專(zhuān)利名稱(chēng)：草地早熟禾脂肪酸含量測(cè)定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及脂肪酸的含量測(cè)定方法，具體地，涉及草地早熟禾脂肪酸含量測(cè)定方法。
背景技術(shù)：
目前測(cè)定植物脂肪酸含量的方法技術(shù)多集中在油料作物，以及植物組織中的種子部分。關(guān)于植物葉片組織的脂肪酸含量的測(cè)定方法國(guó)外有擬南芥、菠菜等葉片組織脂肪酸含量的測(cè)定方法比較成熟。這些方法概況起來(lái)分為油脂提取、皂化和甲酯化三個(gè)主要步驟，所需試劑種類(lèi)多，步驟繁復(fù)，花費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)。草地早熟禾(Poa Pretensis)屬于多年生草本植物，須根系，具有根狀莖，葉色青緑，觀(guān)賞效果好，根莖繁殖，再生力強(qiáng)，耐修剪，抗寒能力強(qiáng)，耐旱性稍差，耐踐踏，是非常重要的草坪草和牧草草種。在北方及中部地區(qū)，南方部分冷涼地區(qū)廣泛用于公園、機(jī)關(guān)、學(xué)校、居住區(qū)、運(yùn)動(dòng)場(chǎng)等地緑化。其特性是喜冷涼濕潤(rùn)的氣候，在我國(guó)北方部分地區(qū)，可保持較長(zhǎng)的綠期，可在一定程度上滿(mǎn)足園林四季常青的要求。但草地早熟禾對(duì)高溫和干旱條件不適應(yīng)，在北方夏季高溫條件下，易感病，故該草種對(duì)種植管理要求較高，需要較高的水分、養(yǎng)分等投入。草地早熟禾的耐旱性和其不飽和脂肪酸含量相關(guān)，科研工作者可通過(guò)不飽和脂肪酸含量的比較結(jié)果，不飽和脂肪酸含量較高的品種耐旱性也較好?？梢酝ㄟ^(guò)選育、培育耐旱品種，以滿(mǎn)足高溫、干燥地區(qū)園林綠化的需要。因此，能夠簡(jiǎn)易快速準(zhǔn)確地測(cè)定草地早熟禾各脂肪酸的含量成為ー個(gè)亟待解決的問(wèn)題。關(guān)于草地早熟禾葉片組織脂肪酸含量的測(cè)定方法，在現(xiàn)有技術(shù)中是ー個(gè)空白。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供ー種草地早熟禾脂肪酸含量測(cè)定方法。本發(fā)明提供的草地早熟禾脂肪酸含量測(cè)定方法，包括以下步驟(I)取草地早熟禾新鮮葉片組織于玻璃瓶中；(2)加入含十七烷酸的硫酸；(3)排空玻璃瓶?jī)?nèi)空氣、密封，水浴或金屬浴；(4)冷卻，加入氯化鈉溶液和正己烷，充分搖勻，離心；(5)取離心后的上層油相，入GC-MS儀器分析，根據(jù)樣品峰圖計(jì)算脂肪酸的含量。其中，步驟I)所述的葉片組織為O. 2±0. 02g全部展開(kāi)的葉片組織，將其處理為小于Icm的葉段置于玻璃瓶中。其中，步驟2)所述的硫酸濃度為1N(0. 5mol/L)，硫酸與十七烷酸的體積質(zhì)量比為ImL:O. Img ;加入硫酸與葉片組織的體積質(zhì)量比為ImL:O. 2g。本發(fā)明的O. 5mol/L硫酸是用甲醇稀釋濃硫酸獲得的。其中，步驟3)所述水浴或金屬浴的溫度為6(T80°C，時(shí)間為9(Tl20min。
優(yōu)選地，步驟3)所述水浴或金屬浴的溫度為80°C，時(shí)間為90min。其中，步驟4)所述的冷卻溫度為-20 -10°C，冷卻5 15min。優(yōu)選地，冷卻溫度為-20°C，冷卻時(shí)間lOmin。其中，步驟4)所述氯化鈉溶液濃度為O. 9%，其加入量與葉片組織的體積質(zhì)量比為
I.5mL: O. 2g0 其中，步驟4)所述正己烷加入量與加入硫酸體積比例為ImL :0. 2mL。其中，步驟4)所述離心為1500 3000rpm, 2_5min。其中，步驟5)取f 3 μ L上層油相，入GC-MS儀器分析。優(yōu)選地，步驟5)取I μ L上層油相，入GC-MS儀器分析。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，使用氣相色譜-質(zhì)譜儀HP GG-MS(HP 6890GC和HP5973MS)，采用60-mHP-5MS毛細(xì)管柱子，內(nèi)直徑O. 25mm，氣相色譜儀的程序參數(shù)設(shè)置如下1700C lOmin，上升到220°C lOmin，氣相流速I(mǎi)mL min — 1。用注射器注入I μ L上層油相之后，啟動(dòng)程序。I個(gè)樣品的脂類(lèi)分析持續(xù)時(shí)間大約為40min。通過(guò)氣相質(zhì)譜聯(lián)儀分析，與標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)比分析確定甲酯化脂肪酸的名稱(chēng)，并得到每個(gè)樣品的峰圖。采用內(nèi)參法，即十七烷酸17:0的重量和質(zhì)譜分析圖上的峰面積計(jì)算其他脂肪酸的含量百分比。草地早熟禾主要脂肪酸種類(lèi)如下16:0棕櫚酸，飽和脂肪酸；16:1棕櫚油酸，不飽和脂肪酸；18:0硬脂酸，飽和脂肪酸；18:2亞油酸，不飽和脂肪酸；18:3亞麻酸，不飽和脂肪酸。(注分號(hào)前邊數(shù)字代表脂肪酸碳鏈的長(zhǎng)度，即碳原子的個(gè)數(shù)，分號(hào)后邊代表碳鏈雙鍵的個(gè)數(shù))假設(shè)某特定脂肪酸的重量含量為X μ g，則其計(jì)算公式為X/Ax=100/A17:0, X=IOOXAx/A17:0公式中的A指代峰面積，Ax為某含量為X的脂肪酸的峰面積，A17:0為內(nèi)參的峰面積。所有脂肪酸重量含量之和Wt (單位 μ g) =W16:0+W16:1+W18:0+W18:2+W18:3則某特定脂肪酸含量的百分比Px為Px=X/fftX100%本發(fā)明通過(guò)將草地早熟禾脂肪酸甲酷化，用GG-MS分析，通過(guò)上述公式計(jì)算得到
各脂肪酸含量。本發(fā)明還提供了上述測(cè)定方法在選育耐旱性草地早熟禾品種中的應(yīng)用。本發(fā)明提供的方法克服了樣品間脂類(lèi)提取效率不一致的問(wèn)題，優(yōu)化所需檢測(cè)樣品的植物組織樣品量，節(jié)省甲酯化過(guò)程中的一系列試劑用量；簡(jiǎn)化了甲酯化的操作步驟，節(jié)約了上樣之后GC-MS的檢測(cè)分析時(shí)間；克服草地早熟禾甲酯化過(guò)程中碳化嚴(yán)重的問(wèn)題，是ー種低成本，快速，簡(jiǎn)單，高效的草地早熟禾脂肪酸分析方法。本發(fā)明通過(guò)摸索甲酯化過(guò)程每個(gè)步驟方法，克服了樣品間脂類(lèi)提取效率不一致以及碳化現(xiàn)象嚴(yán)重的問(wèn)題，水浴或金屬浴的條件控制為80°C，時(shí)間為90min，這個(gè)條件能夠降低草地早熟禾葉片組織的碳化率，有利于后續(xù)實(shí)施步驟中的油相分離，減少干擾。本發(fā)明簡(jiǎn)化了草地早熟禾脂肪酸分析步驟，把脂類(lèi)提取和皂化過(guò)程簡(jiǎn)為ー個(gè)步驟完成，節(jié)約了所需試劑的使用量，是ー種快速、高效的草地早熟禾脂肪酸含量分析方法。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例進(jìn)ー步說(shuō)明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。在不背離本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的情況下，對(duì)本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段，實(shí)施例中所用的試劑，均為市售。實(shí)施例I草地早熟禾脂肪酸甲酷化處理
I、脂類(lèi)甲酯化前期準(zhǔn)備溶液試劑的準(zhǔn)備用甲醇稀釋硫酸到lN(lmol/L H+)H2SO40配制O. 9%的NaCl溶液。準(zhǔn)備好色譜純級(jí)正己烷，十七烷酸(17:0)待用。2、脂類(lèi)甲酯化過(guò)程取草地早熟禾O(píng). 2g新鮮葉片組織，迅速用剪刀把葉片剪短到Icm的長(zhǎng)段，放入帶蓋子的測(cè)試玻璃瓶中。加入ImL IN H2SO4，含有100 μ g的十七烷酸(17:0)作為內(nèi)參，用氮吹儀隊(duì)輕吹，趕走空氣，迅速擰緊瓶蓋。80°C水浴，加熱90min，完成脂肪酸甲酯化過(guò)程。3、脂類(lèi)甲酯化后期處理放入-20°C冰箱冷卻10分鐘。加入I. 5mL O. 9%NaCl和200 μ L正己烷(Hexane,Sigma 34859)，充分搖勻，離心5min，轉(zhuǎn)速1500rpm。用10 μ L量程的玻璃注射器，小心吸取上層油相，推進(jìn)I μ L入GC-MS進(jìn)樣器，用于GC-MS分析。實(shí)施例2草地早熟禾脂肪酸甲酷化處理I、脂類(lèi)甲酯化前期準(zhǔn)備溶液試劑的準(zhǔn)備用甲醇稀釋硫酸到lN(lmol/L H+)H2SO40配制O. 9%的NaCl溶液。準(zhǔn)備好色譜純級(jí)正己烷，十七烷酸(17:0)待用。2、脂類(lèi)甲酯化過(guò)程取草地早熟禾O(píng). 2g新鮮葉片組織，迅速用剪刀把葉片剪短到O. 8cm的長(zhǎng)段，放入帶蓋子的測(cè)試玻璃瓶中。加入ImL IN H2SO4，含有100 μ g的十七烷酸(17:0)作為內(nèi)參，用氮吹儀N2輕吹，趕走空氣，迅速擰緊瓶蓋。60°C金屬浴，加熱120min。完成脂肪酸甲酯化過(guò)程。3、脂類(lèi)甲酯化后期處理放入-20°C冰箱冷卻15分鐘。加入I. 5mL O. 9%NaCl和200 μ L正己烷(Hexane,Sigma 34859),潤(rùn)旋20sec,離心2min,轉(zhuǎn)速3000rpm。用10 μ L量程的玻璃注射器,小心吸取上層油相，推進(jìn)3 μ L入GC-MS進(jìn)樣器，用于GC-MS分析。實(shí)施例3GC-MS分析草地早熟禾脂肪酸I、脂類(lèi)含量分析將實(shí)施例I處理過(guò)的樣品使用氣相色譜-質(zhì)譜儀HP GG-MS (HP6890GC and HP5973MS)，采用60-mHP-5MS毛細(xì)管柱子，內(nèi)直徑O. 25mm，氣相色譜儀的程序參數(shù)設(shè)置如下170。。lOmin，上升到220°C lOmin，氣相流速I(mǎi)mL min — 1。注射器注入樣品之后，啟動(dòng)程序。I個(gè)樣品的脂類(lèi)分析持續(xù)時(shí)間約為40分鐘。2、通過(guò)氣相質(zhì)譜分析，得到每個(gè)樣品的峰圖。采用內(nèi)參法，即十七烷酸17:0的重量和質(zhì)譜分析圖上的峰面積計(jì)算其他脂肪酸的含量百分比。草地早熟禾脂主要肪酸種類(lèi)如下16:0棕櫚酸，飽和脂肪酸；16:1棕櫚油酸，不飽和脂肪酸；18:0硬脂酸，飽和脂肪酸；
18: 2亞油酸，不飽和脂肪酸；18:3亞麻酸，不飽和脂肪酸。(注分號(hào)前邊數(shù)字代表脂肪酸碳鏈的長(zhǎng)度，即碳原子的個(gè)數(shù)，分號(hào)后邊代表碳鏈雙鍵的個(gè)數(shù))假設(shè)某特定脂肪酸的重量含量為X μ g，則其計(jì)算公式為X/Ax=100/A17:0, X=IOOXAx/A17:0公式中的A指代峰面積，Ax為某含量為X的脂肪酸的峰面積，A17:0為內(nèi)參的峰面積。所有脂肪酸重量含量之和Wt (單位 μ g) =W16:0+W16:1+W18:0+W18:2+W18:3則某特定脂肪酸含量的百分比Px為Px=X/fftX100%實(shí)施例4本發(fā)明方法與常規(guī)方法的對(duì)比試驗(yàn)—、本發(fā)明方法I、用甲醇稀釋硫酸到lN(lmol/L H+)H2SO40配制O. 9%的NaCl溶液。準(zhǔn)備好色譜純級(jí)正己烷，十七烷酸(17:0)待用。植物材料的準(zhǔn)備剪取3份草地早熟禾品種‘Midnight’ (來(lái)源于美國(guó)新澤西州立羅格斯大學(xué) II 農(nóng)場(chǎng)，郵編 08901,地址59Dudley RD,New Brunswick,New Jersey,USA。)3份新鮮葉片樣品，命名Ml,M2,M3,3份品種‘Brilliant’(來(lái)源同品種‘Midnight’ )新鮮葉片組織，命名為BI，B2，B3。Ml，M2，M3，BI，B2，，B3分別放入6個(gè)玻璃測(cè)試瓶中。樣品重量見(jiàn)表I。表I樣品重量
品名 MI M2 M3 BIB2 B3
_i t§21254 02292E _0,22922 _0.22055 _0JI895 _0.201!8 _2、每個(gè)玻璃測(cè)試瓶中，都加入ImL IN H2SO4，含有100 μ g的十七烷酸(17:0)作為內(nèi)參，用氮吹儀N2輕吹，趕走空氣，迅速擰緊瓶蓋。80°C水浴，90分鐘。3、放入-20 V冰箱冷卻10分鐘。4、從冰箱中取出，加入 I. 5mL O. 9%NaCl 和 200 μ L正己烷(Hexane，Sigma 34859)，潤(rùn)旋 20sec,離心 2min,轉(zhuǎn)速 2000rpm。
5、用IOyL量程的玻璃注射器，小心吸取上層油相，推進(jìn)I μ L入GC-MS進(jìn)樣器，用于GC-MS分析。6、通過(guò)氣相質(zhì)譜分析，得到每個(gè)樣品的質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)后結(jié)果。采用內(nèi)參法，利用17:0的重量計(jì)算其他脂肪酸的含量百分比。6個(gè)樣品經(jīng)過(guò)GC-MS分離和質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)的比對(duì)，確定脂肪酸類(lèi)別名稱(chēng)和峰面積，結(jié)果如下表2 :表2各樣品中脂肪酸的峰面積
權(quán)利要求
1.一種草地早熟禾脂肪酸含量測(cè)定方法，包括以下步驟 1)取草地早熟禾新鮮葉片組織于玻璃瓶中； 2)加入含十七烷酸的硫酸； 3)排空玻璃瓶?jī)?nèi)空氣、密封，水浴或金屬浴； 4)冷卻，加入氯化鈉溶液和正己烷，充分搖勻，離心； 5)取離心后的上層油相，入GC-MS儀器分析，根據(jù)樣品峰圖計(jì)算脂肪酸的含量。
2.如權(quán)利要求I所述的測(cè)定方法，其特征在于，步驟I)所述的葉片組織為0.2±0. 02g全部展開(kāi)的葉片組織，將其處理為小于Icm的葉段置于玻璃瓶中。
3.如權(quán)利要求I所述的測(cè)定方法，其特征在于，步驟2)所述的硫酸濃度為0.5mol/L，硫酸與十七烷酸的體積質(zhì)量比為ImL 0. Img ;加入硫酸與葉片組織的體積質(zhì)量比為ImL : 0. 2g0
4.如權(quán)利要求I所述的測(cè)定方法，其特征在于，步驟3)所述水浴或金屬浴的溫度為60 80°C，時(shí)間為 90 120min。
5.如權(quán)利要求I所述的測(cè)定方法，其特征在于，步驟4)所述的冷卻溫度為-20 -10°C，冷卻時(shí)間5 15min。
6.如權(quán)利要求I所述的測(cè)定方法，其特征在于，步驟4)所述氯化鈉溶液濃度為0.9%，其加入量與葉片組織的體積質(zhì)量比為I. 5mL 0. 2g。
7.如權(quán)利要求I所述的測(cè)定方法，其特征在于，步驟4)所述正己烷加入量，與加入硫酸體積比例為ImL 0. 2mL。
8.如權(quán)利要求I所述的測(cè)定方法，其特征在于，步驟4)所述離心為1500 3000rpm,2 5min。
9.如權(quán)利要求I所述的測(cè)定方法，其特征在于，步驟5)取I L上層油相，入GC-MS儀器分析。
10.如權(quán)利要求I 9任一所述的測(cè)定方法在選育耐旱性草地早熟禾中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種草地早熟禾脂肪酸含量測(cè)定方法，包括以下步驟(1)取草地早熟禾葉片組織于玻璃瓶中；(2)加入含十七烷酸的硫酸；(3)排空玻璃瓶?jī)?nèi)空氣、密封，水浴或金屬浴；(4)冷卻，加入氯化鈉溶液和正己烷，渦旋、離心；(5)取離心后的上層油相，入GC-MS分析，根據(jù)樣品峰圖計(jì)算脂肪酸的含量。本發(fā)明提供的方法克服了樣品間脂類(lèi)提取效率不一致的問(wèn)題，優(yōu)化所需檢測(cè)樣品的植物組織樣品量，節(jié)省甲酯化過(guò)程中的一系列試劑用量；簡(jiǎn)化了甲酯化的操作步驟，節(jié)約了上樣之后GC-MS的檢測(cè)分析時(shí)間；克服草地早熟禾甲酯化過(guò)程中碳化嚴(yán)重的問(wèn)題，是一種低成本，快速，簡(jiǎn)單，高效的草地早熟禾脂肪酸分析方法。
文檔編號(hào)G01N30/02GK102706974SQ20121014505
公開(kāi)日2012年10月3日 申請(qǐng)日期2012年5月10日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月10日
發(fā)明者許立新, 韓烈保, 黃炳茹 申請(qǐng)人:北京林業(yè)大學(xué)