專利名稱:一種黑曲霉發(fā)酵生產(chǎn)阿魏酸酯酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域：
，尤其涉及一種黑曲霉發(fā)酵生產(chǎn)阿魏酸酯酶的方法。
背景技術(shù)：
阿魏酸酯酶又稱肉桂酸酯酶，它是一種羧酸酯酶，指能水解阿魏酸甲酯、低聚糖阿魏酸酯和多糖阿魏酸酯中的酯鍵，將阿魏酸游離出來(lái)的酶。用阿魏酸酯酶處理植物性原料在食品、飼料和造紙等工業(yè)中有著光明的前景。
霉菌是能引起物種霉變的絲狀真菌的統(tǒng)稱，是真菌的一部分。凡是生長(zhǎng)在培養(yǎng)基上呈絨毛狀、蜘蛛網(wǎng)狀或絮狀菌絲體的菌落，都稱之為霉菌。霉菌在自然界的分布非常廣泛，與人們的生活也息息相關(guān)，如用于傳統(tǒng)的釀酒、制醬和制作副食品及其他的發(fā)酵食品等，它們?cè)诠I(yè)也有非常廣泛的應(yīng)用，如用霉菌發(fā)酵來(lái)生產(chǎn)抗生素、生物農(nóng)藥、天然色素以及各種酶類等。但霉菌的液體發(fā)酵存在著許多缺點(diǎn)，如培養(yǎng)基粘度高、菌絲結(jié)成大團(tuán)、氧氣供應(yīng)不足、營(yíng)養(yǎng)傳遞不暢等，這就限制了它的應(yīng)用，如何解決這個(gè)問(wèn)題已成為當(dāng)今研究的熱點(diǎn)。
公開(kāi)號(hào)CN 102796673A的發(fā)明專利申請(qǐng)公開(kāi)了一株阿魏酸酯酶高產(chǎn)菌株及利用該菌株進(jìn)行液體發(fā)酵制備阿魏酸酯酶的方法，該菌株為綠色木霉(Trichodermaviride)JBSH-OOl，保藏號(hào)為CGMCCN0.5612，利用該菌株通過(guò)液體發(fā)酵可生產(chǎn)得到阿魏酸酯酶。但該方法中應(yīng)用阿魏酸酯酶產(chǎn)生和積累誘導(dǎo)工序，在發(fā)酵過(guò)程中需要添加誘導(dǎo)因子，且需不斷補(bǔ)加碳源、氮源，工序較繁瑣。
公告號(hào)CN 102286442B的發(fā)明專利公開(kāi)了一種煙曲霉發(fā)酵生產(chǎn)阿魏酸酯酶的方法，包括:將經(jīng)活化的煙曲霉(Aspergillus fumigatus)CGMCCN0.3.5835接種于培養(yǎng)液中，并在25 30°C下發(fā)酵培養(yǎng)2 6天；其中，所述的培養(yǎng)液由玉米粉或麩皮與基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基組成。公開(kāi)號(hào)CN102796670A的發(fā)明專利申請(qǐng)公開(kāi)了一種黑曲霉菌株，命名為黑曲霉(Aspergillus niger)ZJUQH2012147，保藏編號(hào)為 CGMCC N0.6152 ;該申請(qǐng)還公開(kāi)了采用該菌株生產(chǎn)阿魏酸酯酶的方法，包括:將黑曲霉ZJUQH201217接入種子培養(yǎng)基進(jìn)行增殖培養(yǎng)，獲得種子液；將種子液接入發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。這兩種方法都能夠發(fā)酵生產(chǎn)得到阿魏酸酯酶，但其發(fā)酵過(guò)程中存在著霉菌液體發(fā)酵的共同缺點(diǎn)，即菌絲易結(jié)團(tuán)，氧氣、營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)不足，導(dǎo)致產(chǎn)阿魏酸酯酶的活性仍不高。
為此，探索合適的工藝對(duì)發(fā)酵方法進(jìn)行改進(jìn)，不僅能改善阿魏酸酯酶的發(fā)酵生產(chǎn)，而且對(duì)其它霉菌的液體發(fā)酵也有一定的參考價(jià)值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種黑曲霉發(fā)酵生產(chǎn)阿魏酸酯酶的方法，解決現(xiàn)有工藝培養(yǎng)基粘度高、菌絲易結(jié)團(tuán)、氧氣和營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)不足、產(chǎn)酶水平低的問(wèn)題。
一種黑曲霉發(fā)酵 生產(chǎn)阿魏酸酯酶的方法,包括:將黑曲霉(Aspergillus niger)ZJUQH2012147孢子懸浮液接入發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)；[0009]其中，所述的黑曲霉ZJUQH2012147的保藏號(hào)為CGMCC N0.6152 ；
所述的發(fā)酵培養(yǎng)基中添加有微顆粒；微顆粒為滑石粉、高嶺土、礬土、鈦酸鹽、石英砂、碳粉和碳化硅中的至少一種。
微顆粒(Microparticles)是指粒徑大小在10000到100目左右的顆粒。在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加適量的微顆粒，能改善霉菌菌絲結(jié)團(tuán)現(xiàn)象，從而為霉菌提供充足的氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，提高產(chǎn)酶效率。
所述的黑曲霉ZJUQH2012147已于2012年05月23日保藏在位于北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)的中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱為CGMCC)，保藏編號(hào)為CGMCC N0.6152。該菌株屬半知菌亞門(mén)，絲孢綱，絲孢目，曲霉屬，在麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基(MEA)上生長(zhǎng)較快，25°C黑暗條件下培養(yǎng)7天，菌落直徑58-61mm，質(zhì)地絨狀；分生孢子頭黑褐色，初期球形，后期開(kāi)裂，菌落背面無(wú)任何色素；菌株具有足細(xì)胞，分生孢子梗高大，寬7.5-12.8 μ m，壁光滑，頂囊球形，大部分表面可育，產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)雙層，分生孢子近球形，淺到褐色，具小刺，3.0-5.5μπι;未見(jiàn)有性孢子。公·號(hào)CN 102796670Α的發(fā)明專利申請(qǐng)中公開(kāi)了該菌株，并詳細(xì)公開(kāi)了其篩選、培養(yǎng)方法、形態(tài)及生物學(xué)特征等，該菌株能發(fā)酵產(chǎn)阿魏酸酯酶。
所述的黑曲霉ZJUQH2012147孢子懸浮液可以通過(guò)如下方法制備:將黑曲霉ZJUQH2012147接種到PDA斜面培養(yǎng)基上，于25_30°C恒溫培養(yǎng)6_8天進(jìn)行活化；將活化的菌株刮入無(wú)菌水中制成濃度為IO6-1O7個(gè)/mL的孢子懸浮液。
所述的黑曲霉ZJUQH2012147孢子懸浮液的接種量為1_10 %，利于孢子的生長(zhǎng)繁殖。
以體積IL計(jì)，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基包括:豆柏、麥麩、玉米棒或玉米桿的浸提液200-300mL,氮源5_20g,無(wú)機(jī)鹽5_15g。豆柏、麥麩、玉米棒或玉米桿等原料來(lái)源廣泛、成本低廉，其浸提液不僅能為菌株生長(zhǎng)提供碳源，而且含有大量酯化阿魏酸，能誘導(dǎo)黑曲霉表達(dá)和分泌阿魏酸酯酶。
所述的氮源可以是有機(jī)氮源、無(wú)機(jī)氮源或它們的混合物，有機(jī)氮源可以選擇蛋白胨、酵母粉或它們的混合物，無(wú)機(jī)氮源可以選用銨鹽，如硫酸銨、氯化銨、硝酸鈉等。
所述的無(wú)機(jī)鹽主要包括細(xì)菌細(xì)胞生長(zhǎng)所需的各種元素，如P、Na、K、Mg、Ca等，其用量可參考常規(guī)霉菌培養(yǎng)基的配方。
優(yōu)選地，以體積IL計(jì)，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基包括:豆柏、麥麩、玉米棒或玉米桿的浸提液 200-300mL,蛋白胨 8_12g、KH2PO4 l_4g、Na2HPO4.12H20 5_10g、NaCl 0-0.4g、MgSO4.7H20 0-0.4g、CaCl2 0-0.2g。
更優(yōu)選地，以體積IL計(jì)，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基包括:豆柏的浸提液226mL、蛋白胨
10.35g、KH2PO4 3g、Na2HPO4.12H20 8g、NaCl 0.lg、MgSO4.7H20 0.2g、CaCl2 0.05g。
所述的浸提液可以通過(guò)如下方法制備:將豆柏、麥麩、玉米棒或玉米桿粉碎，然后加水煮沸0.5小時(shí)，過(guò)濾取濾液，得到浸提液。
所述的滑石粉、高嶺土、礬土、鈦酸鹽、石英砂、碳粉和碳化硅這些微顆粒粒徑小，能使菌絲形成微球團(tuán)，與外界接觸面積較大，便于氧氣供應(yīng)及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)傳遞；且這些微顆粒惰性較好，不會(huì)影響發(fā)酵反應(yīng)的進(jìn)行。優(yōu)選地，所述的微顆粒為滑石粉、高嶺土和礬土中的至少一種，這三種微顆粒用于產(chǎn)阿魏酸酯酶效果較好，且便于工業(yè)應(yīng)用。[0022]所述的微顆粒的粒徑可以為100-10000目；優(yōu)選為100-1000目；更優(yōu)選為200-800目。粒徑過(guò)小，對(duì)發(fā)酵改善作用不明顯；粒徑過(guò)大，菌絲不易形成微球團(tuán)。
所述的微顆粒在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度可以為0.l-100g/L ;優(yōu)選為0.l_20g/L ;更優(yōu)選為0.1-1.0g/L ;最優(yōu)選為0.5-1.0g/L。微顆粒添加量太小，作用效果不明顯；添加過(guò)多，則抑制菌體的生長(zhǎng)。
所述的微顆?？梢栽诎l(fā)酵培養(yǎng)前添加到發(fā)酵培養(yǎng)基中。將發(fā)酵培養(yǎng)基和微顆粒分開(kāi)滅菌，待接種孢子懸浮液時(shí)將微顆粒加入發(fā)酵培養(yǎng)基中，操作較方便，便于工業(yè)化生產(chǎn)。
所述的微顆粒也可以在發(fā)酵培養(yǎng)第1-2天添加到發(fā)酵培養(yǎng)基中。將孢子懸浮液接入發(fā)酵培養(yǎng)基中先培養(yǎng)1-2天，便于孢子快速繁殖達(dá)到一定的菌體濃度，此時(shí)孢子處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期加入微顆粒，不會(huì)影響孢子前期的繁殖，且加入的微顆粒能使孢子較好地形成微球團(tuán)，便于后續(xù)代謝生成阿魏酸酯酶。
發(fā)酵培養(yǎng)條件影響菌株的繁殖能力以及產(chǎn)酶能力。所述的發(fā)酵培養(yǎng)的培養(yǎng)溫度可以為25-30°C，培養(yǎng)時(shí)間為3-7天；優(yōu)選地，培養(yǎng)溫度為28°C，培養(yǎng)時(shí)間為5天。
所述的發(fā)酵培養(yǎng)可以采用搖床 振蕩培養(yǎng)，也可以利用發(fā)酵罐工業(yè)化大規(guī)模培養(yǎng)。當(dāng)采用搖床振蕩培養(yǎng)時(shí)，搖床轉(zhuǎn)速優(yōu)選為100-200r/min，利于菌體分散。
發(fā)酵培養(yǎng)完成后，阿魏酸酯酶存在于發(fā)酵液中，通過(guò)常規(guī)酶分離方法即可實(shí)現(xiàn)分離純化。
本發(fā)明以添加有適量濃度、適量大小微顆粒的液體作為發(fā)酵培養(yǎng)基，采用黑曲霉ZJUQH2012147在適宜的培養(yǎng)條件下通過(guò)液體發(fā)酵方式生產(chǎn)阿魏酸酯酶。
采用本發(fā)明方法，菌絲團(tuán)較小，氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)順暢，菌株生長(zhǎng)、代謝旺盛，有效改善了發(fā)酵產(chǎn)酶效果，菌株產(chǎn)阿魏酸酯酶的水平約為原有條件下的兩倍，可實(shí)現(xiàn)阿魏酸酯酶的工業(yè)化生產(chǎn)，也為其它曲霉的發(fā)酵生產(chǎn)提供參考。
具體實(shí)施方式
以下實(shí)施例中，所用的黑曲霉ZJUQH2012147已于2012年05月23日保藏在位于北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)的中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱為CGMCC)，保藏編號(hào)為CGMCCN0.6152。
該菌株的篩選、培養(yǎng)方法、形態(tài)及生物學(xué)特征等已在公開(kāi)號(hào)CN102796670A的發(fā)明專利申請(qǐng)中公開(kāi)。具體地，該菌株的形態(tài)及生物學(xué)特征為:屬半知菌亞門(mén)，絲孢綱，絲孢目，曲霉屬，在麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基(MEA)上生長(zhǎng)較快，25°C黑暗條件下培養(yǎng)7天，菌落直徑58-61mm，質(zhì)地絨狀；分生孢子頭黑褐色，初期球形，后期開(kāi)裂，菌落背面無(wú)任何色素；菌株具有足細(xì)胞，分生孢子梗高大，寬7.5-12.8 μ m，壁光滑，頂囊球形，大部分表面可育，產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)雙層，分生孢子近球形，淺到褐色，具小刺，3.0-5.5μπι ;未見(jiàn)有性孢子。
實(shí)施例1
本實(shí)施例中，微顆粒選擇800目的滑石粉。
(I)孢子懸浮液的制備:將黑曲霉ZJUQH2012147接種到PDA斜面培養(yǎng)基上，于28°C恒溫培養(yǎng)7天進(jìn)行活化；將活化的菌株刮入無(wú)菌水中制成濃度為IO6個(gè)/mL的孢子懸浮液。
(2)浸提液的制備:將豆柏粉碎，然后加水，于電爐中煮沸0.5小時(shí)，用八層紗布過(guò)濾，取濾液，即為豆柏的浸提液。
(3)發(fā)酵培養(yǎng)基的制備:以體積IL計(jì)，發(fā)酵培養(yǎng)基包括:豆柏的浸提液226mL、蛋白胨 10.35g、KH2PO4 3g、Na2HPO4.12H20 8g、NaC10.lg、MgSO4.7H20 0.2g、CaCl2 0.05g, pH自然。
(4)滅菌:將發(fā)酵培養(yǎng)基與滑石粉分開(kāi)滅菌(12rC、20min)。
(5)將滑石粉加入發(fā)酵培養(yǎng)基中，使滑石粉的濃度分別達(dá)到0.1g/L、0.5g/L、lg/L、5g/L、10g/L、20g/L。
(6)按照10%的接種量將上述孢子懸浮液接入冷卻后的發(fā)酵培養(yǎng)基中，于28°C，180rpm發(fā)酵培養(yǎng)7天。
依次在發(fā)酵培養(yǎng)的第3、5、7天取樣，測(cè)定阿魏酸酯酶酶活，結(jié)果見(jiàn)表I。
由結(jié)果可知，添加800目滑石粉使阿魏酸酯酶的酶活和比酶活都有一定的提高，尤其是在第七天，0.5g/L的滑石粉濃度下，阿魏酸酯酶酶活達(dá)到最高，與對(duì)照相比提高了46% ;在第五天，0.5g/L濃度下，比酶活達(dá)到最高，與對(duì)照相比提高了 52%。
表I
權(quán)利要求
1.一種黑曲霉發(fā)酵生產(chǎn)阿魏酸酯酶的方法，包括:將黑曲霉(Aspergillus niger)ZJUQH2012147孢子懸浮液接入發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)；其中，所述的黑曲霉ZJUQH2012147的保藏號(hào)為CGMCC N0.6152 ；所述的發(fā)酵培養(yǎng)基中添加有微顆粒；微顆粒為滑石粉、高嶺土、礬土、鈦酸鹽、石英砂、碳粉和碳化硅中的至少一種。
2.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的方法，其特征在于，所述的黑曲霉ZJUQH2012147孢子懸浮液的接種量為1_10%。
3.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的方法，其特征在于，以體積IL計(jì)，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基包括:豆柏、麥麩、玉米棒或玉米桿的浸提液200-300mL,氮源5_20g,無(wú)機(jī)鹽5_15g。
4.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的方法，其特征在于，所述的微顆粒為滑石粉、高嶺土和礬土中的至少一種。
5.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的方法，其特征在于，所述的微顆粒的粒徑為100-10000目。
6.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的方法，其特征在于，所述的微顆粒在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為 ·0.l-100g/L。
7.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的方法，其特征在于，所述的微顆粒在發(fā)酵培養(yǎng)前添加到發(fā)酵培養(yǎng)基中。
8.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的方法，其特征在于，所述的微顆粒在發(fā)酵培養(yǎng)第1-2天添加到發(fā)酵培養(yǎng)基中。
9.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的方法，其特征在于，所述的發(fā)酵培養(yǎng)的培養(yǎng)溫度為25-30°C，培養(yǎng)時(shí)間為3-7天。
10.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的方法，其特征在于，所述的發(fā)酵培養(yǎng)為搖床振蕩培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速為 100-200r/min。
專利摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種黑曲霉發(fā)酵生產(chǎn)阿魏酸酯酶的方法，包括將黑曲霉(Aspergillus niger)ZJUQH2012147孢子懸浮液接入發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)；其中，所述的黑曲霉ZJUQH2012147的保藏號(hào)為CGMCC No.6152；所述的發(fā)酵培養(yǎng)基中添加有微顆粒；微顆粒為滑石粉、高嶺土、礬土、鈦酸鹽、石英砂、碳粉和碳化硅中的至少一種。本發(fā)明以添加有微顆粒的液體作為黑曲霉發(fā)酵生產(chǎn)阿魏酸酯酶的發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵過(guò)程中菌絲團(tuán)較小，氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)順暢，菌株生長(zhǎng)、代謝旺盛，有效改善了發(fā)酵產(chǎn)酶效果，菌株產(chǎn)阿魏酸酯酶的水平約為原有條件下的兩倍，可實(shí)現(xiàn)阿魏酸酯酶的工業(yè)化生產(chǎn)，也為其它曲霉的發(fā)酵生產(chǎn)提供參考。
文檔編號(hào)C12R1/685GKCN103074314SQ201210594685
公開(kāi)日2013年5月1日 申請(qǐng)日期2012年12月31日
發(fā)明者陳啟和, 徐騰洋, 董亞晨, 方若思, 范琳琳 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan