本發(fā)明涉及一種唾液聯(lián)合乳桿菌lzzay01的胞外囊泡lsevs及其在結(jié)腸癌中的應(yīng)用，屬于微生物。

背景技術(shù)：

1、結(jié)腸癌是全球發(fā)病率和死亡率較高的消化道惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅人類健康。結(jié)腸癌通常是由腸道微生物群、黏膜屏障、環(huán)境、免疫系統(tǒng)等多重復(fù)雜因素相互作用的結(jié)果，其預(yù)防和治療均面臨著巨大的挑戰(zhàn)。近年來(lái)，益生菌、宿主以及腸道微生物群之間的相互作用關(guān)系逐漸明晰。通過(guò)口服益生菌正向調(diào)節(jié)腸道微生物群、增強(qiáng)腸道黏膜屏障、競(jìng)爭(zhēng)性抑制或清除致病菌等治療手段獲得了眾多研究學(xué)者的認(rèn)可。然而，大多數(shù)益生菌口服后難以耐受惡劣的胃酸環(huán)境，致使運(yùn)送至腸道的有效活菌數(shù)量得不到保障。

2、益生菌胞外囊泡（extra?cellular?vesicles,?evs）可以被視為一種安全有效的通信載體為益生菌提供有益的效果益，生菌胞外囊泡（extra?cellular?vesicles,?evs）可以攜帶其菌體生物活性成分，穿過(guò)黏液層并直接遷移到其他組織或與宿主免疫系統(tǒng)的不同細(xì)胞相互作用，進(jìn)而發(fā)揮生物學(xué)功能。因此益生菌衍生的evs有望成為一種新的、安全的治療結(jié)腸癌策略應(yīng)用于臨床。

3、然而，目前并沒(méi)有關(guān)于益生菌胞外囊泡（extra?cellular?vesicles,?evs）的研究，基于此，我們研發(fā)了唾液聯(lián)合乳桿菌lzzay01的胞外囊泡lsevs及其在結(jié)腸癌中的應(yīng)用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、一種唾液聯(lián)合乳桿菌lzzay01的胞外囊泡lsevs，所述唾液聯(lián)合乳桿菌lzzay01從新疆黑雞唾液中分離得到，其保藏號(hào)為cgmcc?no:28400，保藏日期為：2023年9月8日，保藏單位為：中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，16s?rdna序列如seq?id?no:1所示，分類命名為唾液聯(lián)合乳桿菌(ligilactobacillus?salivarius)，所述胞外囊泡lsevs由唾液聯(lián)合乳桿菌lzzay01分泌得到；所述胞外囊泡lsevs的粒徑為100-300nm的球形雙層膜結(jié)構(gòu)。

2、而且，所述胞外囊泡lsevs采用細(xì)菌膜囊泡分離試劑盒（dlmbiotech，bacmv10-20）提取，提取方法如下：

3、s1、收集細(xì)菌培養(yǎng)上清液

4、（1）、挑取唾液聯(lián)合乳桿菌lzzay01單菌落于mrs肉湯中，置于恒溫?fù)u床搖菌10-14h，收集菌液，5000×g、4℃離心15-25min，得到一次上清液；

5、（2）、取一次上清液再次5000×g、4℃離心15-25min，得到二次上清液；

6、（3）、將二次上清液中加入0.5m/l?naoh調(diào)ph至7.0-7.4，得到調(diào)ph二次上清液，-20℃儲(chǔ)存；

7、s2、?胞外囊泡lsevs樹(shù)脂捕獲

8、（1）、取10ml調(diào)ph二次上清液，加入結(jié)合緩沖液1.0ml，混合均勻，加入400μl結(jié)合樹(shù)脂混合混勻，10-20min后1500×g、離心1.5-2.5min得到三次上清液；

9、（2）、吸取400μl結(jié)合樹(shù)脂，加入上述三次上清，室溫顛倒混勻15min后，1，500×g室溫離心2min。用移液器取離心后的上清液400μl（不棄），小心倒掉剩余上清，用移液器中的400μl上清液輕輕吹起樹(shù)脂，轉(zhuǎn)移至純化柱，靜置1.5-2.5min，2000×g、離心1.5-2.5min，棄去濾液，將純化柱放回收集管；

10、s3、胞外囊泡lsevs洗滌

11、取500μl洗滌液加到純化柱中，靜置3min，3000×g、離心1.5-2.5min，棄去濾液，重復(fù)洗滌一次；

12、s4、胞外囊泡lsevs洗脫

13、將純化柱放入低吸附蛋白的1.5ml離心管中，加入400μl洗脫液，靜置5min，離心1.5-2.5min，將濾液轉(zhuǎn)移至純化柱中，室溫靜置3-8min，離心1.5-2.5min，離心所得液體即為胞外囊泡lsevs濃縮液。

14、而且，所述步驟s1（1）中，恒溫?fù)u床的溫度為37℃、轉(zhuǎn)速為200rpm。

15、另一方面，本發(fā)明提供一種唾液聯(lián)合乳桿菌lzzay01的胞外囊泡lsevs的應(yīng)用，應(yīng)用于治療結(jié)腸癌。

16、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果在于：

17、本發(fā)明研發(fā)了唾液聯(lián)合乳桿菌lzzay01的胞外囊泡，在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中觀察到其抗結(jié)腸癌功能，并且在體外促進(jìn)正常腸上皮細(xì)胞生長(zhǎng)，這為益生菌胞外囊泡（extra?cellularvesicles,?evs）在抗癌抑癌中的應(yīng)用中提供了新的思路和途徑。

技術(shù)特征：

1.一種唾液聯(lián)合乳桿菌lzzay01的胞外囊泡lsevs，所述唾液聯(lián)合乳桿菌lzzay01從新疆黑雞唾液中分離得到，其保藏號(hào)為cgmcc?no:28400，保藏日期為：2023年9月8日，保藏單位為：中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，16s?rdna序列如seq?id?no:1所示，其特征在于，所述胞外囊泡lsevs由唾液聯(lián)合乳桿菌lzzay01分泌得到，所述胞外囊泡lsevs的粒徑為100-300nm的球形雙層膜結(jié)構(gòu)。

2.如權(quán)利要求1所述的一種唾液聯(lián)合乳桿菌lzzay01的胞外囊泡lsevs，其特征在于，所述胞外囊泡lsevs的提取方法如下：

3.如權(quán)利要求2所述的一種唾液聯(lián)合乳桿菌lzzay01的胞外囊泡lsevs，其特征在于，所述步驟s1（1）中，恒溫?fù)u床的溫度為37℃、轉(zhuǎn)速為200rpm。

4.如權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的一種唾液聯(lián)合乳桿菌lzzay01的胞外囊泡lsevs的應(yīng)用。

5.如權(quán)利要求4所述的一種唾液聯(lián)合乳桿菌lzzay01的胞外囊泡lsevs的應(yīng)用，其特征在于，用于治療結(jié)腸癌。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明提供一種唾液聯(lián)合乳桿菌LZZAY01的胞外囊泡LsEVs及其在結(jié)腸癌中的應(yīng)用，所述唾液聯(lián)合乳桿菌LZZAY01從新疆黑雞唾液中分離得到，所述胞外囊泡LsEVs由唾液聯(lián)合乳桿菌LZZAY01分泌得到，所述胞外囊泡LsEVs的粒徑為100?300nm的球形雙層膜結(jié)構(gòu)；本發(fā)明研發(fā)了唾液聯(lián)合乳桿菌LZZAY01的胞外囊泡，在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中觀察到其抗結(jié)腸癌功能，并且在體外促進(jìn)正常腸上皮細(xì)胞生長(zhǎng)，這為益生菌胞外囊泡在抗癌抑癌中的應(yīng)用中提供了新的思路和途徑。

技術(shù)研發(fā)人員：趙鵬偉,楊文紅,安世祥,崔珈銜,崔燕,李濤,陳榮,張明昱,張烜,陸景坤
受保護(hù)的技術(shù)使用者：內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/5