或恒定區(qū)加框架區(qū)。還可以對表達抗體的細胞進行遺傳突變或其它改變，這可以改變或者不改變所產生抗體的結合特異性。
[0034]—旦制得本發(fā)明的抗體分子，就可以通過本領域已知的純化免疫球蛋白分子的任何方法對其進行純化，例如，通過色譜法(例如，離子交換色譜，親和色譜，特別是通過蛋白A對特異性抗原的親和色譜和其他柱色譜)、離心、利用溶解度差異，或通過任何其它純化蛋白質的標準技術。在許多實施方案中，抗體從細胞分泌到培養(yǎng)基中，通過收集培養(yǎng)基并進行純化得到抗體。
[0035]除另有說明外，本申請中的所有科技術語的都具有與本發(fā)明所屬領域普通技術人員通常理解相同的含義。盡管與本申請中描述類似或等同的方法及材料都可用于實施或檢驗本發(fā)明，但是下文仍還是對合適的方法和材料進行了描述。本申請中引用的全部出版物、專利申請、專利及其他參考文獻其全部內容在此引入作為參考。如有抵觸，包括定義，以本申請為準。
[0036]下列實施例旨在進一步舉例說明實現本發(fā)明的具體方式，而決不構成對本發(fā)明的限制。本領域技術人員應該理解的是，在不違背本發(fā)明的精神和原則的前提下，對本發(fā)明進行改動得到的技術方案都將落入本發(fā)明的待批權利要求范圍內。
實施例
[0037]在本申請中，如無特別說明，本發(fā)明的實施都使用分子生物學、微生物學、重組DNA和免疫學的常規(guī)技術，這些技術都是本領域技術人員所掌握的。這些技術在本領域技術人員常用文獻中有詳細地描述，例如Sambrook等人編著的Molecular Cloning:A LaboratoryManual，第三版等。
[0038]實施例1:抗人BLyS ScFv抗體的篩選
[0039]1.1抗原制備。首先通過基因重組技術制備BLyS蛋白。將編碼BLyS蛋白的DNA序列(GenBank:AF132600.1)克隆入的載體p3457_his中，瞬時轉染入293E細胞株，經過三天培養(yǎng)，收集上清液，以Ni親和柱(GE)純化并收集BLyS蛋白。將純化的BLyS蛋白進行FITC熒光蛋白標記(武漢優(yōu)爾生)
[0040]1.2篩選。用1.1制備的FITC熒光標記的BLyS蛋白對293T細胞人源抗體庫進行篩選。每輪篩選均于轉染前24h對293T細胞進行傳代并計數，確保其細胞存活率多95%。其中每10mm培養(yǎng)皿接入細胞數為2-4 X 16個細胞，加入培養(yǎng)基8ml后培養(yǎng)24h。每皿加入的質粒為12 μ g，與12 μ I的PEI (濃度為3mg/ml)以及900 μ I的DMEM混合振蕩并靜置15min后加入培養(yǎng)皿中。培養(yǎng)60-72h后以無酶細胞分離液消化細胞并收集，以IXPBS緩沖液輕輕吹洗細胞，重懸后計數。將細胞與FITC標記的BlyS抗原于37°C共孵育lh，并以I XPBS輕輕洗滌2-3次。將與抗原孵育后的細胞重懸于Iml的IXPBS緩沖液中，以流式細胞術分選出熒光(FITC)強度最強、占細胞總數為0.1 %的細胞。分選獲得的細胞收集于約400 μ I的IXPBS緩沖液中，并于850rpm離心5min。用移液器小心吸去上清，按照試劑盒說明書提取細胞中的質粒。所提質粒轉化DH5a，一部分鋪板并進行PCR鑒定；另一部分則培養(yǎng)后保存作為下一輪篩選的抗體庫。第一輪以哺乳動物細胞展示型人源ScFv抗體庫為起始文庫，三輪篩選的抗原濃度依次為I μ g/106cells、0.1 μ g/106cells及0.01 μ g/106cells。第三輪篩選結束后所獲得的質粒轉化DH5 α后全部涂板，挑選全部單菌落做菌液PCR，選取陽性結果送測序。測得的全長scFv核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，其編碼的氨基酸序列如SEQID NO:2所示。其中重鏈可變區(qū)的核苷酸序列如SEQ ID NO:3，編碼的氨基酸序列如SEQ IDNO:4 ;輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列如SEQ ID NO:5，編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO:6。經與IgBlast數據庫比對，分析獲得氨基酸序列，進一步比對⑶R區(qū)推斷出重鏈⑶Rl氨基酸序列為 GFTFSRYff (SEQ ID NO:7)，重鏈 CDR2 氨基酸序列為 INTDGSST (SEQ ID NO:8)，重鏈 CDR3氨基酸序列為ARDQDGVGATHDY(SEQ ID NO:9);輕鏈CDRl氨基酸序列為HSVGSN(SEQ ID NO:10)，輕鏈CDR2氨基酸序列為GAS (SEQ ID NO:11)，輕鏈CDR3氨基酸序列為QQYGSSP (SEQID NO:12)ο
[0041]實施例2:分泌型真核表達載體的構建與鑒定
[0042]2.1目的基因的擴增。設計引物對獲得候選的11號ScFv序列進行PCR擴增。其中上游引物為 B-1lF:5’ -GTACGCTCTTCATGTCAGGTCCAGCTGGTGAAAC-3’ ;下游引物為 B-11R:5’-GATCGCTCTTCTAGCTCCTTGGCCGAACGTCCACG-3’。其中在引物中引入了酶切位點 BspQI (序列中劃線部分)O PCR 流程為:95°C 1min ；95°C 30s ；56°C Imin ；72°C Imin ;共 35 個循環(huán)；72°C延伸1min。PCR產物以瓊脂糖凝膠電泳鑒定回收。
[0043]2.2重組質粒的構建與鑒定。擴增的BIIScFv與載體p3457his進行普通的酶切酶連構建成重組質粒p3457B-llScFv。重組質粒轉化至DH5a中，涂布含有100 μ g/ml的氨芐青霉素的LB平板。37°C過夜培養(yǎng)后隨機挑選其中的陽性菌落，37°C搖菌5h后，以ScFv基因的上下游特異性引物對菌液進行PCR鑒定。菌液PCR結果在750處有一單一條帶，與ScFv大小相符。在B-llScFv插入載體的上下游找到兩個不同的單一酶切位點，其中上游為Sal I，下游為Not I，以相應的內切酶進行酶切鑒定。
[0044]實施例3:抗BLyS單鏈抗體B_1 IScFv的表達、純化與鑒定
[0045]穩(wěn)定傳代的293E懸浮細胞于轉染前24h進行傳代并計數，其中細胞密度為0.7-0.9 X 106/ml，培養(yǎng)體積為30ml。培養(yǎng)24h后進行瞬時轉染。每毫升培養(yǎng)體積加入I μ g質粒，轉染采用PEI介導，質粒與PEI的質量比為1:3。其中。取培養(yǎng)體積10%的培養(yǎng)基，依次加入質粒與PEI后迅速振蕩混勻，室溫靜置15min后轉染293E細胞中。37°C CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h后收取細胞上清。以鎳親和柱純化抗體蛋白并以SDS-PAGE凝膠電泳鑒定。電泳結果顯示在約30kDa處有條帶，與預期相符。在Western-blotting中，將凝膠結果轉移到膜上并以5%的脫脂牛奶封閉lh。將膜與HRP標價的山羊抗His標簽的抗體共孵育Ih并以TBST緩沖液清洗，最后以顯色液顯色后檢測。結果顯示，在約30kDa處有目的條帶，表明該抗體能與抗His的抗體特異性結合。
[0046]實施例4:FortieB1測定B-1lscFv抗體親和力常數
[0047]以pH為7.4的PBS緩沖液稀釋生物素化的抗原BLyS至20 μ g/ml，并加入到第2列中，每孔200 μ I ;以PBS緩沖液2倍梯度稀釋B-1IScFv抗體蛋白并加入到第4列的A-F 孔中，其濃度分別為 25 μ g/ml, 12.5 μ g/ml, 6.25 μ g/ml, 3.125 μ g/ml, 1.5625 μ g/ml,
0.78125 μ g/ml,以PBS稀釋貝利木單抗至50 μ g/ml作為陽性對照，加入至第4列的G孔中，每孔均加入200 μ I ;第I列、第3列所有的孔以及第4列的H孔均加入PBS緩沖液，每孔200 μ 1將加好樣的96孔板放入FortieB1儀器中檢測。測定結果為B-1lscFv抗體的親和力常數為:3.08ηΜ，表明本發(fā)明制備的scFv與BLyS具有較高的親和力，與文獻報導的完整抗體相當。
【主權項】
1.一種抗人B淋巴細胞刺激因子單鏈抗體，其具有選自下列可變區(qū): (a)重鏈可變區(qū)包括SEQID N0:4所示氨基酸序列； (b)輕鏈可變區(qū)包括SEQID N0:6所示氨基酸序列； (c)重鏈可變區(qū)包括SEQID N0:4所示氨基酸序列，且輕鏈可變區(qū)包括SEQ ID N0:6所示氨基酸序列； (d)重鏈可變區(qū)與SEQID N0:4所示氨基酸序列具有至少90%同一性；或 (e)輕鏈可變區(qū)與SEQID NO:6所示氨基酸序列具有至少90%同一性。
2.權利要求1所述的單鏈抗體，其中所述的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列為SEQID N0:4,且其中所述的輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列為SEQ ID NO:6。
3.權利要求2所述的單鏈抗體，其中所述重鏈可變區(qū)的氨基酸序列的編碼核苷酸序列為SEQ ID NO:3，所述輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列的編碼核苷酸序列為SEQ ID NO:5。
4.權利要求2所述的單鏈抗體，其氨基酸序列如SEQID NO:2所示。
5.權利要求4所述的單鏈抗體，其氨基酸序列的編碼核苷酸序列為SEQID NO:1。
6.一種用于治療自身免疫疾病的藥物組合物，其中包括作為活性成分的權利要求1至5中任一項所述的單鏈抗體和藥用載體。
7.權利要求1至5中任一項所述的單鏈抗體在制備用于治療自身免疫疾病的藥物中的用途，其中所述的自身免疫疾病包括但不限于，系統(tǒng)性紅斑狼瘡、肖格倫綜合征、類風濕關節(jié)炎或重癥肌無力等。
8.一種用于診斷自身免疫疾病的試劑，其中包括權利要求1至5中任一項所述的單鏈抗體、能夠產生可檢測信號的標記物以及使用說明書。
9.權利要求1至5中任一項所述的單鏈抗體在制備自身免疫疾病診斷試劑中的用途。
10.一種抗人B淋巴細胞刺激因子單克隆抗體，其重鏈可變區(qū)中CDR1XDR2、⑶R3的氨基酸序列為SEQ ID NO:7,SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:9 ;和/或其輕鏈可變區(qū)中CDR1、CDR2、CDR3 的氨基酸序列為 SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12。
【專利摘要】本申請屬于基因工程抗體領域。本發(fā)明提供了一種抗人B淋巴細胞刺激因子單鏈抗體、含有所述抗體的藥物組合物和診斷試劑及其用途。所述單鏈抗體與人B淋巴細胞刺激因子具有高親和力，可用于自身免疫病的治療和診斷。
【IPC分類】A61K39-395, C07K16-24, A61P37-00, G01N33-533
【公開號】CN104628856
【申請?zhí)枴緾N201510035661
【發(fā)明人】宋海峰, 高新, 錢尼良, 張晶, 付潔, 董立厚, 高柳村
【申請人】中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院放射與輻射醫(yī)學研究所, 北京正旦國際科技有限責任公司
【公開日】2015年5月20日
【申請日】2015年1月23日