專利名稱:一種藤倉赤霉的電穿孔遺傳轉(zhuǎn)化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及赤霉菌Gibberella fujikuroi的電穿孔遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)，適用于赤霉菌的遺傳工程以及赤霉菌分子生物學(xué)研究等領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
藤倉赤霉(Gibberella fujikuroi)是赤霉素的產(chǎn)生菌，在水稻上因過度產(chǎn)生赤霉素而引起惡苗病，該病在我國各水稻產(chǎn)區(qū)都有發(fā)生，給水稻生產(chǎn)造成嚴(yán)重威脅。赤霉素是一種植物生長調(diào)節(jié)劑，在植物生長發(fā)育中有非常重要的作用，在水果、蔬菜、水稻等作物上有非常廣泛的應(yīng)用。赤霉素還可以用于啤酒生產(chǎn)工業(yè)、臨床醫(yī)學(xué)等方面。
赤霉菌已成為具有良好開發(fā)前景的絲狀真菌之一，目前很多研究正在試圖通過基因工程的辦法改良菌種。同時(shí)，赤霉菌對水稻的致病分子生物學(xué)以及發(fā)育的研究也引起高度重視。但是，遺傳轉(zhuǎn)化方法的研究開發(fā)是對赤霉菌實(shí)施基因工程和分子生物學(xué)研究的前提。
絲狀真菌的遺傳轉(zhuǎn)化目前主要有醋酸鋰介導(dǎo)的孢子轉(zhuǎn)化法、PEG介導(dǎo)原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法、農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化法和電穿孔轉(zhuǎn)化法。在赤霉菌(G.fujikuroi)中，目前只有前2種轉(zhuǎn)化方法有應(yīng)用--孢子轉(zhuǎn)化法、PEG介導(dǎo)原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法，尚未有利用電穿孔轉(zhuǎn)化的報(bào)道。孢子轉(zhuǎn)化法僅限于能夠產(chǎn)生孢子的赤霉菌菌株，PEG介導(dǎo)原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法應(yīng)用較多，但是轉(zhuǎn)化步驟多，效率不高。電穿孔轉(zhuǎn)化技術(shù)在微生物等的遺傳轉(zhuǎn)化中具有很高的效率，而且簡單易行，已廣泛應(yīng)用于基因工程和分子生物學(xué)等研究。Bio-rad、Phamacia等世界著名公司已開發(fā)了電穿孔儀。
本發(fā)明首次利用了電穿孔技術(shù)對藤倉赤霉(G.fujikuroi)實(shí)施了外源基因轉(zhuǎn)化，找到了合適的轉(zhuǎn)化參數(shù)并優(yōu)化了參數(shù)的組合，轉(zhuǎn)化程序較現(xiàn)有的其它方法更簡單，提高了轉(zhuǎn)化效率，此法可用于赤霉菌的遺傳工程以及分子生物學(xué)研究和應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明目的是提供一種利用電穿孔(electroporation)技術(shù)對藤倉赤霉(G.fujikuroi)進(jìn)行外源基因的遺傳轉(zhuǎn)化方法，并找到轉(zhuǎn)化效率較高的轉(zhuǎn)化參數(shù)組合，可用于赤霉菌遺傳工程以及分子生物學(xué)研究等領(lǐng)域，以解決其它的遺傳轉(zhuǎn)化方法的不足之處。
本發(fā)明達(dá)到發(fā)明目的所采用的技術(shù)方案是利用真菌細(xì)胞壁降解酶對赤霉菌的細(xì)胞壁進(jìn)行處理，得到原生質(zhì)體并進(jìn)行純化，純化的原生質(zhì)體和適量外源基因/脫氧核糖核酸(DNA)水溶液進(jìn)行混合，然后利用電穿孔儀對混合液進(jìn)行電擊處理，電擊處理的原生質(zhì)體可以吸納外源DNA，從而實(shí)現(xiàn)了外源DNA對赤霉菌的遺傳轉(zhuǎn)化。
所述的藤倉赤霉Gibberella fujikuroi的電穿孔遺傳轉(zhuǎn)化方法按如下步驟進(jìn)行1)將藤倉赤霉原生質(zhì)體用1M山梨醇溶液A懸浮，以顯微鏡檢查計(jì)數(shù)，調(diào)整原生質(zhì)體液的原生質(zhì)體濃度為107-108/mL；2)用于轉(zhuǎn)化的外源DNA溶于無菌去離子水至濃度為5～10μg/ul，每100ul原生質(zhì)體液中加入10～15μgDNA，混勻，冰浴30～40min成混合液；
3)在預(yù)冷的電擊杯中加入步驟2)所得混合液，冰浴5～10min后，用電穿孔儀進(jìn)行電擊；4)電擊后電擊杯中加入濃度為1M的山梨醇溶液B，冰浴30min～1h，懸浮后涂布于MYG固體再生培養(yǎng)基平板，28℃培養(yǎng)12h后，于再生平板上覆蓋含與所述外源DNA相應(yīng)的抗生素終濃度50μg/mL的軟瓊脂MYG再生培養(yǎng)基，在28℃培養(yǎng)至轉(zhuǎn)化子出現(xiàn)；所述的山梨醇溶液B溶液中含有10mM Tris-Cl，50mM CaCl2，且pH7.5；所述的MYG固體再生培養(yǎng)基終濃度為麥芽糖5g/L；酵母膏5g/L；葡萄糖10g/L；瓊脂粉15g/L；蔗糖0.5mol/L；pH6.5；所述軟瓊脂MYG再生培養(yǎng)基終濃度為麥芽糖5g/L；酵母膏5g/L；葡萄糖10g/L；瓊脂粉8g/L；pH6.5。
6)化子在含與所述外源DNA相應(yīng)的抗生素終濃度100μg/ml的軟瓊脂MYG再生培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)，穩(wěn)定生長后保存，所述軟瓊脂MYG再生培養(yǎng)基終濃度為麥芽糖5g/L；酵母膏5；葡萄糖10g/L；瓊脂粉8g/L；pH6.5。
所述的藤倉赤霉菌的原生質(zhì)體的制備方法如下(1)Dryslase和Lying enzyme(Sigma)質(zhì)量比為3∶7的混合酶溶解于1M MgSO4溶液中，制成終濃度為15mg/ml的細(xì)胞壁降解酶液，所述的酶液經(jīng)過濾滅菌后每10mL酶液加入約0.9～1.1g濕菌體，置30℃的搖床，轉(zhuǎn)速為50～60rpm，酶解游離原生質(zhì)體3～4h得原生質(zhì)體酶解液；(2)將原生質(zhì)體酶解液離心，傾出上層原生質(zhì)體液，過濾除去菌絲殘片，在含原生質(zhì)體的濾液中滴入無菌去離子水使MgSO4的濃度為0.5M，離心得原生質(zhì)體沉淀。
所述的藤倉赤霉菌的濕菌體的制備方法如下a.在PDA培養(yǎng)基平板上進(jìn)行藤倉赤霉菌種活化，培養(yǎng)溫度26-28℃，所述的PDA培養(yǎng)基終濃度為馬鈴薯200g/L，蔗糖20g/L，瓊脂粉15g/L；pH自然，在121℃下滅菌18分鐘；b.取經(jīng)活化的藤倉赤霉菌種接種至含玻璃珠的MYG液體培養(yǎng)基，置于溫度為26～28℃、轉(zhuǎn)速為200rpm的搖床培養(yǎng)20h，所述的MYG液體培養(yǎng)基終濃度為麥芽糖5g/L；酵母膏5g/L；葡萄糖10g/L；pH6.5；c.將步驟b所得培養(yǎng)液按10％的接種量在MYG液體培養(yǎng)基進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)20h；d.將步驟c所得培養(yǎng)液用滅菌的單層濾布miracloth(Calbiochem)進(jìn)行過濾，用無菌去離子水沖洗濾布上的菌絲體，重復(fù)2～4次，去除殘余培養(yǎng)液，再用1M MgSO4沖洗2～4次，收集濕菌體。
由于目前真菌絕大多數(shù)用潮霉素篩選，故本發(fā)明中所述的外源DNA優(yōu)選帶有潮霉素抗性基因的質(zhì)粒pAN7-1，與其相應(yīng)的抗生素為潮霉素。其它帶有潮霉素抗性基因的質(zhì)粒，如質(zhì)粒pCB1003，pCB1004(Anne M.Carroll，et al，F(xiàn)ungal Genetics Newsletter 1994，4122)等，同樣適用于本發(fā)明。其它任何可以轉(zhuǎn)化真菌的DNA或質(zhì)粒，也可采用本發(fā)明所述的方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化。
具體的，所述的方法按如下步驟進(jìn)行1)將藤倉赤霉原生質(zhì)體用1M山梨醇溶液A懸浮，以顯微鏡檢查計(jì)數(shù)，調(diào)整原生質(zhì)體液的原生質(zhì)體濃度為107/mL；2)用于轉(zhuǎn)化的外源質(zhì)粒pAN7-1(Punt et al.1987 Gene 56117-124)經(jīng)限制酶切成線狀，純化后溶于無菌去離子水5～10μg/uL，每100uL原生質(zhì)體液中加入10μg DNA，混勻，冰浴30min成混合液；3)預(yù)冷的2cm電擊杯，中加入步驟2)所得混合液40uL冰浴5min后，準(zhǔn)備電穿孔儀，設(shè)定電擊參數(shù)電壓為850V，電容25μF，電阻為250Ω，進(jìn)行電擊；4)電擊后電擊杯中加入1mL濃度為1M山梨醇溶液B，冰浴30min～1h，懸浮后涂布于MYG固體再生平板，200uL/皿，28℃培養(yǎng)12h后，于再生平板上覆蓋含潮霉素終濃度50μg/mL的軟瓊脂MYG再生培養(yǎng)基，10mL/平板，在28℃培養(yǎng)至轉(zhuǎn)化子出現(xiàn)；所述的山梨醇溶液B溶液中含有10mMTris-Cl，50mM CaCl2，且pH7.5；5)轉(zhuǎn)化子在含潮霉素終濃度為100μg/mL的軟瓊脂MYG再生培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)，穩(wěn)定生長后保存。
本發(fā)明的有益效果體現(xiàn)在可以用于藤倉赤霉的分子生物學(xué)研究，如研究該菌對水稻的致病分子機(jī)制以及該菌的生長發(fā)育機(jī)制等?？梢杂脕韺Τ嗝咕鷮?shí)施基因工程從而進(jìn)行遺傳改良育種，提高赤霉素的合成能力。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此實(shí)施例1利用電穿孔法對藤倉赤霉(Gibberella fujikuroi)進(jìn)行外源抗潮霉素基因的遺傳轉(zhuǎn)化利用
發(fā)明內(nèi)容
中所述的方法，將含潮霉素抗性基因的外源質(zhì)粒pAN7-1導(dǎo)入了赤霉菌，通過潮霉素篩選獲得了穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的工程菌，轉(zhuǎn)化效率高于醋酸鋰介導(dǎo)的孢子轉(zhuǎn)化法，比聚乙二醇PEG介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化法步驟簡單。具體方法如下1.赤霉菌原生質(zhì)體的制備1)在PDA培養(yǎng)基平板上進(jìn)行藤倉赤霉菌種活化，培養(yǎng)溫度26～28℃。
PDA培養(yǎng)基終濃度為馬鈴薯，200g/L；蔗糖，20g/L；瓊脂粉，15g/L；pH自然。在121℃下滅菌18分鐘。
2)取1小塊接種至MYG液體培養(yǎng)基(含約40粒玻璃珠)，置于溫度為26～28℃、轉(zhuǎn)速為200rpm的搖床培養(yǎng)20h。所述的MYG液體培養(yǎng)基終濃度麥芽糖5g/L；酵母膏5g/L；葡萄糖10g/L；pH6.5；3)將步驟2)培養(yǎng)液按10％的接種量在MYG液體培養(yǎng)基進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)20h。MYG液體培養(yǎng)基終濃度麥芽糖5g/L；酵母膏5g/L；葡萄糖10g/L；pH6.5；4)將步驟3)培養(yǎng)液用滅菌的單層濾布miracloth(Calbiochem)進(jìn)行過濾，用無菌去離子水沖洗濾布上的菌絲體多次，盡量去除殘余培養(yǎng)液，然后用1M MgSO4沖洗3次，收集濕菌體。
5)配制細(xì)胞壁降解酶液，用質(zhì)量配比為Dryslase∶Lying enzyme＝3∶7的混合酶溶解于1M MgSO4，終濃度約為15mg/ml，酶液經(jīng)過濾除菌后加入赤霉菌濕菌體，每10ml酶液中加入1克濕菌體。置30℃的搖床，轉(zhuǎn)速為60rpm下酶解游離原生質(zhì)體4h。
6)原生質(zhì)體酶解液以500rpm離心10min，上層原生質(zhì)體液經(jīng)滅菌的雙層濾布miracloth過濾除去菌絲殘片，在含原生質(zhì)體的濾液中緩緩滴入無菌去離子水調(diào)節(jié)MgSO4的濃度至0.5M，3500rpm離心10min，沉淀原生質(zhì)體。
7)原生質(zhì)體沉淀用1M山梨醇溶液懸浮，3500rpm離心10min，重復(fù)1次。
8)原生質(zhì)體沉淀懸浮于適量1M山梨醇溶液100μL，顯微鏡檢檢查和計(jì)數(shù)，調(diào)整原生質(zhì)體的濃度為107/ml左右，用于以下轉(zhuǎn)化。
2.電穿孔法對原生質(zhì)體進(jìn)行外源DNA轉(zhuǎn)化1)DNA制備。用于轉(zhuǎn)化的外源質(zhì)粒pAN7-1(Punt et al.1987 Gene56117-124)經(jīng)限制酶切成線狀，純化后溶于無菌去離子水，濃度10ug/ul，用于轉(zhuǎn)化。
2)100ul原生質(zhì)體液中加入10ug DNA，混勻，冰浴30min后，取40ul混合液加入至預(yù)冷的電擊杯(2cm)，冰浴5min后，準(zhǔn)備電穿孔儀，設(shè)定電擊參數(shù)進(jìn)行電擊。電壓，850V；電容25μF；電阻，250Ω。
3)電擊后加入1ml濃度為1M的山梨醇溶液(含10mM Tris-Cl，pH7.5，50mMCaCl2)，冰浴1h，懸浮后涂布于MYG固體再生平板，200ul/皿。28℃培養(yǎng)12h后，于再生平板上覆蓋含潮霉素(50ug/ml)的軟瓊脂MYG再生培養(yǎng)基，10ml/平板。繼續(xù)在28℃培養(yǎng)觀察轉(zhuǎn)化子的出現(xiàn)。所述的MYG固體再生培養(yǎng)基終濃度為麥芽糖5g/L；酵母膏5g/L；葡萄糖10g/L；瓊脂粉15g/L；蔗糖0.5mol/L；pH6.5；所述軟瓊脂MYG再生培養(yǎng)基麥芽糖5g/L；酵母膏5g/L；葡萄糖10g/L；瓊脂粉8g/L；pH6.5。
4)轉(zhuǎn)化子在提高潮霉素濃度(100ug/ml)的上述MYG固體再生培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)，穩(wěn)定生長后保存。
結(jié)果轉(zhuǎn)化率在大于8個(gè)轉(zhuǎn)化子/ug DNA以上，相對于LESLIE and DICKMAN(APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY，May 1991，p.1423-1429)的醋酸鋰介導(dǎo)的孢子轉(zhuǎn)化法(1-2個(gè)轉(zhuǎn)化子/ug DNA)，有較大提高。
權(quán)利要求
1.一種藤倉赤霉的電穿孔遺傳轉(zhuǎn)化方法，其特征在于所述的方法按如下步驟進(jìn)行1)將藤倉赤霉原生質(zhì)體用1M山梨醇溶液A懸浮，以顯微鏡檢查計(jì)數(shù)，調(diào)整原生質(zhì)體液的原生質(zhì)體濃度為107-108/mL；2)用于轉(zhuǎn)化的外源DNA溶于無菌去離子水至濃度為5～10μg/ul，每100ul原生質(zhì)體液中加入10～15μgDNA，混勻，冰浴30～40min成混合液；3)在預(yù)冷的電擊杯中加入步驟2)所得混合液，冰浴5～10min后，用電穿孔儀進(jìn)行電擊；4)電擊后電擊杯中加入濃度為1M的山梨醇溶液B，冰浴30min～1h，懸浮后涂布于MYG固體再生培養(yǎng)基平板，28℃培養(yǎng)12h后，于再生平板上覆蓋含與所述外源DNA相應(yīng)的抗生素終濃度50μg/mL的軟瓊脂MYG再生培養(yǎng)基，在28℃培養(yǎng)至轉(zhuǎn)化子出現(xiàn)；所述的山梨醇溶液B溶液中含有10mM Tris-Cl，50mM CaCl2，且pH7.5；所述的MYG固體再生培養(yǎng)基終濃度為麥芽糖5g/L；酵母膏5g/L；葡萄糖10g/L；瓊脂粉15g/L；蔗糖0.5mol/L；pH6.5；所述軟瓊脂MYG再生培養(yǎng)基終濃度為麥芽糖5g/L；酵母膏5g/L；葡萄糖10g/L；瓊脂粉8g/L；pH6.5。6)轉(zhuǎn)化子在含與所述外源DNA相應(yīng)的抗生素終濃度100μg/mL的軟瓊脂MYG再生培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)，穩(wěn)定生長后保存，所述軟瓊脂MYG再生培養(yǎng)基終濃度為麥芽糖5g/L；酵母膏5；葡萄糖10g/L；瓊脂粉8g/L；pH6.5。
2.如權(quán)利要求
1所述的藤倉赤霉的電穿孔遺傳轉(zhuǎn)化方法，其特征在于所述的藤倉赤霉菌的原生質(zhì)體的制備方法如下(1)Dryslase和Lying enzyme質(zhì)量比為3∶7的混合酶溶解于1MMgSO4溶液中，制成終濃度為15mg/ml的細(xì)胞壁降解酶液，所述的酶液經(jīng)過濾滅菌后每10mL酶液加入約0.9～1.1g濕菌體，置30℃的搖床，轉(zhuǎn)速為50～60rpm，酶解游離原生質(zhì)體3～4h得原生質(zhì)體酶解液；(2)將原生質(zhì)體酶解液離心，傾出上層原生質(zhì)體液，過濾除去菌絲殘片，在含原生質(zhì)體的濾液中滴入無菌去離子水使MgSO4的濃度為0.5M，離心得原生質(zhì)體沉淀。
3.如權(quán)利要求
2所述的藤倉赤霉的電穿孔遺傳轉(zhuǎn)化方法，其特征在于所述的藤倉赤霉菌的濕菌體的制備方法如下a.在PDA培養(yǎng)基平板上進(jìn)行藤倉赤霉菌種活化，培養(yǎng)溫度26～28℃，所述的PDA培養(yǎng)基終濃度為馬鈴薯200g/L，蔗糖20g/L，瓊脂粉15g/L；pH自然，在121℃下滅菌18分鐘；b.取經(jīng)活化的藤倉赤霉菌種接種至含玻璃珠的MYG液體培養(yǎng)基，置于溫度為26～28℃、轉(zhuǎn)速為200rpm的搖床培養(yǎng)20h，所述的MYG液體培養(yǎng)基終濃度為麥芽糖5g/L；酵母膏5g/L；葡萄糖10g/L；pH6.5；c.將步驟b所得培養(yǎng)液按10％的接種量在MYG液體培養(yǎng)基進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)20h；d.將步驟c所得培養(yǎng)液用滅菌的單層濾布miracloth進(jìn)行過濾，用無菌去離子水沖洗濾布上的菌絲體，重復(fù)2～4次，去除殘余培養(yǎng)液，再用1M MgSO4沖洗2～4次，收集濕菌體。
4.如權(quán)利要求
1所述的藤倉赤霉的電穿孔遺傳轉(zhuǎn)化方法，其特征在于所述的外源DNA為帶有潮霉素抗性基因的質(zhì)粒pAN7-1，所述的抗生素為潮霉素。
5.如權(quán)利要求
1所述的藤倉赤霉的電穿孔遺傳轉(zhuǎn)化方法，其特征在于所述的方法按如下步驟進(jìn)行1)將藤倉赤霉原生質(zhì)體用1M山梨醇溶液A懸浮，以顯微鏡檢查計(jì)數(shù)，調(diào)整原生質(zhì)體液的原生質(zhì)體濃度為107/mL；2)用于轉(zhuǎn)化的外源質(zhì)粒pAN7-1經(jīng)限制酶切成線狀，純化后溶于無菌去離子水5～10μg/uL，每100uL原生質(zhì)體液中加入10μg DNA，混勻，冰浴30min成混合液；3)冰上預(yù)冷的2cm電擊杯，中加入步驟2)所得混合液40uL冰浴5min后，準(zhǔn)備電穿孔儀，設(shè)定電擊參數(shù)電壓為850V，電容25μF，電阻為250Ω，進(jìn)行電擊；4)電擊后電擊杯中加入1mL濃度為1M山梨醇溶液B，冰浴30min～1h，懸浮后涂布于MYG固體再生平板，200uL/皿，28℃培養(yǎng)12h后，于再生平板上覆蓋含潮霉素終濃度50μg/mL的軟瓊脂MYG再生培養(yǎng)基，10mL/平板，在28℃培養(yǎng)至轉(zhuǎn)化子出現(xiàn)；所述的山梨醇溶液B溶液中含有10mM Tris-Cl，50mM CaCl2，且pH7.5；5)轉(zhuǎn)化子在含潮霉素終濃度為100μg/mL的軟瓊脂MYG再生培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)，穩(wěn)定生長后保存。
專利摘要
本發(fā)明提供了一種利用電穿孔(electroporation)技術(shù)對藤倉赤霉(Gibberalla fujikuroi)進(jìn)行外源基因的遺傳轉(zhuǎn)化方法利用真菌細(xì)胞壁降解酶對赤霉菌的細(xì)胞壁進(jìn)行處理，得到原生質(zhì)體并進(jìn)行純化，純化的原生質(zhì)體和適量外源基因/脫氧核糖核酸(DNA)水溶液進(jìn)行混合，然后利用電穿孔儀對混合液進(jìn)行電擊處理，電擊處理的原生質(zhì)體可以吸納外源DNA，從而實(shí)現(xiàn)了外源DNA對赤霉菌的遺傳轉(zhuǎn)化。本發(fā)明的有益效果體現(xiàn)在可以用于藤倉赤霉的分子生物學(xué)研究，如研究該菌對水稻的致病分子機(jī)制以及該菌的生長發(fā)育機(jī)制等；可以用來對赤霉菌實(shí)施基因工程從而進(jìn)行遺傳改良育種，提高赤霉素的合成能力。
文檔編號C12N1/15GK1995362SQ200610155561
公開日2007年7月11日 申請日期2006年12月28日
發(fā)明者朱廷恒, 王渭霞, 汪琨, 崔志峰, 裘娟萍 申請人:浙江工業(yè)大學(xué)導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan