專利名稱:增強(qiáng)胎肝造血干細(xì)胞cd34表達(dá)的培養(yǎng)液及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物工程技術(shù)領(lǐng)域：
的培養(yǎng)液及其制備方法。具體涉及一種 增強(qiáng)胎肝造血干細(xì)胞CD34表達(dá)的培養(yǎng)液及其制備方法。
背景技術(shù)：
造血干細(xì)胞在上世紀(jì)初被提出且應(yīng)用于臨床已經(jīng)顯示出它的治療潛力，諸 多的血液系統(tǒng)疾病在干細(xì)胞移植治療后使病患的臨床癥狀得以改善，患者的生存 期顯著的延長(zhǎng)。造血干細(xì)胞的主要來源包括骨髓源造血干細(xì)胞、臍血造血干細(xì)胞、 胎肝造血干細(xì)胞。由于造血干細(xì)胞來源不同，干細(xì)胞所具備的抗原性亦不同，主 要表現(xiàn)為骨髓源造血干細(xì)胞的抗原性(例如HLA)強(qiáng)，植入體內(nèi)的骨髓源造 血干細(xì)胞，如果不經(jīng)配型，首先宿主的免疫系統(tǒng)會(huì)對(duì)植入體內(nèi)的造血干細(xì)胞產(chǎn)生 排斥作用。輸入的抗原性強(qiáng)的干細(xì)胞也會(huì)排斥宿主，強(qiáng)烈的排斥反應(yīng)會(huì)引起一 系列的系統(tǒng)性的免疫變態(tài)反應(yīng)，并導(dǎo)致人體器官的功能障礙和衰竭。因此，骨髓 源造血干細(xì)胞的植入必須將供體和配體的抗原型作完全比較后，在找出供體和宿 主抗原"相同"或極"相近"者才能做細(xì)胞植入的治療，這最終導(dǎo)致患者只有 10萬(wàn)或百萬(wàn)分之一的機(jī)會(huì)尋找到符合自身細(xì)胞要求的供體，臨床應(yīng)用存在極大 困難。
臍帶血提供的造血干細(xì)胞由于抗原性較骨髓源造血干細(xì)胞弱，故理論上臍 血造血干細(xì)胞是理想的具有臨床治療價(jià)值的干細(xì)胞，其機(jī)體排斥反應(yīng)較骨髓源造 血干細(xì)胞輕。由于臍血造血干細(xì)胞的數(shù)量有限，不能滿足成人及大齡兒童患者植 入干細(xì)胞修復(fù)機(jī)體的臨床要求，由于臍帶血造血干細(xì)胞體外增殖，尚存在諸多關(guān) 鍵技術(shù)問題未解決，臨床實(shí)際應(yīng)用存在困難。與前兩者相比，胎肝造血干細(xì)胞具 有以下優(yōu)勢(shì)。第一，造血干細(xì)胞抗原性較臍血造血干細(xì)胞弱，所以干細(xì)胞抗原配 型相對(duì)簡(jiǎn)易而且容易在小規(guī)模的人組織供體中尋獲；第二，胎肝造血組織蘊(yùn)含具有相當(dāng)數(shù)量的干細(xì)胞(50 120X 106)，而臍血造血干細(xì)胞僅有1 2X106，該數(shù) 量的臍血造血干細(xì)胞僅能滿足體重《20公斤的患者植入要求；第三，干細(xì)胞的 成活率高，分化性強(qiáng)。單位細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞集落均高于骨髓和臍血源性造血干細(xì) 胞，純化出的干細(xì)胞僅需ABO、 HLA，六位點(diǎn)配型，便可以實(shí)際用于患者，其配 型成功機(jī)率可高達(dá)25%。
經(jīng)檢索發(fā)現(xiàn)，中國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?2134314.4，公開號(hào)CN1389566,名稱
神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基及其制備方法，該項(xiàng)技術(shù)自述為公開了一種神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)
基及其制備方法，由DMEM和F12按1 : 1混合而成的基礎(chǔ)培養(yǎng)液、胰島素、鹽酸 丁二胺、硒化鈉、氫化可的松、L一谷氨酰胺、人轉(zhuǎn)鐵蛋白和黃體酮配制而成， 具有使骨髓組織等不同來源種子細(xì)胞定向發(fā)育分化為神經(jīng)干細(xì)胞功能，可隨時(shí)準(zhǔn) 確無誤地為醫(yī)學(xué)科研教學(xué)及臨床應(yīng)用提供相關(guān)需要的神經(jīng)干細(xì)胞。由于造血干細(xì) 胞的CD34表達(dá)受微環(huán)境的作用影響較大，某些干細(xì)胞在部分周期內(nèi)CD34表達(dá)極 弱，而某些干細(xì)胞在同樣的周期內(nèi)CD34表達(dá)又很強(qiáng)(這種現(xiàn)象又稱為"漂移表 達(dá)")。這種生物特性使用目前的純化方法只能純化CD34表達(dá)強(qiáng)的干細(xì)胞(通 過熒光標(biāo)記抗體或CD34分離試劑盒對(duì)CD34細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記等方法)，而在同一周 期內(nèi)CD34表達(dá)弱的干細(xì)胞，由于不能有效標(biāo)記則被忽略，干細(xì)胞的這種生物特 性(CD34表達(dá))使得目前的純化方法只能對(duì)那些經(jīng)過標(biāo)識(shí)的干細(xì)胞進(jìn)行純化， 使得干細(xì)胞可純化數(shù)量不穩(wěn)定，且不能有效的純化出足量的造血干細(xì)胞應(yīng)用于臨 床，為患者提供多次治療的機(jī)會(huì)。
該項(xiàng)技術(shù)作用是將一種具有使骨髓組織等不同來源種子細(xì)胞定向發(fā)育分化 為神經(jīng)干細(xì)胞功能的細(xì)胞培養(yǎng)基。由于祌經(jīng)干細(xì)胞在定向發(fā)育分化過程中細(xì)胞存 在不確定性，經(jīng)分化后的細(xì)胞是否繼承并具有原干細(xì)胞特征尚不能確定，因此臨 床應(yīng)用存在較大的風(fēng)險(xiǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種增強(qiáng)胎肝造血干細(xì)胞CD34 表達(dá)的培養(yǎng)液及其制備方法。本發(fā)明的培養(yǎng)液，其作用是對(duì)干細(xì)胞所具有的CD34 表達(dá)特征實(shí)施強(qiáng)化表達(dá)，達(dá)到可標(biāo)識(shí)、純化的范圍，從而極大地提高了干細(xì)胞可 標(biāo)識(shí)數(shù)量；本發(fā)明的制備方法，使原本造血干細(xì)胞中某些CD34表達(dá)弱的干細(xì)胞，重新顯現(xiàn)出來，使原有的造血干細(xì)胞數(shù)量更多的顯現(xiàn)出來，大幅提高了造血干細(xì) 胞純化數(shù)量，安全可靠，滿足臨床應(yīng)用。
本發(fā)明所涉及的上述增強(qiáng)胎肝造血干細(xì)胞CD34表達(dá)的培養(yǎng)液，其組分和重 量百分比為
MEM : 56. 5% — 64. 7%;
RPMI — 1640 : 29. 4%—30. 4%;
Hanks : 5.88%_13.0%;
人類干細(xì)胞生長(zhǎng)因子-2: 470 X 10—9 % — 1740 X 10_9 %; 人類干細(xì)胞生長(zhǎng)因子1.9X10—9 %_2. 8X10—9%; 人類粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子2. OX 10—9 %—2. 9X 10—9 %; CD135配體蛋白9.4X10—9%—10. 8X10—9 %; 人類促紅細(xì)胞生成因子1.4X10—9% —2. 4X10—9 %; 人類上皮細(xì)胞生成因子9. 4X 10—9% — 10. 8X 10—9 %; 人類促成纖維細(xì)胞生成因子-b:
9.4X1(T、一10.8X10—9 %。 本發(fā)明上述組分的術(shù)語(yǔ)和符號(hào)具體說明如下
所述的MEM，是指minimum essential medium培養(yǎng)基，由美國(guó)GIBCO公 司生產(chǎn)的動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基，含L一谷氨酰胺，不含碳酸氫銨、丙酮酸鈉，2'C—8 'C保存，更適于支持各種哺乳動(dòng)物細(xì)胞的生長(zhǎng)。已有公開文獻(xiàn)記載1、張迎春， 廖曉梅等，《不同培養(yǎng)基對(duì)海馬腦片活性及微管相關(guān)蛋白tau表達(dá)的影響》，中國(guó)
醫(yī)學(xué)科學(xué)院學(xué)報(bào)，中圖分類號(hào)R745.7文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)
1000-503X (2005) 04-0513-05; 2、韓明，董麗萍，袁芳，Earle' s液與MEM培 養(yǎng)基對(duì)神經(jīng)元活性的影響[J ],中國(guó)康復(fù)理論與實(shí)踐，2005 ,11 (2) :125 — 126。
所述的RPMI — 1640，是指RPMI —1640 medium培養(yǎng)基，由Roswell Park Memorial Institute開發(fā)用于培養(yǎng)正常的人白細(xì)胞的液體培養(yǎng)基，含L一谷氨酰 胺(L-Glutamine)，不含碳酸氫釹(HEPES)， 2。C一8。C保存。已有公開文獻(xiàn)記載: 1、黃蓓，李振剛等，《RPMI1640培養(yǎng)基對(duì)水螅體表滲透營(yíng)養(yǎng)的初步觀察》，動(dòng)物 學(xué)雜志，中圖分類號(hào)Q172，文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A，文章編號(hào)025023263 (2001) 06240203， 2001年;2、鄂征等，《組織培養(yǎng)技術(shù)》，北京人民衛(wèi)生出版社，1985.219。
所述的Hanks，是指平衡鹽緩沖溶液(GE應(yīng)ED Hanks)，是一種旨在用于 細(xì)胞和組織的清洗或組化預(yù)處理最常用的溶液，其標(biāo)準(zhǔn)化成分配方依據(jù)Hanks 和Wallace在1949年發(fā)表的成果，并符合美國(guó)體外組織培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì) (Tissue Culture Standards Committee, In Vitro)的規(guī)定。產(chǎn)地美國(guó)。產(chǎn)品 即到即用，嚴(yán)格無菌，性能穩(wěn)定。標(biāo)準(zhǔn)的Hanks平衡鹽溶液(HBSS)含有氯化 鉀、氯化鈉、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、D—葡萄糖等，但不含鈣、鎂離子。己 有公開文獻(xiàn)記載《中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 15193 — 10 — 94非程序性DNA 合成試驗(yàn)》。
人類干細(xì)胞生長(zhǎng)因子-2 ，全稱為human Stem Cell Growth Factor-2; 人類干細(xì)胞生長(zhǎng)因子，全稱為human Stem Cell Growth Factor;人類粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子，全稱為human Granulocyte Macrophage-Colony Stimulation Factor; CD135配體蛋白，全稱為human flt3 ligand;人類促 紅細(xì)胞生成因子，全稱為human Erythropoietin;人類上皮細(xì)胞生成因子，全 稱為human Epithelial Growth Factor;人類促成纖維細(xì)胞生成因子-b ，全 稱為human Fibroblast Growth Factor-b;上述術(shù)語(yǔ)在公開文獻(xiàn)均有記載。
本發(fā)明組分的優(yōu)選重量百分比為
MEM : 59. 36%—61%;
RPMI — 1640 : 29. 7%_30. 14%;
Hanks : 9. 3%—10. 5%;
人類千細(xì)胞生長(zhǎng)因子-2: 850X 10—9 %— 1260X 10—9 %; 人類干細(xì)胞生長(zhǎng)因子2. 1X10—9 % — 2. 5X1(T9%; 人類粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子2. 2X10—9%_2. 6X 10—9%; CD135配體蛋白:
9.8X10—9%—10. 4X10—9 %;
人類促紅細(xì)胞生成因子1. 7X 10—、一2. 1 X 10—9 %;
人類上皮細(xì)胞生成因子9. 7X10—、一10.4X10—9 %; 人類促成纖維細(xì)胞生成因子-b:
9. 6X 10—9%—10. 4X 10—9 %。
本發(fā)明所涉及的增強(qiáng)胎肝造血干細(xì)胞CD34表達(dá)的培養(yǎng)液的制備方法，使原本造血干細(xì)胞中某些CD34表達(dá)弱的干細(xì)胞，重新顯現(xiàn)出來，促進(jìn)干細(xì)胞自然的 CD34表達(dá)能力，將胎肝中CD34表達(dá)弱的造血干細(xì)胞表達(dá)出能被熒光標(biāo)記抗體所 能辨識(shí)出的水平。而原來干細(xì)胞中CD34表達(dá)強(qiáng)的干細(xì)胞不受影響，維持其原有 的CD34表達(dá)水平。通過細(xì)胞"信號(hào)"調(diào)節(jié)系統(tǒng)，將非活躍的CD34基因激活，致 使細(xì)胞增強(qiáng)CD34蛋白表達(dá)。因此本發(fā)明不是對(duì)造血干細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞分化和增殖， 而是使原有的造血干細(xì)胞數(shù)量更多的顯現(xiàn)出來，可大幅提高造血干細(xì)胞的純化數(shù) 量，滿足臨床應(yīng)用。
本發(fā)明所述的增強(qiáng)胎肝造血干細(xì)胞CD34表達(dá)的培養(yǎng)液可使CD34表達(dá)弱的 干細(xì)胞在特定的周期內(nèi)增強(qiáng)表達(dá)，使其CD34蛋白表達(dá)達(dá)到可被標(biāo)識(shí)范圍。以胎 肝造血干細(xì)胞為例，用常規(guī)熒光抗體標(biāo)記法，可標(biāo)記的CD34胎肝造血干細(xì)胞的 數(shù)量范圍為10 20X 106，而應(yīng)用本發(fā)明制備的"胎肝造血干細(xì)胞CD34增強(qiáng)表達(dá) 的培養(yǎng)液"處理和純化后，可使胎肝造血干細(xì)胞的可標(biāo)記數(shù)量提高5倍以上，即 可標(biāo)記造血干細(xì)胞數(shù)量為80 100X106。
本發(fā)明所涉及的上述增強(qiáng)胎肝造血干細(xì)胞CD34表達(dá)的培養(yǎng)液的制備方法， 包括以下步驟
① 按所述比例取MEM、 RPMI 1640、 Hanks混合后，充分?jǐn)嚢?，制得基礎(chǔ)培
養(yǎng)液；
② 按所述比例再取人類干細(xì)胞生長(zhǎng)因子-2、人類干細(xì)胞生長(zhǎng)因子、人類粒 細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子、CD135配體蛋白、人類促紅細(xì)胞生成因子、人類 上皮細(xì)胞生成因子、人類成纖維細(xì)胞生成因子-b依次加入基礎(chǔ)培養(yǎng)液中，充分 攪拌均勻、溶解；
③ 取19-20周標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)后的人類胎肝，將胎肝間充質(zhì)細(xì)胞分離，將純化出 的間充質(zhì)細(xì)胞，根據(jù)計(jì)數(shù)器的讀數(shù)取107個(gè)胎肝間充質(zhì)細(xì)胞置入1-75型培養(yǎng)瓶， 力口入DMEM培養(yǎng)液(DMEM培養(yǎng)液，Dulbecco' s modified Eagle' s medium)禾口 2%人血清進(jìn)行培養(yǎng)，經(jīng)10-14天的培養(yǎng)，將上清液抽出，用Hanks對(duì)T-75型培 養(yǎng)瓶中的胎肝間充質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行沖洗二次。然后加入DMEM培養(yǎng)液和5%人血清與胎 肝間充質(zhì)細(xì)胞在T-75型培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)混合，經(jīng)48小時(shí)連續(xù)培養(yǎng)(條件控制要求溫 度37。C， 0)2濃度5%)，將上清液全部收集。上清液經(jīng)過0.2微米濾器過濾后， 再經(jīng)過2500g的高速離心將全部細(xì)胞碎片及非溶解性的物質(zhì)去除，制得條件培養(yǎng)液。
④將條件培養(yǎng)液與MEM混合后，充分?jǐn)嚢杈鶆蚝笮纬苫旌吓囵B(yǎng)液，利用碳 酸氫鈉(0. 1 P mol NaHC03)將混合培養(yǎng)液的pH調(diào)節(jié)至7. 40 7. 45，經(jīng)過兩次 0. 2微米濾器過濾即可制得干細(xì)胞CD34增強(qiáng)表達(dá)培養(yǎng)液。
本發(fā)明的培養(yǎng)液，其作用是對(duì)干細(xì)胞所具有的CD34表達(dá)特征實(shí)施強(qiáng)化表達(dá)， 使原本即具有CD34表達(dá)特征的干細(xì)胞所具有的CD34表達(dá)特征得以強(qiáng)化，達(dá)到可 標(biāo)識(shí)、純化的范圍，從而極大地提高了干細(xì)胞可標(biāo)識(shí)數(shù)量，由于不存在細(xì)胞分化 過程，因此干細(xì)胞標(biāo)識(shí)、純化安全可靠，克服了現(xiàn)有技術(shù)中存在的細(xì)胞分化不確 定性的缺點(diǎn)。
本發(fā)明培養(yǎng)液的制備方法，使原本造血干細(xì)胞中某些CD34表達(dá)弱的干細(xì)胞， 重新顯現(xiàn)出來，促進(jìn)干細(xì)胞自然的CD34表達(dá)能力，將胎肝中CD34表達(dá)弱的造血 干細(xì)胞表達(dá)出能被熒光標(biāo)記抗體所能辨識(shí)出的水平。而原來干細(xì)胞中CD34表達(dá) 強(qiáng)的干細(xì)胞不受影響，維持其原有的CD34表達(dá)水平。通過細(xì)胞"信號(hào)"調(diào)節(jié)系 統(tǒng)，將非活躍的CD34基因表達(dá)細(xì)胞激活，因此本發(fā)明不是對(duì)造血干細(xì)胞進(jìn)行細(xì) 胞分化和增殖，而是使原有的造血干細(xì)胞數(shù)量更多的顯現(xiàn)出來，可大幅提高造血 干細(xì)胞純化數(shù)量，滿足臨床應(yīng)用。
具體實(shí)施方式
下面對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例作詳細(xì)說明本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提 下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例。 實(shí)施例一
本實(shí)施例增強(qiáng)胎肝造血干細(xì)胞CD34表達(dá)的培養(yǎng)液在總重量為1升(L)的 情況下組分配比為
RPMI — 1640 250 ml; Hanks 110 ml;
人類干細(xì)胞生長(zhǎng)因子-2
4yg ; 人類干細(xì)胞生長(zhǎng)因子16 ng; 人類粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子17 ng; CD135配體蛋白 92 ng;人類促紅細(xì)胞生成因子12 ng; 人類上皮細(xì)胞生成因子92 ng; 人類促成纖維細(xì)胞生成因子-b 92 ng; MEM 余量。
① 按上述比例取MEM、 RPMI — 1640、 Hanks混合后，充分?jǐn)嚢?，制得基礎(chǔ)培
養(yǎng)液；
② 按所述比例再取人類干細(xì)胞生長(zhǎng)因子-2、人類干細(xì)胞生長(zhǎng)因子、人類粒 細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子、CD135配體蛋白、人類促紅細(xì)胞生成因子、人類 上皮細(xì)胞生成因子、人類成纖維細(xì)胞生成因子-b依次加入基礎(chǔ)培養(yǎng)液中，充分 攪拌均勻、溶解；
③ 取19周標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)后的人類胎肝，將胎肝間充質(zhì)細(xì)胞分離，將純化出的間 充質(zhì)細(xì)胞，根據(jù)計(jì)數(shù)器的讀數(shù)取107個(gè)胎肝間充質(zhì)細(xì)胞置入T-75型培養(yǎng)瓶，加 入DMEM培養(yǎng)液(DMEM培養(yǎng)液，Dulbecco' s modified Eagle' s medium)禾口 2% 人血清進(jìn)行培養(yǎng)，經(jīng)13天的培養(yǎng)，將上清液抽出，用Ha流s對(duì)T-75型培養(yǎng)瓶中 的胎肝間充質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行沖洗二次。然后加入面EM培養(yǎng)液和5%人血清與胎肝間充 質(zhì)細(xì)胞在T-75型培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)混合，經(jīng)48小時(shí)連續(xù)培養(yǎng)(條件控制要求溫度37°C， 〔02濃度5%)，將上清液全部收集。上清液經(jīng)過0.2微米(yM)濾器過濾后，再 經(jīng)過2500g的高速離心將全部細(xì)胞碎片及非溶解性的物質(zhì)去除，制得條件培養(yǎng) 液；
④ 將條件培養(yǎng)液與MEM混合后，充分?jǐn)嚢杈鶆蚝笮纬苫旌吓囵B(yǎng)液，利用碳 酸氫鈉(0. 1 4 raol NaHC0》將混合培養(yǎng)液的pH調(diào)節(jié)至7. 42，經(jīng)過兩次0. 2微 米(UM)濾膜過濾即可制得干細(xì)胞CD34增強(qiáng)表達(dá)培養(yǎng)液。
實(shí)施效果應(yīng)用上述方法制備的"胎肝造血干細(xì)胞CD34增強(qiáng)表達(dá)的培養(yǎng) 液"，可使胎肝造血干細(xì)胞的可標(biāo)記數(shù)量提高至80X 106。
實(shí)施例二
本實(shí)施例增強(qiáng)胎肝造血干細(xì)胞CD34表達(dá)的培養(yǎng)液在總重量為1 L的情況下 組分配比為
RPMI — 1640 300 ml;;Hanks 70 ml;
人類干細(xì)胞生長(zhǎng)因子-2 20yg ; 人類干細(xì)胞生長(zhǎng)因子32 ng; 人類粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子33 rig; CD135配體蛋白 108 ng; 人類促紅細(xì)胞生成因子28 ng; 人類上皮細(xì)胞生成因子108 ng; 人類促成纖維細(xì)胞生成因子-b 108 ng; MEM 余量。
① 按上述比例取MEM、 RPMI — 1640、 Hanks混合后，充分?jǐn)嚢?，制得基礎(chǔ)培
養(yǎng)液；
② 按所述比例再取人類干細(xì)胞生長(zhǎng)因子-2、人類干細(xì)胞生長(zhǎng)因子、人類粒 細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子、CD135配體蛋白、人類促紅細(xì)胞生成因子、人類 上皮細(xì)胞生成因子、人類成纖維細(xì)胞生成因子-b依次加入基礎(chǔ)培養(yǎng)液中，充分 攪拌均勻、溶解；
③ 取19周標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)后的人類胎肝，將胎肝間充質(zhì)細(xì)胞分離，將純化出的間 充質(zhì)細(xì)胞，根據(jù)計(jì)數(shù)器的讀數(shù)取107個(gè)胎肝間充質(zhì)細(xì)胞置入T-75型培養(yǎng)瓶，加 入DMEM培養(yǎng)液(DMEM培養(yǎng)液，Dulbecco' s modified Eagle' s medium)禾口 2% 人血清進(jìn)行培養(yǎng)，經(jīng)13天的培養(yǎng)，將上清液抽出，用Hanks對(duì)T-75型培養(yǎng)瓶中 的胎肝間充質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行沖洗二次。然后加入DMEM培養(yǎng)液和5%人血清與胎肝間充 質(zhì)細(xì)胞在T-75型培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)混合，經(jīng)48小時(shí)連續(xù)培養(yǎng)(條件控制要求溫度37°C， 0)2濃度5%)，將上清液全部收集。上清液經(jīng)過0.2微米(iiM)濾器過濾后，再 經(jīng)過2500g的高速離心將全部細(xì)胞碎片及非溶解性的物質(zhì)去除，制得條件培養(yǎng) 液；
④ 將條件培養(yǎng)液與MEM混合后，充分?jǐn)嚢杈鶆蚝笮纬苫旌吓囵B(yǎng)液，利用碳 酸氫鈉(0.1 M mol NaHCQ》將混合培養(yǎng)液的pH調(diào)節(jié)至7. 42，經(jīng)過兩次0. 2微 米(W M)濾膜過濾即可制得干細(xì)胞CD34增強(qiáng)表達(dá)培養(yǎng)液。
實(shí)施效果應(yīng)用上述方法制備的"胎肝造血干細(xì)胞CD34增強(qiáng)表達(dá)的培養(yǎng) 液"，可使胎肝造血干細(xì)胞的可標(biāo)記數(shù)量提高至85X 106。實(shí)施例三
本實(shí)施例增強(qiáng)胎肝造血干細(xì)胞CD34表達(dá)的培養(yǎng)液在總重量為1L的情況下 組分配比為
RPMI — 1640 301 ml; Hanks 98ml;
人類干細(xì)胞生長(zhǎng)因子-2
13ixg ; 人類干細(xì)胞生長(zhǎng)因子25 ng; 人類粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落剌激因子30 ng; CD135配體蛋白 101 ng; 人類促紅細(xì)胞生成因子21 ng; 人類上皮細(xì)胞生成因子
101 ng; 人類促成纖維細(xì)胞生成因子-b 101 ng; MEM 余量。
① 按上述比例取MEM、 RPMI — 1640、 Hanks混合后，充分?jǐn)嚢?，制得基礎(chǔ)培
養(yǎng)液；
② 按所述比例再取人類干細(xì)胞生長(zhǎng)因子-2、人類干細(xì)胞生長(zhǎng)因子、人類粒 細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子、CD135配體蛋白、人類促紅細(xì)胞生成因子、人類 上皮細(xì)胞生成因子、人類成纖維細(xì)胞生成因子-b依次加入基礎(chǔ)培養(yǎng)液中，充分 攪拌均勻、溶解；
③ 取19周標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)后的人類胎肝，將胎肝間充質(zhì)細(xì)胞分離，將純化出的間 充質(zhì)細(xì)胞，根據(jù)計(jì)數(shù)器的讀數(shù)取107個(gè)胎肝間充質(zhì)細(xì)胞置入1，-75型培養(yǎng)瓶，加 入DMEM培養(yǎng)液(DMEM培養(yǎng)液，Dulbecco' s modified Eagle' s medium)和2% 人血清進(jìn)行培養(yǎng)，經(jīng)13天的培養(yǎng)，將上清液抽出，用Hanks對(duì)T-75型培養(yǎng)瓶中 的胎肝間充質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行沖洗二次。然后加入DMEM培養(yǎng)液和5%人血清與胎肝間充 質(zhì)細(xì)胞在T-75型培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)混合，經(jīng)48小時(shí)連續(xù)培養(yǎng)(條件控制要求溫度37°C， C02濃度5。/。)，將上清液全部收集。上清液經(jīng)過0.2微米(uM)濾器過濾后，再 經(jīng)過2500g的高速離心將全部細(xì)胞碎片及非溶解性的物質(zhì)去除，制得條件培養(yǎng) 液；④將條件培養(yǎng)液與MEM混合后，充分?jǐn)嚢杈鶆蚝笮纬苫旌吓囵B(yǎng)液，利用碳 酸氫鈉(0.1 P mol NaHC03)將混合培養(yǎng)液的pH調(diào)節(jié)至7. 42，經(jīng)過兩次0. 2微 米(PM)濾膜過濾即可制得干細(xì)胞CD34增強(qiáng)表達(dá)培養(yǎng)液。
實(shí)施效果應(yīng)用上述方法制備的"胎肝造血干細(xì)胞CD34增強(qiáng)表達(dá)的培養(yǎng) 液"，可使胎肝造血干細(xì)胞的可標(biāo)記數(shù)量提高至90X 106。
實(shí)施例四
本實(shí)施例增強(qiáng)胎肝造血干細(xì)胞CD34表達(dá)的培養(yǎng)液在總重量為1L的情況下 組分配比為-
RPMI — 1640 285ml; Hanks 130ml;
人類干細(xì)胞生長(zhǎng)因子-2 6yg ; 人類干細(xì)胞生長(zhǎng)因子19ng; 人類粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子21ng; CD135配體蛋白 96ng; 人類促紅細(xì)胞生成因子16ng; 人類上皮細(xì)胞生成因子96ng; 人類促成纖維細(xì)胞生成因子-b 96ng; MEM 余量。
① 按上述比例取MEM、 RPMI — 1640、 Hanks混合后，充分?jǐn)嚢瑁频没A(chǔ)培
養(yǎng)液；
② 按所述比例再取人類干細(xì)胞生長(zhǎng)因子-2、人類干細(xì)胞生長(zhǎng)因子、人類粒 細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子、CD135配體蛋白、人類促紅細(xì)胞生成因子、人類 上皮細(xì)胞生成因子、人類成纖維細(xì)胞生成因子-b依次加入基礎(chǔ)培養(yǎng)液中，充分 攪拌均勻、溶解；
③ 取20周標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)后的人類胎肝，將胎肝間充質(zhì)細(xì)胞分離，將純化出的間 充質(zhì)細(xì)胞，根據(jù)計(jì)數(shù)器的讀數(shù)取107個(gè)胎肝間充質(zhì)細(xì)胞置入T-75型培養(yǎng)瓶，加 入DMEM培養(yǎng)液(DMEM培養(yǎng)液，Dulbecco' s modified Eagle' s medium)禾口 2% 人血清進(jìn)行培養(yǎng)，經(jīng)12天的培養(yǎng)，將上清液抽出，用Hanks對(duì)T-75型培養(yǎng)瓶中的胎肝間充質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行沖洗二次。然后加入DMEM培養(yǎng)液和5%人血清與胎肝間充 質(zhì)細(xì)胞在T-75型培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)混合，經(jīng)48小時(shí)連續(xù)培養(yǎng)(條件控制要求溫度37°C， 0)2濃度5%)，將上清液全部收集。上清液經(jīng)過0.2微米(yM)濾器過濾后，再 經(jīng)過2500g的高速離心將全部細(xì)胞碎片及非溶解性的物質(zhì)去除，制得條件培養(yǎng) 液；
④將條件培養(yǎng)液與MEM混合后，充分?jǐn)嚢杈鶆蚝笮纬苫旌吓囵B(yǎng)液，利用碳 酸氫鈉(0.1 Pmol NaHC03)將混合培養(yǎng)液的pH調(diào)節(jié)至7. 43,經(jīng)過兩次0. 2微 米(yM)濾膜過濾即可制得干細(xì)胞CD34增強(qiáng)表達(dá)培養(yǎng)液。
實(shí)施效果應(yīng)用上述方法制備的"胎肝造血干細(xì)胞CD34增強(qiáng)表達(dá)的培養(yǎng) 液"，可使胎肝造血干細(xì)胞的可標(biāo)記數(shù)量提高至89X106。
實(shí)施例五
本實(shí)施例增強(qiáng)胎肝造血干細(xì)胞CD34表達(dá)的培養(yǎng)液在總重量為1L的情況下 組分配比為
RPMI — 1640 325ml; Hanks 50ml;
人類干細(xì)胞生長(zhǎng)因子-2 16yg ; 人類干細(xì)胞生長(zhǎng)因子27ng; 人類粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子29ng; CD135配體蛋白 104ng; 人類促紅細(xì)胞生成因子24ng; 人類上皮細(xì)胞生成因子104ng; 人類促成纖維細(xì)胞生成因子-b 104ng; MEM 余量。
① 按上述比例取MEM、 RPMI — 1640、 Hanks混合后，充分?jǐn)嚢?，制得基礎(chǔ)培
養(yǎng)液；
② 按所述比例再取人類干細(xì)胞生長(zhǎng)因子-2、人類干細(xì)胞生長(zhǎng)因子、人類粒 細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子、CD135配體蛋白、人類促紅細(xì)胞生成因子、人類 上皮細(xì)胞生成因子、人類成纖維細(xì)胞生成因子-b依次加入基礎(chǔ)培養(yǎng)液中，充分?jǐn)嚢杈鶆?、溶解?br>③取20周標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)后的人類胎肝，將胎肝間充質(zhì)細(xì)胞分離，將純化出的間 充質(zhì)細(xì)胞，根據(jù)計(jì)數(shù)器的讀數(shù)取107個(gè)胎肝間充質(zhì)細(xì)胞置入T-75型培養(yǎng)瓶，加 入DMEM培養(yǎng)液(廳M培養(yǎng)液，Dulbecco， s modified Eagle， s medium)和2% 人血清進(jìn)行培養(yǎng)，經(jīng)12天的培養(yǎng)，將上清液抽出，用Hanks對(duì)T-75型培養(yǎng)瓶中 的胎肝間充質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行沖洗二次。然后加入DMEM培養(yǎng)液和5%人血清與胎肝間充 質(zhì)細(xì)胞在T-75型培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)混合，經(jīng)48小時(shí)連續(xù)培養(yǎng)(條件控制要求溫度37°C， 0)2濃度5%)，將上清液全部收集。上清液經(jīng)過0.2微米(uM)濾器過濾后，再 經(jīng)過2500g的高速離心將全部細(xì)胞碎片及非溶解性的物質(zhì)去除，制得條件培養(yǎng) 液；
將條件培養(yǎng)液與MEM混合后，充分?jǐn)嚢杈鶆蚝笮纬苫旌吓囵B(yǎng)液，利用碳 酸氫鈉(0. 1 P mol NaHC03)將混合培養(yǎng)液的pH調(diào)節(jié)至7. 43，經(jīng)過兩次0. 2微 米(uM)濾膜過濾即可制得干細(xì)胞CD34增強(qiáng)表達(dá)培養(yǎng)液。
實(shí)施效果應(yīng)用上述方法制備的"胎肝造血干細(xì)胞CD34增強(qiáng)表達(dá)的培養(yǎng) 液"，可使胎肝造血干細(xì)胞的可標(biāo)記數(shù)量提高至91X106。
實(shí)施例六
本實(shí)施例增強(qiáng)胎肝造血干細(xì)胞CD34表達(dá)的培養(yǎng)液在總重量為1L的情況下 組分配比為
RPMI — 1640 299ml; Hanks 102ml;
人類干細(xì)胞生長(zhǎng)因子-2 12ng ; 人類干細(xì)胞生長(zhǎng)因子23ng; 人類粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子28ng; CD135配體蛋白 99ng; 人類促紅細(xì)胞生成因子 19ng; 人類上皮細(xì)胞生成因子99ng; 人類促成纖維細(xì)胞生成因子-b 99ng; MEM 余量。① 按上述比例取MEM、 RPMI — 1640、 Hanks混合后，充分?jǐn)嚢?，制得基礎(chǔ)培
養(yǎng)液；
② 按所述比例再取人類干細(xì)胞生長(zhǎng)因子-2、人類干細(xì)胞生長(zhǎng)因子、人類粒 細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子、CD135配體蛋白、人類促紅細(xì)胞生成因子、人類 上皮細(xì)胞生成因子、人類成纖維細(xì)胞生成因子-b依次加入基礎(chǔ)培養(yǎng)液中，充分 攪拌均勻、溶解；
③ 取20周標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)后的人類胎肝，將胎肝間充質(zhì)細(xì)胞分離，將純化出的間 充質(zhì)細(xì)胞，根據(jù)計(jì)數(shù)器的讀數(shù)取107個(gè)胎肝間充質(zhì)細(xì)胞置入T-75型培養(yǎng)瓶，加 入DMEM培養(yǎng)液(DMEM培養(yǎng)液，Dulbecco' s modified Eagle， s medium)和2% 人血清進(jìn)行培養(yǎng)，經(jīng)12天的培養(yǎng)，將上清液抽出，用Hanks對(duì)T-75型培養(yǎng)瓶中 的胎肝間充質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行沖洗二次。然后加入DMEM培養(yǎng)液和5%人血清與胎肝間充 質(zhì)細(xì)胞在T-75型培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)混合，經(jīng)48小時(shí)連續(xù)培養(yǎng)(條件控制要求溫度37'C， 0)2濃度5%)，將上清液全部收集。上清液經(jīng)過0.2微米(nM)濾器過濾后，再 經(jīng)過2500g的高速離心將全部細(xì)胞碎片及非溶解性的物質(zhì)去除，制得條件培養(yǎng) 液；
④ 將條件培養(yǎng)液與MEM混合后，充分?jǐn)嚢杈鶆蚝笮纬苫旌吓囵B(yǎng)液，利用碳 酸氫鈉(0.1 P mol NaHCO》將混合培養(yǎng)液的pH調(diào)節(jié)至7. 43，經(jīng)過兩次0. 2微 米(UM)濾膜過濾即可制得干細(xì)胞CD34增強(qiáng)表達(dá)培養(yǎng)液。
實(shí)施效果應(yīng)用上述方法制備的"胎肝造血干細(xì)胞CD34增強(qiáng)表達(dá)的培養(yǎng) 液"，可使胎肝造血干細(xì)胞的可標(biāo)記數(shù)量提高至93X 106。
實(shí)施例七
本實(shí)施例增強(qiáng)胎肝造血干細(xì)胞CD34表達(dá)的培養(yǎng)液在總重量為1L的情況下 組分配比為
RPMI — 1640 293ml; Hanks 114ml;
人類干細(xì)胞生長(zhǎng)因子-2 9yg ;
人類干細(xì)胞生長(zhǎng)因子21ng;
人類粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子24ng;CD135配體蛋白 98ng; 人類促紅細(xì)胞生成因子18ng; 人類上皮細(xì)胞生成因子98ng; 人類促成纖維細(xì)胞生成因子-b 98ng; MEM 余量。
① 按上述比例取MEM、 RPMI — 1640、 Hanks混合后，充分?jǐn)嚢瑁频没A(chǔ)培
養(yǎng)液；
② 按所述比例再取人類干細(xì)胞生長(zhǎng)因子-2、人類干細(xì)胞生長(zhǎng)因子、人類粒 細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子、CD135配體蛋白、人類促紅細(xì)胞生成因子、人類 上皮細(xì)胞生成因子、人類成纖維細(xì)胞生成因子-b依次加入基礎(chǔ)培養(yǎng)液中，充分 攪拌均勻、溶解；
③ 取19周標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)后的人類胎肝，將胎肝間充質(zhì)細(xì)胞分離，將純化出的間 充質(zhì)細(xì)胞，根據(jù)計(jì)數(shù)器的讀數(shù)取107個(gè)胎肝間充質(zhì)細(xì)胞置入T-75型培養(yǎng)瓶，加 入DMEM培養(yǎng)液(D醒培養(yǎng)液，Dulbecco' s modified Eagle' s medium)禾口 2% 人血清進(jìn)行培養(yǎng)，經(jīng)13天的培養(yǎng)，將上清液抽出，用Hanks對(duì)T-75型培養(yǎng)瓶中 的胎肝間充質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行沖洗二次。然后加入DMEM培養(yǎng)液和5%人血清與胎肝間充 質(zhì)細(xì)胞在T-75型培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)混合，經(jīng)48小時(shí)連續(xù)培養(yǎng)(條件控制要求溫度37°C, 0)2濃度5%)，將上清液全部收集。上清液經(jīng)過0.2微米(uM)濾器過濾后，再 經(jīng)過2500g的高速離心將全部細(xì)胞碎片及非溶解性的物質(zhì)去除，制得條件培養(yǎng) 液；
④ 將條件培養(yǎng)液與MEM混合后，充分?jǐn)嚢杈鶆蚝笮纬苫旌吓囵B(yǎng)液，利用碳 酸氫鈉(0.1 P mol NaHCO:.,)將混合培養(yǎng)液的pH調(diào)節(jié)至7. 45，經(jīng)過兩次0. 2微 米(yM)濾膜過濾即可制得干細(xì)胞CD34增強(qiáng)表達(dá)培養(yǎng)液。
實(shí)施效果應(yīng)用上述方法制備的"胎肝造血干細(xì)胞CD34增強(qiáng)表達(dá)的培養(yǎng) 液"，可使胎肝造血干細(xì)胞的可標(biāo)記數(shù)量提高至98X 106。
實(shí)施例八
本實(shí)施例增強(qiáng)胎肝造血干細(xì)胞CD34表達(dá)的培養(yǎng)液在總重量為1L的情況下 組分配比為RPMI —1640 313ml; Hanks 74ml;
人類干細(xì)胞生長(zhǎng)因子-2 llyg ; 人類干細(xì)胞生長(zhǎng)因子23ng; 人類粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子26ng; CD135配體蛋白 102ng; 人類促紅細(xì)胞生成因子22ng; 人類上皮細(xì)胞生成因子102ng; 人類促成纖維細(xì)胞生成因子-b 102ng; MEM 余量。
① 按上述比例取MEM、 RPMI — 1640、 Hanks混合后，充分?jǐn)嚢瑁频没A(chǔ)培 養(yǎng)液；
② 按所述比例再取人類干細(xì)胞生長(zhǎng)因子-2、人類干細(xì)胞生長(zhǎng)因子、人類粒 細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子、CD135配體蛋白、人類促紅細(xì)胞生成因子、人類 上皮細(xì)胞生成因子、人類成纖維細(xì)胞生成因子-b依次加入基礎(chǔ)培養(yǎng)液中，充分 攪拌均勻、溶解；
③ 取19周標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)后的人類胎肝，將胎肝間充質(zhì)細(xì)胞分離，將純化出的間 充質(zhì)細(xì)胞，根據(jù)計(jì)數(shù)器的讀數(shù)取107個(gè)胎肝間充質(zhì)細(xì)胞置入T-75型培養(yǎng)瓶，加 入DMEM培養(yǎng)液(DMEM培養(yǎng)液，Dulbecco' s modified Eagle' s medium)和2% 人血清進(jìn)行培養(yǎng)，經(jīng)13天的培養(yǎng)，將上清液抽出，用Hanks對(duì)T-75型培養(yǎng)瓶中 的胎肝間充質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行沖洗二次。然后加入DMEM培養(yǎng)液和5%人血清與胎肝間充 質(zhì)細(xì)胞在T-75型培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)混合，經(jīng)48小時(shí)連續(xù)培養(yǎng)(條件控制要求溫度37°C， 0)2濃度5%)，將上清液全部收集。上清液經(jīng)過O. 2微米(yM)濾器過濾后，再 經(jīng)過2500g的高速離心將全部細(xì)胞碎片及非溶解性的物質(zhì)去除，制得條件培養(yǎng) 液；
④ 將條件培養(yǎng)液與MEM混合后，充分?jǐn)嚢杈鶆蚝笮纬苫旌吓囵B(yǎng)液，利用碳 酸氫鈉(0. 1 4 mol NaHCO:,)將混合培養(yǎng)液的pH調(diào)節(jié)至7. 45，經(jīng)過兩次0. 2微 米(uM)濾膜過濾即可制得干細(xì)胞CD34增強(qiáng)表達(dá)培養(yǎng)液。
實(shí)施效果應(yīng)用上述方法制備的"胎肝造血干細(xì)胞CD34增強(qiáng)表達(dá)的培養(yǎng)
19液"，可使胎肝造血干細(xì)胞的可標(biāo)記數(shù)量提高至99X106。 實(shí)施例九
本實(shí)施例增強(qiáng)胎肝造血干細(xì)胞CD34表達(dá)的培養(yǎng)液在總重量為1L的情況下 組分配比為-
RPMI — 1640 300ml; Hanks 100ml;
人類干細(xì)胞生長(zhǎng)因子-2 ll"g ; 人類干細(xì)胞生長(zhǎng)因子24ng; 人類粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子29ng/l CD135配體蛋白 100ng; 人類促紅細(xì)胞生成因子20ng; 人類上皮細(xì)胞生成因子 100ng; 人類促成纖維細(xì)胞生成因子-b 100ng; MEM 余量。
① 按上述比例取MEM、 RPMI — 1640、 Hanks混合后，充分?jǐn)嚢瑁频没A(chǔ)培 養(yǎng)液；
② 按所述比例再取人類干細(xì)胞生長(zhǎng)因子-2、人類干細(xì)胞生長(zhǎng)因子、人類粒 細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子、CD135配體蛋白、人類促紅細(xì)胞生成因子、人類 上皮細(xì)胞生成因子、人類成纖維細(xì)胞生成因子-b依次加入基礎(chǔ)培養(yǎng)液中，充分 攪拌均勻、溶解；
③ 取19周標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)后的人類胎肝，將胎肝間充質(zhì)細(xì)胞分離，將純化出的間 充質(zhì)細(xì)胞，根據(jù)計(jì)數(shù)器的讀數(shù)取107個(gè)胎肝間充質(zhì)細(xì)胞置入T-75型培養(yǎng)瓶，加 入DMEM培養(yǎng)液(函EM培養(yǎng)液，Dulbecco， s modified Eagle' s medium)和2% 人血清進(jìn)行培養(yǎng)，經(jīng)13天的培養(yǎng)，將上清液抽出，用Hanks對(duì)T-75型培養(yǎng)瓶中 的胎肝間充質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行沖洗二次。然后加入DMEM培養(yǎng)液和5%人血清與胎肝間充 質(zhì)細(xì)胞在T-75型培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)混合，經(jīng)48小時(shí)連續(xù)培養(yǎng)(條件控制要求溫度37°C， (:02濃度5%)，將上清液全部收集。上清液經(jīng)過0.2微米(yM)濾器過濾后，再 經(jīng)過2500g的高速離心將全部細(xì)胞碎片及非溶解性的物質(zhì)去除，制得條件培養(yǎng)液；
④將條件培養(yǎng)液與MEM混合后，充分?jǐn)嚢杈鶆蚝笮纬苫旌吓囵B(yǎng)液，利用碳 酸氫鈉(0.1 P mol NaHC03)將混合培養(yǎng)液的pH調(diào)節(jié)至7. 45，經(jīng)過兩次0. 2微 米(UM)濾膜過濾即可制得干細(xì)胞CD34增強(qiáng)表達(dá)培養(yǎng)液。
實(shí)施效果應(yīng)用上述方法制備的培養(yǎng)液，可使胎肝造血干細(xì)胞的可標(biāo)記數(shù) 量提高至100 X 106。
權(quán)利要求
1、一種增強(qiáng)胎肝造血干細(xì)胞CD34表達(dá)的培養(yǎng)液，其特征在于，組分和重量百分比為
MEM56.5％-64.7％；
RPMI-164029.4％-30.4％；
Hanks5.88％-13.0％；
人類干細(xì)胞生長(zhǎng)因子-2470×10-9％-1740×10-9％；
人類干細(xì)胞生長(zhǎng)因子1.9×10-9％-2.8×10-9％；
人類粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子2.0×10-9％-2.9×10-9％；
CD135配體蛋白9.4×10-9％-10.8×10-9％；
人類促紅細(xì)胞生成因子1.4×10-9％-2.4×10-9％；
人類上皮細(xì)胞生成因子9.4×10-9％-10.8×10-9％；
人類促成纖維細(xì)胞生成因子-b9.4×10-9％-10.8×10-9％。
2、 根據(jù)權(quán)利要求
1所述的增強(qiáng)胎肝造血干細(xì)胞CD34表達(dá)的培養(yǎng)液，其特 征是，組分和重量百分比為MEM : 59. 36%—61%;RPMI — 1640 : 29. 7%_30. 14%;Hanks : 9. 3%—10. 5%;人類干細(xì)胞生長(zhǎng)因子-2: 850 X 10—9 %—1260X 10—9%; 人類干細(xì)胞生長(zhǎng)因子2.1X10—9 % — 2.5Xl(T'%; 人類粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子2. 2X l(T % — 2. 6X 10—9 %; CD135配體蛋白:
9. 8X10—9%—10. 4X10—9 %;人類促紅細(xì)胞生成因子
1.7X10—、一2. 1X10—9 %;人類上皮細(xì)胞生成因子9. 7X10—9%—10. 4X10—9 %; 人類促成纖維細(xì)胞生成因子-b:
9. 6X10—、一10. 4X10—9 %。
3、 一種如權(quán)利要求
l所述的增強(qiáng)胎肝造血干細(xì)胞CD34表達(dá)的培養(yǎng)液的制 備方法，其特征是，包括以下步驟① 按所述比例取MEM、 RPMI 1640、 Hanks混合后，充分?jǐn)嚢?，制得基礎(chǔ)培養(yǎng)液；② 按所述比例再取人類干細(xì)胞生長(zhǎng)因子-2、人類干細(xì)胞生長(zhǎng)因子、人類粒 細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子、CD135配體蛋白、人類促紅細(xì)胞生成因子、人類 上皮細(xì)胞生成因子、人類成纖維細(xì)胞生成因子-b依次加入基礎(chǔ)培養(yǎng)液中，充分 攪拌均勻、溶解；③ 將胎肝間充質(zhì)細(xì)胞分離，將純化出的間充質(zhì)細(xì)胞，根據(jù)計(jì)數(shù)器的讀數(shù)取 107個(gè)胎肝間充質(zhì)細(xì)胞置入培養(yǎng)瓶，加入DMEM培養(yǎng)液和2%人血清進(jìn)行培養(yǎng)，然 后將上清液抽出，進(jìn)行沖洗，進(jìn)一步加入DMEM培養(yǎng)液和5%人血清與胎肝間充質(zhì)細(xì)胞在培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)混合，連 續(xù)培養(yǎng)將上清液全部收集，上清液經(jīng)過過濾后，再經(jīng)過離心，將全部細(xì)胞碎片及非溶解性的物質(zhì)去除， 制得條件培養(yǎng)液；④ 將條件培養(yǎng)液與MEM混合后，充分?jǐn)嚢杈鶆蚝笮纬苫旌吓囵B(yǎng)液，利用碳 酸氫鈉將混合培養(yǎng)液的pH調(diào)節(jié)至7.40 7.45，經(jīng)過過濾即可制得干細(xì)胞CD34增強(qiáng)表達(dá)培養(yǎng)液。
4、 根據(jù)權(quán)利要求
3所述的增強(qiáng)胎肝造血干細(xì)胞CD34表達(dá)的培養(yǎng)液的制備 方法，其特征是，歩驟③中所述的胎肝，是指取19-20周標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)后的人類胎 肝。
5、 根據(jù)權(quán)利要求
3所述的增強(qiáng)胎肝造血干細(xì)胞CD34表達(dá)的培養(yǎng)液的制備 方法，其特征是，步驟③中所述的2%人血清進(jìn)行培養(yǎng)，是指經(jīng)10-14天的培 養(yǎng)，
6、 根據(jù)權(quán)利要求
3所述的增強(qiáng)胎肝造血干細(xì)胞CD34表達(dá)的培養(yǎng)液的制備 方法，其特征是，歩驟③中所述的將上清液抽出后，用Hanks對(duì)培養(yǎng)瓶中的胎肝 間充質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行沖洗二次。
7、 根據(jù)權(quán)利要求
3所述的增強(qiáng)胎肝造血干細(xì)胞CD34表達(dá)的培養(yǎng)液的制備 方法，其特征是，歩驟③中所述的將上清液全部收集前，經(jīng)48小時(shí)連續(xù)培養(yǎng)， 連續(xù)培養(yǎng)條件控制要求溫度37'C， (:02濃度5%。
8、 根據(jù)權(quán)利要求
3所述的增強(qiáng)胎肝造血干細(xì)胞CD34表達(dá)的培養(yǎng)液的制備方法，其特征是，所述的過濾，是指上清液經(jīng)過0.2微米濾器過濾后。
9、 根據(jù)權(quán)利要求
3所述的增強(qiáng)胎肝造血干細(xì)胞CD34表達(dá)的培養(yǎng)液的制備 方法，其特征是，步驟③中所述的離心，是指經(jīng)過2500g的高速離心。
10、 根據(jù)權(quán)利要求
3所述的增強(qiáng)胎肝造血干細(xì)胞CD34表達(dá)的培養(yǎng)液的制備 方法，其特征是，步驟④中所述的碳酸氫鈉，是指0. 1 P mol NaHC03。
專利摘要
本發(fā)明涉及一種生物工程技術(shù)領(lǐng)域：
的增強(qiáng)胎肝造血干細(xì)胞CD34表達(dá)的培養(yǎng)液及其制備方法。培養(yǎng)液組分和重量百分比為MEM56.5％-64.7％；RPMI-164029.4％-30.4％；Hanks5.88％-13.0％等。培養(yǎng)液的制備方法①制得基礎(chǔ)培養(yǎng)液；②按所述比例再取相關(guān)組分依次加入基礎(chǔ)培養(yǎng)液中，攪拌、溶解；③將純化出的間充質(zhì)細(xì)胞，置入培養(yǎng)瓶，進(jìn)行培養(yǎng)、沖洗，混合，連續(xù)培養(yǎng)將上清液全部收集，經(jīng)過過濾后，離心，將全部細(xì)胞碎片及非溶解性的物質(zhì)去除，制得條件培養(yǎng)液；④將條件培養(yǎng)液與MEM混合后，利用碳酸氫鈉將混合培養(yǎng)液的pH調(diào)節(jié)至7.40～7.45，經(jīng)過過濾即得培養(yǎng)液。本發(fā)明對(duì)干細(xì)胞所具有的CD34表達(dá)特征實(shí)施強(qiáng)化表達(dá)，達(dá)到可標(biāo)識(shí)、純化的范圍，提高了干細(xì)胞可標(biāo)識(shí)數(shù)量，安全可靠，滿足臨床應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12P21/04GKCN101314767SQ200810040136
公開日2008年12月3日 申請(qǐng)日期2008年7月3日
發(fā)明者章永泰, 珺 趙, 郝曉南 申請(qǐng)人:上海天生生物科技有限公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan