磷酸?；D(zhuǎn)移酶基因萊茵衣藻。
[0014] 所述溶血磷脂酸?；D(zhuǎn)移酶基因為油菜溶血磷脂酸酰基轉(zhuǎn)移酶基因，其堿基序列 如 SEQ ID NO. 3 所示。
[0015] 所述甘油3-磷酸酰基轉(zhuǎn)移酶基因為酵母甘油3-磷酸?；D(zhuǎn)移酶基因，其堿基序 列如SEQ ID NO. 4所示。
[0016] 所述獲得溶血磷脂酸?；D(zhuǎn)移酶基因和甘油3-磷酸酰基轉(zhuǎn)移酶基因采用人工合 成。
[0017] 所述溶血磷脂酸?；D(zhuǎn)移酶基因重組表達載體和甘油3-磷酸?；D(zhuǎn)移酶基因重 組表達載體構(gòu)建為溶血磷脂酸酰基轉(zhuǎn)移酶基因和甘油3-磷酸?；D(zhuǎn)移酶基因分別連接至 中間載體PUC58,再經(jīng)Nhe I和Pmac I限制性內(nèi)切酶雙酶切后，與經(jīng)過相同酶切的pH124載 體連接，分別得到最終重組載體。
[0018] 所述轉(zhuǎn)化方法采用基因槍法、電轉(zhuǎn)法或者珠磨法。
[0019] 本發(fā)明還保護所述方法制備的轉(zhuǎn)基因衣藻。所述轉(zhuǎn)基因衣藻包含溶血磷脂酸?；?轉(zhuǎn)移酶基因，或甘油3-磷酸酰基轉(zhuǎn)移酶基因，或同時包含溶血磷脂酸?；D(zhuǎn)移酶基因和甘 油3-磷酸?；D(zhuǎn)移酶基因。
[0020] 本發(fā)明還保護所述轉(zhuǎn)基因衣藻在提高萊茵衣藻脂肪酸含量中的應(yīng)用。
[0021] 本發(fā)明克服基因沉默技術(shù)或者其它物理化學(xué)技術(shù)中的不穩(wěn)定因素，提供一種通過 基因優(yōu)化改造來大幅提高萊茵衣藻脂肪酸含量的方法。本方法將與脂肪酸代謝相關(guān)的兩 種外源基因根據(jù)萊茵衣藻密碼子偏愛性進行優(yōu)化改造，得到適用于萊茵衣藻表達的油菜溶 血磷脂酸?；D(zhuǎn)移酶基因，命名為C-Ipaat和酵母甘油3-磷酸?；D(zhuǎn)移酶基因，命名為 c-gpdl基因，轉(zhuǎn)化入萊茵衣藻基因組中，獲得產(chǎn)油量高、不飽和脂肪酸比例減少的藻株，而 且外源基因未影響萊茵衣藻的生長。
[0022] 本發(fā)明包括以下內(nèi)容：
[0023] 根據(jù)萊茵衣藻密碼子偏愛性將lpaat和gpdl基因進行密碼子改造，然后插入帶有 抗性基因和高效啟動子的表達載體，轉(zhuǎn)化入萊茵衣藻基因組中，通過批量篩選獲得產(chǎn)油量 高的轉(zhuǎn)基因衣藻，經(jīng)過傳代證明其遺傳穩(wěn)定性。將篩選出的轉(zhuǎn)基因衣藻進行培養(yǎng)，提取脂肪 酸后測其脂肪酸含量變化和甘油三酯的含量變化，并對藻細(xì)胞生長情況進行分析，最終篩 選出脂肪酸含量得到大幅提高的轉(zhuǎn)基因衣藻。
[0024] 本發(fā)明的技術(shù)方案如下：
[0025] (1)轉(zhuǎn)基因受體藻株的篩選和培養(yǎng)
[0026] 在22°C，光照為90 y E/m2. s的條件下，用TAP培養(yǎng)液培養(yǎng)萊茵衣藻，選擇細(xì)胞壁缺 陷型的萊茵衣藻CC-849作為外源基因的受體。
[0027] (2)目的基因的優(yōu)化改造與人工合成
[0028] Genbank登錄號為AY616009. 1的油菜（Brassica napus)溶血磷脂酸?；D(zhuǎn)移酶 基因（lpaat)和 Genbank 登陸號為 Z24454. 1 的酵母（Saccharomyces cerevisiae)甘油 3-磷酸?；D(zhuǎn)移酶基因（gpdl);
[0029] 從NCBI搜索目的基因，獲得油菜的lpaat基因（GenBank登陸號：AY616009. 1)和 釀酒酵母的gpdl基因（GenBank登陸號：Z24454. 1)。將目的基因根據(jù)萊茵衣藻的密碼子偏 愛性進行優(yōu)化，參見圖2,分別得到新的適合萊茵衣藻表達的基因c-lpaat和c-gpdl，兩端 設(shè)計不同酶切位點Nhe I和Pmac I，送去基因公司（上海生工生物工程有限公司）合成， 所合成的基因片段連接在PUC58載體（上海生工生物工程有限公司）上。合成的c-lpaat 基因序列見SEQ ID NO. 3,合成的c-gpdl基因序列見SEQ ID NO. 4。具體為：SEQ ID NO. 3: c-lpaat
[0030] gcgcaaaKctagcatggccatggccgccgccgccgtgatcgtgcccctgggcatcctgttcttcatctc gggcctggtggtgaacctgctgcaggccgtgtgctacgtgctgatccgccccctgtcgaagaacacctaccgcaaga tcaaccgcgtggtggccgagaccctgtggctggagctggtgtggatcgtggactggtgggccggcgtgaagatccag gtgttcgccgacgacgagaccttcaaccgcatgggcaaggagcacgccctggtggtgtgcaaccaccgctcggacat cgactggctggtgggctggatcctggcccagcgctcgggctgcctgggctcggccctggccgtgatgaagaagtcgt cgaagttcctgcccgtgatcggctggtcgatgtggttctcggagtacctgttcctggagcgcaactgggccaaggac gagtcgaccctgaagtcgggcctgcagcgcctgaacgacttcccccgccccttctggctggccctgttcgtggaggg cacccgcttcaccgaggccaagctgaaggccgcccaggagtacgccgccacctcgcagctgcccgtgccccgcaacg tgctgatcccccgcaccaagggcttcgtgtcggccgtgtcgaacatgcgctcgttcgtgcccgccatctacgacatg accgtggccatccccaagacctcgcccccccccaccatgctgcgcctgttcaagggccagccctcggtggtgcacgt ccacatcaagtgccactcgatgaaggacctgcccgagtcggaggacgagatcgcccagtggtgccgcgaccagttcg tggccaaggacgccctgctggacaagcacatcgccgccgacaccttccccggccagaaggagcagaacatcgaccgc cccatcaagtcgctggccgtggtggtgtcgtgggcctgcctgctgaccctgggcgccatgaagttcctgcactggtc gaacctgttctcgtcgctgaagggcatcgccctgtcggccctgggcctgggcatcatcaccctgtgcatgcagatcc tgatccgctcgtcgcagtcggagcgctcgacccccgccaaggtggcccccgccaagcccaaggacaagcaccagtcg ggctcgtcgtcgcagaccgaggtggaggagaagcagaagtaacacgtgaaacgcg
[0031] 其中下劃線為酶切位點Nhel和PmacI。
[0032] SEQ ID NO. 4 :c-gpdl
[0033] gcgcaaagctagcatgtcggccgccgccgaccgcctgaacctgacctcgggccacctgaacgccggccg caagcgctcgtcgtcgtcggtgtcgctgaaggccgccgagaagcccttcaaggtgaccgtgatcggctcgggcaact ggggcaccaccatcgccaaggtggtggccgagaactgcaagggctaccccgaggtgttcgcccccatcgtgcagatg tgggtgttcgaggaggagatcaacggcgagaagctgaccgagatcatcaacacccgccaccagaacgtgaagtacct gcccggcatcaccctgcccgacaacctggtggccaaccccgacctgatcgactcggtgaaggacgtggacatcatcg tgttcaacatcccccaccagttcctgccccgcatctgctcgcagctgaagggccacgtcgactcgcacgtccgcgcc atctcgtgcctgaagggcttcgaggtgggcgccaagggcgtgcagctgctgtcgtcgtacatcaccgaggagctggg catccagtgcggcgccctgtcgggcgccaacatcgccaccgaggtggcccaggagcactggtcggagaccaccgtgg cctaccacatccccaaggacttccgcggcgagggcaaggacgtggaccacaaggtgctgaaggccctgttccaccgc ccctacttccacgtctcggtgatcgaggacgtggccggcatctcgatctgcggcgccctgaagaacgtggtggccct gggctgcggcttcgtggagggcctgggctggggcaacaacgcctcggccgccatccagcgcgtgggcctgggcgaga tcatccgcttcggccagatgttcttccccgagtcgcgcgaggagacctactaccaggagtcggccggcgtggccgac ctgatcaccacctgcgccggcggccgcaacgtgaaggtggcccgcctgatggccacctcgggcaaggacgcctggga gtgcgagaaggagctgctgaacggccag