專利名稱:姬松茸菌胞外多糖生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及食用真菌多糖的生產(chǎn)領(lǐng)域，尤其涉及姬松茸菌胞外多糖的發(fā)酵培養(yǎng)與提取生產(chǎn)方法。
背景技術(shù)：
姬松茸又稱巴西蘑菇，是一種非常珍稀的藥食兼用真菌，學(xué)名為A.brasiliensis。姬松茸菌營(yíng)養(yǎng)豐富，味道鮮美，有濃烈的杏仁香味，每百克姬松茸干品含粗蛋白40-45克，糖類38-45克，纖維質(zhì)6-8克，粗脂肪3-4克，是含蛋白質(zhì)和糖類非常豐富的食用菌；另外還含有豐富的維生素，如VB10.3-0.4毫克，VB23.2-3.7毫克，煙酸22-50毫克，麥角甾醇100-200毫克(VD原)。該菌含有18種氨基酸，其中人體必需氨基酸占其總氨基酸的39.7-42.8％。姬松茸的主要活性成份是多糖，并以葡聚糖為主，含β-(1-6)側(cè)鏈的β-(1-3)主鏈的葡聚糖。研究結(jié)果表明，姬松茸多糖主要通過(guò)激活機(jī)體免疫系統(tǒng)，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬能力，刺激干擾素的形成，激活機(jī)體內(nèi)自然殺傷細(xì)胞，促進(jìn)免疫球蛋白，白細(xì)胞介素的生成，提高淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化率等發(fā)揮其抗腫瘤作用；在基因水平上有較強(qiáng)的抗化學(xué)誘變作用；可用于慢性乙型肝炎及惡性腫瘤放化療后乏力，白細(xì)胞減少，免疫功能降低的綜合治療，隨著研究的深入，姬松茸菌多糖顯著的療效已逐漸被人們所認(rèn)識(shí)。
目前姬松茸菌多糖生產(chǎn)的原料主要靠人工栽培和野外采集的子實(shí)體中提取獲得。由于野生姬松茸菌在自然界中數(shù)量稀少，加上目前野生環(huán)境的破壞和人們對(duì)其的過(guò)度采集，野外采集的姬松茸菌來(lái)源已越來(lái)越少，而人工栽培雖然能提供一定數(shù)量的姬松茸，但是周期長(zhǎng)(一般三個(gè)月左右)，占地面積大，產(chǎn)量低而不穩(wěn)，需要的勞動(dòng)量大，病蟲害多，受季節(jié)和氣候影響大，而且姬松茸子實(shí)體的質(zhì)量也難以保證，更為嚴(yán)重的是污染大(重金屬含量高，農(nóng)藥殘留多)。而工業(yè)化深層發(fā)酵培養(yǎng)方法具有周期短，產(chǎn)量高等優(yōu)點(diǎn)，國(guó)內(nèi)外利用該法生產(chǎn)多糖的研究早已開(kāi)展，并申請(qǐng)了多個(gè)專利，如公開(kāi)號(hào)CN 1398978A姬松茸的發(fā)酵工藝及其多糖肽的生產(chǎn)方法、公開(kāi)號(hào)CN 1339582A姬松茸大規(guī)模液體深層發(fā)酵工藝、公開(kāi)號(hào)CN1303923A珍稀藥用絲狀真菌姬松茸液體培養(yǎng)、專利號(hào)00135444.2姬松茸面條及姬松茸菌株工業(yè)液體發(fā)酵生產(chǎn)工藝等，但他們多是采用淀粉類原料如馬鈴薯淀粉、玉米淀粉或玉米(粉)汁，豆(餅)粉等為主(在培養(yǎng)基中僅有少量的單糖或二糖作為前期誘導(dǎo)碳源)進(jìn)行液體發(fā)酵培養(yǎng)，同時(shí)均以提取菌絲體多糖(即細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)性多糖)或以菌絲體與發(fā)酵液的混合物為目標(biāo)，因此，制取姬松茸菌絲體多糖技術(shù)已較為成熟。但姬松茸菌在培養(yǎng)液內(nèi)的發(fā)酵過(guò)程中不僅能產(chǎn)生大量的菌絲體，同時(shí)在培養(yǎng)液中也分泌積累了胞外多糖，為了獲得這部分胞外多糖，我們利用上述淀粉類原料做培養(yǎng)基進(jìn)行試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)高溫滅菌后易結(jié)塊或結(jié)球，致使在形成的姬松茸菌絲體球內(nèi)含有淀粉顆粒；而且在該液產(chǎn)生的所謂胞外多糖內(nèi)除真正由姬松茸菌分泌的β-葡聚糖外，還混有部份淀粉多糖(原料)即α-葡聚糖，這造成胞外多糖產(chǎn)量的虛高，質(zhì)量純度成了問(wèn)題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是針對(duì)以上存在問(wèn)題，通過(guò)對(duì)生產(chǎn)培養(yǎng)基的優(yōu)化和生產(chǎn)及提取工藝的改良，提出一種真正來(lái)源于姬松茸菌胞外多糖的優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)生產(chǎn)方法。
本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的一種姬松茸菌胞外多糖的生產(chǎn)方法，包括生產(chǎn)培養(yǎng)基的組分與含量(重量％)及生產(chǎn)的步驟與條件，其中，生產(chǎn)培養(yǎng)基為葡萄糖，蔗糖，紅糖或蜂蜜中的一種或二種以上混合物 1-6％；酵母膏或蛋白胨或與尿素、硫酸銨、KNO3中的一種或二種以上的混合物0.2-1.0％K2HPO40.1-0.6％MgSO40.05-0.3％生產(chǎn)步驟，條件為(1)菌種制作將姬松茸菌種接種在PDA斜面培養(yǎng)基上，于25～28℃恒溫培養(yǎng)7～10天后，置于4℃左右的冰箱中保存?zhèn)溆茫?2)種子培養(yǎng)基配制與接種培養(yǎng)液體種子培養(yǎng)基配方(重量％)為葡萄糖2％，酵母膏0.2％、K2HPO40.2％、MgSO40.05％、pH調(diào)整到6，滅菌后將步驟(1)所制菌種活化培養(yǎng)的菌絲體接入，在28～30℃下靜止培養(yǎng)5天；(3)生產(chǎn)培養(yǎng)基接種培養(yǎng)將步驟(2)培養(yǎng)的菌絲體，在無(wú)菌條件下水洗3次，再放入滅菌的內(nèi)含直徑2毫米玻璃珠試管內(nèi)，在旋渦混合儀內(nèi)把菌絲體打成碎片，配成菌絲懸浮液后接入生產(chǎn)培養(yǎng)基中，接種量為每升培養(yǎng)液接100毫克濕潤(rùn)菌絲體；在28～30℃下靜止培養(yǎng)有利于胞外多糖的合成，經(jīng)8天左右，約有50％液體形成膠凍狀，終止發(fā)酵；該生產(chǎn)培養(yǎng)基的優(yōu)化配方(重量％)為紅糖2％、酵母膏0.2％、K2HPO40.2％、MgSO40.05％，PH為6。
(4)多糖提取及純化將步驟(3)膠凍狀發(fā)酵混合物用超聲波處理至菌絲體和胞外多糖完全分開(kāi)，過(guò)濾取出菌絲體后(該菌絲體可按現(xiàn)有技術(shù)另行提取胞內(nèi)多糖)，在濾液中加3倍體積95％乙醇沉淀多糖，于冰箱內(nèi)靜止過(guò)夜，離心收集多糖，再用丙酮、乙醚、乙醇交替洗滌多糖后，用蒸餾水溶解多糖，并用超聲波助溶，靜止2～4小時(shí)，離心去除不溶物，再在濾液中加3倍體積95％乙醇沉淀多糖，于冰箱內(nèi)靜止過(guò)夜，離心即得姬松茸胞外多糖；由于是靜止培養(yǎng)，氣生菌絲生長(zhǎng)旺盛，分泌的胞外多糖環(huán)繞在該菌絲體的周圍，因此以大表面積的淺層培養(yǎng)有利于形成胞外多糖和提高培養(yǎng)基的利用率。
本發(fā)明的有益效果是，以單糖或二糖取代淀粉類作為培養(yǎng)基的碳源，采用菌絲碎片懸浮液接種，淺層靜止培養(yǎng)促進(jìn)胞外多糖分泌，不僅使獲得的胞外多糖真正來(lái)源于姬松茸菌，并提高了胞外多糖的產(chǎn)量，保證了胞外多糖的純度；同時(shí)該工藝簡(jiǎn)單，合理，有利于工業(yè)化應(yīng)用。
具體實(shí)施方式
通過(guò)以下實(shí)施例將對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明。
實(shí)施例1姬松茸菌株Agaricus brasiliensis 03，該菌株組織分離于巴西巴拉那州庫(kù)里提巴市菇農(nóng)種植的姬松茸子實(shí)體。將其接種在PDA(馬鈴薯葡萄糖瓊脂)斜面培養(yǎng)基上，于25～28℃恒溫培養(yǎng)7～10天后，置于4℃左右的冰箱中保存?zhèn)溆?，該菌種使用前先接種在PDA斜面培養(yǎng)基上活化，即于25～30℃恒溫培養(yǎng)7～10天后，把菌絲體(不帶培養(yǎng)基)接種在滅菌的含有液體種子培養(yǎng)基的三角燒瓶中靜止培養(yǎng)5天，該液體種子培養(yǎng)基的配方為(重量％)葡萄糖2％，酵母膏0.2％，K2HPO40.2％；MgSO40.05％，余量為水，pH6，培養(yǎng)溫度為28～30℃，這時(shí)菌絲生長(zhǎng)白而旺，用篩網(wǎng)過(guò)濾收集該液內(nèi)菌絲體，在無(wú)菌條件下把菌絲體用無(wú)菌水洗3次，放入滅菌的試管內(nèi)(含直徑2毫米玻璃珠)，在旋渦混合儀內(nèi)把菌絲體打成碎片(約1分鐘)，再配成菌絲懸浮液接種于生產(chǎn)培養(yǎng)基中，接種量為每升生產(chǎn)培養(yǎng)基接100毫克濕潤(rùn)菌絲體。生產(chǎn)培養(yǎng)基配方為紅糖20克、酵母膏2克、K2HPO42克、MgSO40.5克、余量為水，配制成1000毫升培養(yǎng)液，pH調(diào)成6，存入淺底容器中，培養(yǎng)液高度一般控制在3～5公分，再按量接入菌種碎片，在28～30℃靜止條件下培養(yǎng)7～10天，當(dāng)約有50％培養(yǎng)液形成膠凍狀時(shí)終止發(fā)酵；用JY92-II型超聲波細(xì)胞破碎儀(寧波新芝生物科技公司)處理該發(fā)酵液直到菌絲體和胞外多糖完全分開(kāi)，用過(guò)濾布濾去菌絲體(菌絲體胞內(nèi)多糖可利用已有技術(shù)另行提取)，在濾液中加3倍體積95％乙醇沉淀多糖，于冰箱內(nèi)靜止過(guò)夜，離心收集多糖，再用丙酮、乙醚、90％乙醇依此交替洗滌多糖，再用蒸餾水溶解多糖，用超聲波助溶，靜止2-4小時(shí)，離心去除不溶物，再在濾液中加3倍體積95％乙醇沉淀多糖，于冰箱內(nèi)靜止過(guò)夜，離心即得姬松茸菌胞外多糖純品，該胞外多糖提取得率為825.2mg/L。
實(shí)施例2該例生產(chǎn)培養(yǎng)基的配方為蔗糖50克、酵母膏與硫酸銨1∶1混合物8克、K2HPO45克、MgSO42.5克、余量為水，配制成1000毫升培養(yǎng)液，pH調(diào)整為6，其余從菌種制備到提取純化各步驟，條件均同于實(shí)施例1。該例胞外多糖提取得率為789.5mg/L。
權(quán)利要求
1.姬松茸菌胞外多糖生產(chǎn)方法，其特征在于該生產(chǎn)培養(yǎng)基的組分與含量(重量％)及其生產(chǎn)步驟，條件如下其中，生產(chǎn)培養(yǎng)基為葡萄糖，蔗糖，紅糖或蜂蜜中的一種或二種以上混合物 1-6％；酵母膏或蛋白胨或與尿素、硫酸銨、KNO3中的一種或二種以上的混合物0.2-1.0％K2HPO40.1-0.6％MgSO40.05-0.3％生產(chǎn)步驟，條件為(1)菌種制作將姬松茸菌種接種在PDA斜面培養(yǎng)基上，于25～28℃恒溫培養(yǎng)7～10天后，置于4℃左右的冰箱中保存?zhèn)溆茫?2)種子培養(yǎng)基配制與接種培養(yǎng)液體種子培養(yǎng)基配方(重量％)為葡萄糖2％，酵母膏0.2％、K2HPO40.2％、MgSO40.05％、pH調(diào)整到6，滅菌后將步驟(1)所制菌種活化培養(yǎng)后的菌絲體接入，在28～30℃下靜止培養(yǎng)5天；(3)生產(chǎn)培養(yǎng)基接種培養(yǎng)將步驟(2)培養(yǎng)的菌絲體經(jīng)消毒水洗，打碎配成菌絲懸浮液后，按每升培養(yǎng)液接100毫克濕潤(rùn)菌絲體計(jì)，接入上述生產(chǎn)培養(yǎng)基中，在28～30℃下靜止培養(yǎng)8天，約有50％培養(yǎng)液呈膠凍狀后終止發(fā)酵；(4)多糖提取及純化用超聲波處理步驟(3)發(fā)酵液直到菌絲體和胞外多糖完全分開(kāi)，過(guò)濾去除菌絲體，在濾液中加3倍體積95％乙醇沉淀多糖，于冰箱內(nèi)靜止過(guò)夜，離心收集多糖后，用丙酮、乙醚、乙醇交替洗滌多糖，再用蒸餾水溶解多糖，超聲波助溶，靜止2～4小時(shí)，離心去除不溶物，再在濾液中加3倍體積95％乙醇沉淀多糖，于冰箱內(nèi)靜止過(guò)夜，離心得姬松茸菌胞外多糖純品。
2.根據(jù)權(quán)利要求
1所述姬松茸菌胞外多糖生產(chǎn)方法，其特征在于所述生產(chǎn)培養(yǎng)基的組分與含量(重量％)為紅糖2％、酵母膏0.2％、K2HPO40.2％、MgSO40.05％。
3.根據(jù)權(quán)利要求
1所述姬松茸菌胞外多糖生產(chǎn)方法，其特征在于所述生產(chǎn)液接種采用菌絲碎片懸浮液。
4.根據(jù)權(quán)利要求
1所述姬松茸菌胞外多糖生產(chǎn)方法，其特征在于所述生產(chǎn)液培養(yǎng)方法采用淺層液體靜止培養(yǎng)。
5.根據(jù)權(quán)利要求
1所述姬松茸菌胞外多糖生產(chǎn)方法，其特征在于所述生產(chǎn)液發(fā)酵后其菌絲體和胞外多糖分離采用超聲波分離法。
專利摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種姬松茸菌胞外多糖生產(chǎn)方法，該方法優(yōu)化了生產(chǎn)培養(yǎng)基的配方，改良了發(fā)酵與提取工藝，包括菌種制作、種子培養(yǎng)基配制與接種培養(yǎng)、生產(chǎn)培養(yǎng)基接種培養(yǎng)及多糖提取、純化等步驟，顯著提高了該菌所產(chǎn)胞外多糖的質(zhì)量與純度，使胞外多糖產(chǎn)量達(dá)825.2mg/L，本發(fā)明工藝簡(jiǎn)單，成本低廉，可工業(yè)化推廣應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12P19/04GKCN1631903SQ200410092883
公開(kāi)日2005年6月29日 申請(qǐng)日期2004年11月23日
發(fā)明者范雷法, 潘慧娟 申請(qǐng)人:浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan