本發(fā)明涉及一類抗氧化超短肽、制備方法及其應(yīng)用，屬于生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

機(jī)體氧化反應(yīng)產(chǎn)生的自由基(freeradical)是含有一不成對(duì)電子的原子團(tuán)，如超氧陰離子、羥自由基等。自由基具有強(qiáng)氧化性，隨著年齡增長(zhǎng)或在病理狀態(tài)下，自由基產(chǎn)生過多若不能被及時(shí)清除，就會(huì)在細(xì)胞內(nèi)堆積，與機(jī)體內(nèi)的生物大分子，如蛋白質(zhì)、核酸、脂質(zhì)等相互作用，生成過多的氧化物和過氧化物，最終影響機(jī)體新陳代謝，并對(duì)機(jī)體產(chǎn)生不可逆的損傷。衰老及很多慢性疾病如癌癥、心血管疾病、肺氣腫、肝硬化、關(guān)節(jié)炎等都和自由基的損傷有關(guān)。盡管機(jī)體存在抗氧化防御系統(tǒng)，但其并不能完全有效地抵御或修復(fù)氧化作用帶來的損傷。如何適當(dāng)?shù)那宄杂苫蛊湓隗w內(nèi)維持在一個(gè)較低的水平，從而延緩機(jī)體衰老，是當(dāng)前一個(gè)重要的研究課題。

近年來抗氧化物在化妝品領(lǐng)域的應(yīng)用中興起。由于皮膚的光老化作用是由于紫外線誘導(dǎo)皮膚細(xì)胞產(chǎn)生大量的氧自由基堆積而造成的?，F(xiàn)在許多護(hù)膚品中加入抗氧化劑，有減少雀斑、防輻射、延緩衰老、調(diào)節(jié)免疫和提高皮膚自我保護(hù)的作用。此外食品中營(yíng)養(yǎng)成分的氧化反應(yīng)會(huì)產(chǎn)生過氧化物。過氧化物影響食品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，甚至可導(dǎo)致疾病發(fā)生，尋找安全的抗氧化劑以抑制過氧化物產(chǎn)生一直是生化營(yíng)養(yǎng)學(xué)的研究熱點(diǎn)。

目前廣泛使用的抗氧化劑多為化學(xué)合成物，如bha、bht等，雖抗氧化效果良好，但對(duì)人體肝、脾、肺有蓄積性致癌作用。臨床上常見的抗氧化劑如維生素c、維生素e與谷胱甘肽等。維生素c主要以清除·oh為主，但需大劑量使用才能達(dá)到目的，但同時(shí)，大劑量維生素c使用容易導(dǎo)致酸中毒；維生素e主要通過抑制細(xì)胞膜上的脂質(zhì)過氧化來達(dá)到抗氧化的目的，但長(zhǎng)期是用則有潛在的致突變風(fēng)險(xiǎn)。而臨床還原型谷胱甘肽的產(chǎn)業(yè)化壁壘較高，已被日本協(xié)和發(fā)酵工業(yè)株式會(huì)社幾乎壟斷全球谷胱甘肽的供應(yīng)，每公斤高達(dá)8000美金。同時(shí)，現(xiàn)在國(guó)內(nèi)制藥企業(yè)所用的谷胱甘肽制藥原料還不能擺脫進(jìn)口，谷胱甘肽價(jià)格一直居高不下?？梢姡钚约?、易合成、產(chǎn)量高的新型抗氧化肽已在醫(yī)療、食品、化妝品等領(lǐng)域中亟待開發(fā)。

小分子超短肽ansin-3、magin-3，具有極強(qiáng)的抗氧化活性，且無(wú)細(xì)胞毒、穩(wěn)定性高。ansin-3、magin-3一級(jí)序列全長(zhǎng)只有8個(gè)氨基酸殘基、分子量小、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、無(wú)蛋白修飾，通過化學(xué)合成方法制備，工藝簡(jiǎn)便、產(chǎn)量高且純度高。因此，本發(fā)明中的兩種超短肽ansin-3、magin-3具有十分突出有益的效果。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一類抗氧化超短肽、制備方法及其應(yīng)用，包括超短肽ansin-3和超短肽magin-3及其在制備抗氧化藥物、食品、化妝品添加劑的應(yīng)用。

本發(fā)明的技術(shù)方案：

一類抗氧化超短肽，包括超短肽ansin-3和超短肽magin-3；

(1)超短肽ansin-3：一種直鏈小肽，分子量為971.76da，等電點(diǎn)是9.00，含有8個(gè)氨基酸殘基，全序列的一級(jí)結(jié)構(gòu)為:thr-ser-arg-cys-phe-arg-val-cys；

(2)超短肽magin-3：一種直鏈小肽，分子量為1017.23da，等電點(diǎn)是9.02，含有8個(gè)氨基酸殘基，全序列的一級(jí)結(jié)構(gòu)為:phe-phe-arg-ser-cys-arg-val-cys。

一類抗氧化超短肽的制備方法，首先，根據(jù)超短肽的氨基酸序列，用自動(dòng)多肽合成儀合成超短肽的全序列；再通過hplc反相柱層析脫鹽純化，并確定其純度大于95％；最后，用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜測(cè)定超短肽的分子量。

一類抗氧化超短肽作為主要成分用于制備抗氧化藥物、食品添加劑、抗氧化化妝品。

本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明提供的兩種抗氧化超短肽ansin-3、magin-3是由化學(xué)合成的方法得到。兩種超短肽均具有極強(qiáng)的抗氧化活性，濃度為dpph自由基清除率i％高達(dá)97.35％，對(duì)abts^·+正離子自由基清除率i％可以達(dá)到84.41％；并且兩種抗氧化肽ansin-3、magin-3分子量小、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、細(xì)胞毒性極低、制備方法簡(jiǎn)單等，因此將其應(yīng)用在抗氧化藥物、食品或者化妝品添加劑中，可以提高藥物、食品或化妝品添加劑的抗氧化效果，具有很好的應(yīng)用前景。

附圖說明

圖1是ansin-3、magin-3對(duì)b16細(xì)胞的毒性圖。

圖中：

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合附圖和技術(shù)方案，進(jìn)一步說明本發(fā)明的具體實(shí)施方式。

實(shí)施例1

兩種抗氧化超短肽ansin-3、magin-3的化學(xué)合成：

(1)兩種抗氧化超短肽ansin-3、magin-3的化學(xué)合成方法：根據(jù)超短肽氨基酸序列，用自動(dòng)多肽合成儀(433a,appliedbiosystems)合成二者的全序列，通過hplc反相柱層析脫鹽。

(2)分子量測(cè)定采用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(maldi-tof)。

(3)純化的兩種抗氧化超短肽ansin-3、magin-3用高效液相色譜hplc方法鑒定其純度，分子量測(cè)定采用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(maldi-tof)，等電聚焦電泳測(cè)定等電點(diǎn)，用自動(dòng)氨基酸測(cè)序儀測(cè)定氨基酸序列結(jié)構(gòu)。

兩種抗氧化超短肽ansin-3、magin-3是直鏈超短肽，其中ansin-3分子量為971.16da，等電點(diǎn)是9.00，含有8個(gè)氨基酸殘基，全序列的一級(jí)結(jié)構(gòu)為：thr-ser-arg-cys-phe-arg-val-cys；magin-3分子量為1017.23da，等電點(diǎn)是9.02，含有8個(gè)氨基酸殘基，全序列的一級(jí)結(jié)構(gòu)為：phe-phe-arg-ser-cys-arg-val-cys；

實(shí)施例2

兩種抗氧化超短肽ansin-3、magin-3抗氧化活性測(cè)定：

(1)dpph自由基清除活性(dpphradicalscavengingassay)

稱取一定量的dpph(2,2-diphenyl-1-picrylhydrazylhydrate，sigma，美國(guó))，用甲醇溶解，配成6×10^-5m的溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用。將48μldpph溶液和2μl樣品(2mg/ml)混合(最終樣品與dpph的質(zhì)量比為3:1)，室溫下避光靜置30min，于517nm處測(cè)定吸光值?？瞻讓?duì)照組以樣品溶解介質(zhì)代替待測(cè)樣品。實(shí)驗(yàn)做三個(gè)平行，紫外分光光度計(jì)調(diào)零時(shí)使用甲醇。

dpph·清除率(％)＝(ab－aa)/ab×100(ab:空白對(duì)照組吸光值；aa:樣品組吸光值)。

(2)abts^·+自由基正離子清除活性

abts(3-ethylbezothiazoline-6-sulfonicacid)(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)用pbs緩沖液(ph7.4)配成2mm的abts儲(chǔ)存液。將abts儲(chǔ)存液和70mm過硫酸鉀(k2s2o8)水溶液按體積比250:1混合，于室溫避光放置15-16h。試驗(yàn)開始前，將abts^·+釋至734nm波長(zhǎng)處的吸光值為0.80±0.03。將4μl不樣品和96μl上述校正過的abts^·+溶液混合，室溫放置10min后，于734nm波長(zhǎng)處檢測(cè)反應(yīng)液的吸光值。空白對(duì)照組為溶解樣品所用滅菌去離子水。實(shí)驗(yàn)做三個(gè)平行。

abts^·+清除率i(％)＝(ab－aa)/ab×100(ab:空白對(duì)照組吸光值；aa:樣品組吸光值)。

(3)還原力測(cè)定

10μl樣品(2mg/ml)與50μl磷酸鈉緩沖液以及50μl1％k3fe(cn)6混合，50℃水浴20min；然后加入50μl10％的三氯乙酸，3000rpm離心10min；取上清50μl，加入50μl去離子水和10μl1％fecl3。于700nm測(cè)光吸收。光吸收越強(qiáng)表示還原力越強(qiáng)。

表1.ansin-3、magin-3體外抗氧化活性

結(jié)果如表1所示，ansin-3、magin-3具有極強(qiáng)的抗氧化活性。

實(shí)施例3

ansin-3、magin-3細(xì)胞毒性測(cè)定：

用mtt法檢測(cè)樣品ansin-3、magin-3對(duì)小鼠黑色素瘤b16的細(xì)胞毒性。

先將細(xì)胞于含有10％胎牛血清以及雙抗(青霉素和鏈霉素各100u/ml)的dmem中培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)滿后，用0.25％的胰蛋白酶消化下來，用上述培養(yǎng)基洗兩次，重新懸浮細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)后將細(xì)胞懸浮液100μl加入到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，使每孔細(xì)胞數(shù)為103個(gè)。過夜待細(xì)胞貼壁后，吸出培養(yǎng)基，加入含不同濃度樣品的完全培養(yǎng)基，對(duì)照組加入相同體積的完全培養(yǎng)基，置37℃、5％co2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)72h(中途換液一次)。培養(yǎng)結(jié)束后，96孔細(xì)胞培養(yǎng)板每孔加入20μl5mg/mlmtt溶液(用pbs緩沖液配制)，繼續(xù)培養(yǎng)4h后，吸出孔中液體，每孔加入150μldmso，搖床振蕩10min。酶標(biāo)儀檢測(cè)光吸收，測(cè)定波長(zhǎng)為490nm，參考波長(zhǎng)630nm。

結(jié)果如圖1所示，結(jié)果表明，樣品ansin-3、magin-3濃度為160μg/ml時(shí)的細(xì)胞存活率仍可高達(dá)90％，說明樣品ansin-3、magin-3不具有細(xì)胞毒性，因此十分利于其在抗氧化藥物或食品、化妝品添加劑領(lǐng)域進(jìn)一步的開發(fā)利用。