酶學(xué)功能驗(yàn)證結(jié)果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)入了未連接基因片段的空載體的ev(emptyvector)作為陰性對(duì)照的菌體當(dāng)中,未見(jiàn)三酰甘油tag條帶生成;作為陽(yáng)性對(duì)照的過(guò)表達(dá)擬南芥dgat1基因的ad1菌株和過(guò)表達(dá)藻類(lèi)dgat2基因的td2菌株,在薄層液相色譜板上可以看到tag條帶的形成;過(guò)表達(dá)玉米zmdgat2.2基因的轉(zhuǎn)基因菌株,出現(xiàn)了清晰可見(jiàn)的tag條帶(如圖12所示)。因此證明,玉米zmdgat2.2基因具有形成脂類(lèi)的功能,且弱于擬南芥當(dāng)中dgat的酶活性,表明玉米zmdgat2.2基因具有在體外催化合成脂類(lèi)(tag)的功能。非生物脅迫實(shí)驗(yàn):選取玉米自交系合344籽粒飽滿(mǎn),大小一致的種子,用自來(lái)水沖洗干凈,采用10%naclo3消毒10min,蒸餾水洗凈,浸種12h后催芽,將種子放在培養(yǎng)箱中22℃暗培養(yǎng)24h,待種子長(zhǎng)出約1.5cm的根后,將種子種在打好孔的泡沫板,懸浮于種植1/2ms營(yíng)養(yǎng)液當(dāng)中,在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng),培養(yǎng)條件為22℃,16h光照/8h黑暗。在玉米幼苗長(zhǎng)到三葉一心期,進(jìn)行非生物脅迫處理,包括低溫處理(4℃)、nacl(200mmol·l-1)、nahco3處理(100mmol·l-1)、aba(100μmol·l-1)處理和干旱處理(20%peg6000)。分別在處理后0、12、24、48和72h取樣,每種處理選取3棵植株,取根和葉片組織各約200mg,液氮速凍后于-80℃保存。實(shí)時(shí)熒光定量pcr反應(yīng)在實(shí)時(shí)熒光定量pcr儀上進(jìn)行。反應(yīng)體系為:實(shí)時(shí)定量pcr反應(yīng)程序:預(yù)變性95℃3min;40個(gè)循環(huán):95℃、60s,95℃、15s,55℃、30s,72℃、60s。每個(gè)樣品3次重復(fù)。用2-δδct方法展開(kāi)基因的相對(duì)表達(dá)量分析。上游引物f2:5’-cttctggggaaaactggggactc-3’;下游引物r2:5’-tcaaagaactcttaactgaagatcaggg-3’。低溫處理實(shí)驗(yàn):對(duì)玉米自交系合344的根葉進(jìn)行4℃的低溫處理,進(jìn)行實(shí)時(shí)定量分析,在玉米的葉部組織和根部組織當(dāng)中,zmdgat2.2基因表現(xiàn)出上調(diào)表達(dá)趨勢(shì),zmdgat2.2基因在72h上調(diào)表達(dá)量達(dá)到峰值,根部組織當(dāng)中zmdgat2.2基因在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均上調(diào)表達(dá),zmdgat2.2基因的表達(dá)量在72h達(dá)到峰值,在低溫的脅迫下的其他時(shí)間點(diǎn)呈現(xiàn)下調(diào)表達(dá)的趨勢(shì),zmdgat2.2在低溫脅迫處理?xiàng)l件下的不同組織部位和不同時(shí)期表現(xiàn)出不同的反應(yīng),顯示了低溫脅迫過(guò)程的復(fù)雜機(jī)制(如圖1~2所示)。nacl處理實(shí)驗(yàn):玉米的葉片組織和根部組織在nacl的脅迫處理下,在大部分的時(shí)間點(diǎn)上,葉片組織和根部組織中的zmdgat2.2基因均有顯著上調(diào)表達(dá)的趨勢(shì),其中zmdgat2.2基因在12h、48h、72h時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)量呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢(shì),且在72h達(dá)到峰值;在玉米根部組織當(dāng)中,zmdgat2.2基因在多個(gè)時(shí)間點(diǎn)呈現(xiàn)上調(diào)表達(dá)趨勢(shì),zmdgat2.2基因在根部組織當(dāng)中同樣呈現(xiàn)波動(dòng)表達(dá)趨勢(shì),且在72h的上調(diào)表達(dá)量達(dá)到峰值(如圖3~4所示)。nahco3處理實(shí)驗(yàn):當(dāng)玉米的根部組織和葉片組織接受堿脅迫的時(shí)候,玉米的zmdgat2.2基因在根和葉中的受誘導(dǎo)機(jī)制和程度不同,在葉片組織當(dāng)中zmdgat2.2基因在48和72h有上調(diào)趨勢(shì)。在堿脅迫的根部組織當(dāng)中,zmdgat2.2基因在各時(shí)間點(diǎn)呈現(xiàn)上調(diào)表達(dá)的趨勢(shì),zmdgat2.2基因在24h的表達(dá)量達(dá)到峰值(如圖5~6所示)。aba處理實(shí)驗(yàn):在玉米的葉片組織和根部組織中,經(jīng)受aba脅迫條件下,zmdgat2.2基因在不同時(shí)間點(diǎn)呈現(xiàn)上調(diào)表達(dá)的趨勢(shì),在葉片組織中,受到aba脅迫時(shí),zmdgat2.2基因在6、48和72h明顯上調(diào),6h上調(diào)更為明顯,在24h時(shí)間點(diǎn),zmdgat2.2基因無(wú)上調(diào)表達(dá)趨勢(shì);在根部組織當(dāng)中,zmdgat2.2基因同樣被aba脅迫誘導(dǎo),zmdgat2.2基因在6、24、48、72h均有上調(diào)趨勢(shì),且在6h時(shí)間點(diǎn)上調(diào)最為明顯。zmdgat2.2基因在受aba脅迫的條件下受誘導(dǎo),表明zmdgat2.2基因在參與aba激素脅迫過(guò)程當(dāng)中具有重要的作用(如圖7~8所示)。peg處理實(shí)驗(yàn):在玉米的葉片組織和根部組織當(dāng)中,在經(jīng)受干旱脅迫下,葉片中zmdgat2.2基因無(wú)上調(diào)的趨勢(shì);在根當(dāng)中zmdgat2.2基因的上調(diào)明顯,且在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均有上調(diào)趨勢(shì),zmdgat2.2基因表達(dá)量在受脅迫早期上調(diào)表達(dá)較低,但隨時(shí)間推移,其表達(dá)量逐漸升高。zmdgat2.2基因在干旱脅迫當(dāng)中的表現(xiàn)表明,其在調(diào)控作物對(duì)干旱逆境環(huán)境的響應(yīng)顯著,但響應(yīng)機(jī)制存在差異,對(duì)作物抵抗逆境脅迫具有重要作用(如圖9~10所示)。不同玉米組織qrt-pcr分析:對(duì)玉米不同的生育時(shí)期樣品進(jìn)行取樣,取樣時(shí)期分別為幼苗期、拔節(jié)期、灌漿前胚乳、大喇叭口期和種子期。樣品液氮速凍于-80℃保存,進(jìn)行rna提取,反轉(zhuǎn)錄成cdna,進(jìn)行qrt-pcr,實(shí)驗(yàn)方法同上。實(shí)時(shí)定量結(jié)果顯示,玉米zmdgat2.2基因玉米在灌漿前的胚乳當(dāng)中表達(dá)較高;是幼苗期的4.7倍,是拔節(jié)期的3.5倍,是大喇叭口期的2倍,是種子時(shí)期的18倍(如圖11所示)??梢?jiàn)相同基因在不同組織部位的表達(dá)水平也存在差異,說(shuō)明在基因完成其功能的過(guò)程當(dāng)中是一個(gè)極其復(fù)雜的過(guò)程,其作用機(jī)制還有待研究和證實(shí)。玉米dgat2.2基因的cds長(zhǎng)度為999bp,全長(zhǎng)克隆結(jié)果顯示,其在1000bp的位置出現(xiàn)特異性條帶。驗(yàn)證結(jié)果顯示:所選菌落均包含連接成功且方向正確的酵母表達(dá)載體。zmdgat2.2驗(yàn)證產(chǎn)物長(zhǎng)度為999bp。選取1-2個(gè)陽(yáng)性zmdgat2.2/pyes2.1酵母表達(dá)載體送去測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序分析,測(cè)序結(jié)果正確。經(jīng)過(guò)驗(yàn)證的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到缺陷型釀酒酵母菌株h1246菌株進(jìn)行異源表達(dá)。結(jié)果表明,zmdgat2.2基因的表達(dá)能夠恢復(fù)酵母突變體形成脂類(lèi)的表型,說(shuō)明zmdgat2.2基因編碼的蛋白具有合成脂類(lèi)的酶學(xué)功能。zmdgat2.2基因在種子發(fā)育早期,尤其是在授粉后表達(dá)水平較高;在本發(fā)明的基礎(chǔ)上,利用植物中dgat同源基因的時(shí)空表達(dá)特異性和功能差異,對(duì)其進(jìn)行分別調(diào)控,對(duì)實(shí)現(xiàn)精確調(diào)控高等植物種子油脂合成途徑具有重要意義。zmdgat2.2對(duì)多種非生物脅迫處理有響應(yīng),說(shuō)明其在作物對(duì)逆境脅迫的抗性方面有一定的作用,可以豐富作物抗逆育種的基因資源。序列表<110>黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)<120>一種玉米ii型二酰基甘油?;D(zhuǎn)移酶及編碼該玉米ii型dgat的基因<130>zmdgat2.2<141>2017-06-30<160>8<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>999<212>dna<213>zeamays<400>1atgggcgcggatggcgggctgaaccgggcggcggagaagcccagggatggagagggcggg60gaggcgagggtgttccggtgcacggactactcgctgccgcggacgacgctggcgctggcg120ctctggctgggcggtatccacttcaacgtccttctcgtccttgcgtcgctcttcctcctc180tccggccgcgccgctgccatagtcgtggcgttccagctcttgttcatgttcgcgcccgtc240aacgacagggacaaatggggccagagcgtcgccaggttcatatgcagacacgcaatgggc300tacttccctatcactctgcatgtggaggactacaagtccttggatcccagcagggcttac360gtgttcggttatgagccgcactcagtgctgccgataggtctgtcggctcttgctgatctt420gttggctttctgcctctcactaagatcaaggtccttgcgagcagtgcggtgttctacacc480ccgttcttgagacagatttggacatggcttggcttggtacctgcgacaaggaagaatttc540tactgctaccttggagctggttatagttgtatcgtagtccctggtggtgtacgggaaatg600cttcatatgaacaatgattcagaggttgcttttcttaaatcaagaaaaggttttgtcaag660atagctatacagtctggatgtcctttagtcccagttttctgctttgggcagagctatgca720tacaagtggtggaggcctggtggtaaattgtttatcaagatcgctagagcagttaaattt780actcctattatcttctggggtagatttggcacaccattccccttcccaaaacccatgcat840gtggtcgtgggtaaacctattgaagtcaataagattccccatcctacaattgacgagatt900aatgaagtccatgaacagttcatcattgccatgcgggacctctttgagaagtacaaggcg960aaagctggatatcctggccttcatctaagagtcctatga999<210>2<211>332<212>prt<213>zeamays<400>2metglyalaaspglyglyleuasnargalaalaglulysproargasp151015glygluglyglyglualaargvalpheargcysthrasptyrserleu202530proargthrthrleualaleualaleutrpleuglyglyilehisphe354045asnvalleuleuvalleualaserleupheleuleuserglyargala505560alaalailevalvalalapheglnleuleuphemetphealaproval65707580asnaspargasplystrpglyglnservalalaargpheilecysarg859095hisalametglytyrpheproilethrleuhisvalgluasptyrlys100105110serleuaspproserargalatyrvalpheglytyrgluprohisser115120125valleuproileglyleuseralaleualaaspleuvalglypheleu130135140proleuthrlysilelysvalleualaserseralavalphetyrthr145150155160propheleuargglniletrpthrtrpleuglyleuvalproalathr165170175arglysasnphetyrcystyrleuglyalaglytyrsercysileval180185190valproglyglyvalargglumetleuhismetasnasnaspserglu195200205valalapheleulysserarglysglyphevallysilealailegln210215220serglycysproleuvalprovalphecyspheglyglnsertyrala225230235240tyrlystrptrpargproglyglylysleupheilelysilealaarg245250255alavallysphethrproileilephetrpglyargpheglythrpro260265270phepropheprolyspromethisvalvalvalglylysproileglu275280285valasnlysileprohisprothrileaspgluileasngluvalhis290295300gluglnpheileilealametargaspleupheglulystyrlysala305310315320lysalaglytyrproglyleuhisleuargvalleu325330<210>3<211>22<212>dna<213>artificialsequence<220><223>反轉(zhuǎn)錄內(nèi)參上游引物18s-f。<400>3agtttgaggcaataacaggtct22<210>4<211>22<212>dna<213>artificialsequence<220><223>反轉(zhuǎn)錄內(nèi)參下游引物18s-r。<400>4gatgaaatttcccaagattacc22<210>5<211>21<212>dna<213>artificialsequence<220><223>基因全長(zhǎng)pcr擴(kuò)增上游引物f1。<400>5gagatgggcgcggatggcggg21<210>6<211>27<212>dna<213>artificialsequence<220><223>基因全長(zhǎng)pcr擴(kuò)增下游引物r1。<400>6tcataggactcttagatgaaggccagg27<210>7<211>23<212>dna<213>artificialsequence<220><223>實(shí)時(shí)定量pcr上游引物f2。<400>7cttctggggaaaactggggactc23<210>8<211>28<212>dna<213>artificialsequence<220><223>實(shí)時(shí)定量pcr下游引物r2。<400>8tcaaagaactcttaactgaagatcaggg28當(dāng)前第1頁(yè)12
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