一株高效利用生物質(zhì)原料高產(chǎn)乳酸的新型植物乳桿菌的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
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[0001]本發(fā)明屬于微生物領(lǐng)域，涉及乳酸菌。
【背景技術(shù)】
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[0002]隨著化石能源的短缺和白色污染的日益嚴重，生物基高分子材料越來越引起重視。聚乳酸即為一種可以部分替代化石級塑料的重要可降解生物基高分子材料。它是以乳酸為單體合成的高分子聚合物，具有非常廣闊的應(yīng)用前景，目前國際國內(nèi)已經(jīng)有眾多科研機構(gòu)和公司利用聚乳酸開發(fā)出可降解塑料薄膜、餐盒、杯子、手術(shù)縫合線、光盤、計算機殼等多種產(chǎn)品。
[0003]但是由于乳酸的生產(chǎn)成本居高不下，聚乳酸的大量應(yīng)用受到嚴重限制。乳酸生產(chǎn)成本中一大部分在于其碳源成本，目前生產(chǎn)乳酸的碳源主要是采用玉米淀粉、木薯淀粉等糧食原料，即便是采用農(nóng)業(yè)廢棄物中的淀粉質(zhì)原料，其生產(chǎn)成本仍然不能與化石基塑料相匹敵。
[0004]而玉米秸桿、稻草和木屑等纖維素基廢棄物相比而言其價格則可大大降低。但目前的主要瓶頸在于絕大多數(shù)乳酸菌只能利用這些原料中的六碳糖，而五碳糖幾乎完全不能利用。發(fā)酵液中大量五碳糖的殘留既導(dǎo)致資源的浪費，也給發(fā)酵廢棄物的處理帶來一定壓力。因此，五碳糖代謝菌的發(fā)掘?qū)τ诰廴樗岬拇笠?guī)模應(yīng)用具有重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

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[0005]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一株能夠高效利用生物質(zhì)原料高產(chǎn)乳酸的新型植物乳桿菌菌株。
[0006]本發(fā)明所提供的乳桿菌為植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)L1-2013_01，該菌株保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCCN0.7928，保藏地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，郵編100101。保藏日期2013年7月15日。該菌株特點如下:在顯微鏡下觀察，該菌株為短桿狀，革蘭氏染色呈陽性，無鞭毛，不產(chǎn)芽孢；在固體培養(yǎng)基上，該菌菌落為白色，表面光滑，致密，形態(tài)為圓形，邊緣較整齊。理化特征為:過氧化氫酶(_)，明膠液化(_)，吲哚實驗( + )，運動性(_)，發(fā)酵產(chǎn)氣(-)，亞硝酸鹽還原(-)，發(fā)酵產(chǎn)氣(-)，產(chǎn)硫化氫氣體(-)，pH4.5MRS培養(yǎng)基中生長(+ )。
[0007]本發(fā)明植物乳桿菌采用下述流程進行選育:
[0008]原始出發(fā)菌種一試管活化一硫酸二乙酯(DES)誘變一平板初篩一亞硝基胍(NTG)誘變一平板初篩一搖瓶復(fù)篩一傳代穩(wěn)定性試驗。
[0009]原始出發(fā)菌種為CICC20242，購于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。
[0010]本發(fā)明所采用的原始菌株在木聚糖培養(yǎng)基中，乳酸的產(chǎn)量為12.5g/L。為了提高其乳酸產(chǎn)量，依次采用DES和NTG對該菌種進行誘變，誘變采用MRS碳酸鈣平板進行初篩，然后采用500mL搖瓶發(fā)酵，生物傳感器分析儀對高產(chǎn)菌進行復(fù)篩，選育優(yōu)良的植物乳桿菌菌株，然后做傳代實驗，評價其遺傳穩(wěn)定性。
[0011]菌株CGMCCN0.7928遺傳穩(wěn)定性結(jié)果表明:經(jīng)過連續(xù)傳代十次，各項性能指標都比較穩(wěn)定，遺傳性較好，性狀沒有回復(fù)，因此把菌株CGMCCN0.7928作為選育得到的目的菌株。
[0012]將目的菌株CGMCCN0.7928做1L發(fā)酵罐實驗，結(jié)果表明:發(fā)酵72h后，以木聚糖為碳源，植物乳桿菌CGMCCN0.7928的乳酸濃度可以達到57g/L，與出發(fā)菌株相比提高了 356%。
[0013]將目的菌株CGMCCN0.7928做1L發(fā)酵罐實驗，結(jié)果表明:發(fā)酵72h后，以葡萄糖為碳源，植物乳桿菌CGMCCN0.7928的乳酸濃度可以達到68g/L。
[0014]所述發(fā)酵罐培養(yǎng)基組成為:牛肉膏12g、蛋白胨60g、酵母膏30g、碳源120g、乙酸鈉30g、檸檬酸銨12g、磷酸氫二鉀12g、七水硫酸鎂1.2g、七水硫酸錳0.3g，逐一溶解后，自來水定容至6L，調(diào)節(jié)pH7.0-7.2。
[0015]具體過程如下:
[0016]培養(yǎng)基:
[0017]液體MRS木聚糖培養(yǎng)基(牛肉膏2g、蛋白胨10g、酵母膏5g、木聚糖20g、乙酸鈉5g、檸檬酸銨2g、磷酸氫二鉀2g、七水硫酸鎂0.2g、七水硫酸錳0.05g，逐一溶解后，自來水定容100mL,調(diào)節(jié)pH7.0-7.2) ；MRS木聚糖篩選固體培養(yǎng)基(牛肉膏2g、蛋白胨10g、酵母膏5g、木聚糖90g、乙酸鈉5g、檸檬酸銨2g、磷酸氫二鉀2g、七水硫酸鎂0.2g、七水硫酸錳0.05g,逐一溶解后，自來水定容100mL,調(diào)節(jié)pH7.0-7.2，加入20g瓊脂)；
[0018]1.硫酸二乙酯(DES)誘變選育
[0019]I)在超凈臺上取試管斜面上的植物乳桿菌一環(huán)，接入裝有50mL液體MRS木聚糖培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，200rpm，40°C培養(yǎng)12h左右，使菌體處于對數(shù)生長前期。
[0020]2)取5mL菌液，5000rpm離心1min收集菌體，用生理鹽水洗滌2次。
[0021]3)用pH7.0磷酸緩沖液稀釋成107個/mL菌懸液。
[0022]4)取32mLpH7.0的磷酸鉀緩沖液、8mL菌懸液、0.4mLDES在預(yù)先放入轉(zhuǎn)子的150mL三角瓶中充分混合，使DES最終濃度為1% (v/v)0
[0023]5)在 30°C搖床中 150rpm 反應(yīng) 30min，取 ImL 混合液，加入 0.5mL25%Na2S203 溶液中止反應(yīng)。
[0024]6)稀釋涂布于含90g/L木聚糖的MRS木聚糖篩選固體培養(yǎng)基平皿中。在40°C培養(yǎng)2?3天后挑取透明圈/菌落直徑最大的菌株，標號為DES菌。
[0025]2.亞硝基胍誘變
[0026]I)在超凈臺上取試管斜面上的植物乳桿菌DES—環(huán)，接入裝有50mL液體MRS木聚糖培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，200rpm，40°C培養(yǎng)12h左右，使菌體處于對數(shù)生長前期。
[0027]2)取5mL菌液5000rpm離心1min收集菌體，用生理鹽水洗滌2次。
[0028]3)用pH6.0磷酸緩沖液稀釋成107個/mL菌懸液。
[0029]4)取1mL菌懸液轉(zhuǎn)移至10mL三角瓶中，加入1mg的NTG，配制成終濃度為1mg/mL的NTG溶液，并加入4-5滴丙酮，以利于NTG溶解。
[0030]5)在30°C下200rpm振蕩反應(yīng)30min, 5000rpm離心1min收集菌體,用無菌生理鹽水洗滌數(shù)次，中止反應(yīng)。
[0031]6)適當稀釋，取最后稀釋度的菌液0.2mL，涂布于含90g/L木聚糖的MRS木聚糖篩選固體培養(yǎng)基平皿中。在40°C培養(yǎng)2?3天后挑取透明圈/菌落直徑較大的菌株150支。
[0032]3.搖瓶復(fù)篩
[0033]I)在超凈臺上分別取各試管斜面上的植物乳桿菌一環(huán)，接入裝有50mL液體MRS木聚糖培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，200rpm, 40°C培養(yǎng)3_4天，每天檢測木聚糖濃度和L-乳酸濃度變化。發(fā)酵結(jié)束后，比較150株菌種的木聚糖消耗速率和乳酸產(chǎn)生速率、乳酸的轉(zhuǎn)化率以及雜酸含量。
[0034]2)選擇木聚糖代謝速率快、乳酸濃度高、轉(zhuǎn)化率高以及雜酸含量少的菌種為最終菌種，命名為Li菌。
[0035]4.遺傳穩(wěn)定性試驗
[0036]將L1-2013-01菌株在斜面上連續(xù)十次傳代，并用搖瓶復(fù)篩的方法檢測每次傳代后的發(fā)酵情況。實驗發(fā)現(xiàn)，在斜面上連續(xù)十次傳代，該菌種性狀沒有明顯變化，各項性能指標都正常，說明該菌種的遺傳穩(wěn)定性較強。
[0037]有益效果:
[0038]該菌株可高效利用各種生物質(zhì)原料，不僅可利用常見的淀粉質(zhì)原料、單糖、雙糖、六碳糖等，且可利用五碳糖，代謝速率快，產(chǎn)乳酸濃度高，轉(zhuǎn)化率高，雜酸含量少。以木聚糖為碳源，發(fā)酵72h后，乳酸濃度可以達到57g/L，與出發(fā)菌株相比提高了 356%。菌株在斜面上連續(xù)十次傳代，并用搖瓶復(fù)篩的方法檢測每次傳代后的發(fā)酵情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在斜面上連續(xù)十次傳代，該菌種性狀沒有明顯變化，各項性能指標都正常，說明該菌種的遺傳穩(wěn)定性較強。
【具體實施方式】
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[0039]實施例1
[0040]將該菌株CGMCCN0.7928做1L發(fā)酵罐實驗，以蔗糖為碳源，結(jié)果表明:發(fā)酵72h后，乳酸濃度可以達到60g/L。
[0041]發(fā)酵罐培養(yǎng)基為:牛肉膏12g、蛋白胨60g、酵母膏30g、蔗糖120g、乙酸鈉30g、檸檬酸銨12g、磷酸氫二鉀12g、七水硫酸鎂1.2g、七水硫酸錳0.3g，逐一溶解后，自來水定容至 6L，調(diào)節(jié) ρΗ7.0-7.2。
[0042]實施例2
[0043]將該菌株CGMCCN0.7928做1L發(fā)酵罐實驗，以來蘇糖為碳源，結(jié)果表明:發(fā)酵72h后，乳酸濃度可以達到54g/L。
[0044]發(fā)酵罐培養(yǎng)基為:牛肉膏12g、蛋白胨60g、酵母膏30g、來蘇糖120g、乙酸鈉30g、檸檬酸銨12g、磷酸氫二鉀12g、七水硫酸鎂1.2g、七水硫酸錳0.3g，逐一溶解后，自來水定容至 6L，調(diào)節(jié) ρΗ7.0-7.2。
[0045]實施例3
[0046]將該菌株CGMCCN0.7928做1L發(fā)酵罐實驗，以阿拉伯糖為碳源，結(jié)果表明:發(fā)酵72h后，乳酸濃度可以達到52g/L。
[0047]發(fā)酵罐培養(yǎng)基為:牛肉膏12g、蛋白胨60g、酵母膏30g、阿拉伯糖120g、乙酸鈉30g、檸檬酸銨12g、磷酸氫二鉀12g、七水硫酸鎂1.2g、七水硫酸錳0.3g，逐一溶解后，自來水定容至6L，調(diào)節(jié)pH7.0-7.2。
【主權(quán)項】
1.一株高效利用生物質(zhì)原料高產(chǎn)乳酸的新型植物乳桿菌，所述植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum) L1-2013-01，保藏編號為 CGMCCN0.7928。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述高效利用生物質(zhì)原料高產(chǎn)乳酸的新型植物乳桿菌，其特征在于，所述植物乳桿菌可發(fā)酵利用五碳糖。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述高效利用生物質(zhì)原料高產(chǎn)乳酸的新型植物乳桿菌，其特征在于，以木聚糖為碳源，發(fā)酵72h后，乳酸濃度可以達到57g/L。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述高效利用生物質(zhì)原料高產(chǎn)乳酸的新型植物乳桿菌，其特征在于，以葡萄糖為碳源，發(fā)酵72h后，乳酸濃度可以達到68g/L。
5.根據(jù)權(quán)利要求2-4任一權(quán)利要求所述高效利用生物質(zhì)原料高產(chǎn)乳酸的新型植物乳桿菌，其特征在于，發(fā)酵罐培養(yǎng)基組成為:牛肉膏12g、蛋白胨60g、酵母膏30g、碳源120g、乙酸鈉30g、檸檬酸銨12g、磷酸氫二鉀12g、七水硫酸鎂1.2g、七水硫酸錳0.3g，逐一溶解后，自來水定容至6L，調(diào)節(jié)pH7.0-7.2。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述高效利用生物質(zhì)原料高產(chǎn)乳酸的新型植物乳桿菌在發(fā)酵生產(chǎn)乳酸中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一株高效利用生物質(zhì)原料高產(chǎn)乳酸的新型植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）Li-2013-01，保藏編號為CGMCC No.7928。其發(fā)酵罐培養(yǎng)基組成為：牛肉膏12g、蛋白胨60g、酵母膏30g、碳源120g、乙酸鈉30g、檸檬酸銨12g、磷酸氫二鉀12g、七水硫酸鎂1.2g、七水硫酸錳0.3g，逐一溶解后，自來水定容至6L，調(diào)節(jié)pH7.0-7.2。該菌株可高效利用各種生物質(zhì)原料，不僅可利用常見的淀粉質(zhì)原料、單糖、雙糖、六碳糖等，且可利用五碳糖，代謝速率快，產(chǎn)乳酸濃度高，轉(zhuǎn)化率高，雜酸含量少，遺傳穩(wěn)定性較強。CGMCC No792820130715
【IPC分類】C12R1-25, C12P7-56, C12N1-20
【公開號】CN104673691
【申請?zhí)枴緾N201310625005
【發(fā)明人】田崗, 李績, 李政, 蘇俊
【申請人】田崗
【公開日】2015年6月3日
【申請日】2013年11月29日