用于抑制基因表達(dá)的組合物及其用圖
【專利說明】用于抑制基因表達(dá)的組合物及其用途
[0001] 本申請是基于申請日為2010年8月26日，優(yōu)先權(quán)日為2009年8月27日，申請?zhí)?為201080048450. 8,發(fā)明名稱為："用于抑制基因表達(dá)的組合物及其用途"的專利申請的分 案申請。
[0002] 發(fā)明背景 發(fā)明領(lǐng)域
[0003] 本發(fā)明涉及：用于抑制基因表達(dá)和/或活性的化合物、組合物及使用方法；或者用 于診斷、治療和/或預(yù)防對所述基因表達(dá)和/或活性的抑制有響應(yīng)的疾病和/或病況的化 合物、組合物及方法。
[0004] 相關(guān)摶術(shù)的概沐
[0005] -種抑制基因表達(dá)的方法是反義技術(shù)或RNA抑制（RNAi)。這些方法利用基于DNA 和/或RNA的寡核昔酸（DNA and/or RNA-based oligonucleotides)對選自mRNA、微小RNA、 preRNA或線粒體RNA的靶標(biāo)的序列特異性結(jié)合，及其由此產(chǎn)生的翻譯抑制。這樣的基于寡 核苷酸的翻譯的抑制以及最終的基因表達(dá)的抑制是一個或多個細(xì)胞機(jī)制的結(jié)果，其中可以 包括但不限于（i)翻譯的直接（立體）阻斷，（ii)RNA酶H介導(dǎo)的抑制，以及（iii)RNAi介 導(dǎo)的抑制（例如短干擾-RNA(siRNA)、微小RNA(miRNA)、DNA指導(dǎo)的RNAi (ddRNAi)、以及單 鏈 RNAi(ssRNAi))〇
[0006] 反義技術(shù)的歷史解釋盡管與mRNA結(jié)合的反義寡核苷酸的確定是相對直接的，但 優(yōu)化具有實際的基因表達(dá)抑制能力并且由此作為良好的臨床候選藥物的過程并不是如此。 相應(yīng)地，如果一種基于寡核苷酸的基因表達(dá)下調(diào)方法要取得成功，需要最為有效地獲得該 結(jié)果的經(jīng)優(yōu)化的反義寡核苷酸。這樣經(jīng)優(yōu)化的反義寡核苷酸可以單獨使用或與其它預(yù)防性 和/或治療性組合物一起使用。
[0007]自從Zamecnik和Stephenson發(fā)表了使用反義寡核苷酸作為抑制病毒蛋白質(zhì)翻譯 的手段的第一個不例（Zemecnik 和 Stephenson (1978)Proc. Natl. Acad. Sci. 75 :285_288) 以來，就存在對于利用基于寡核苷酸的化合物抑制基因的表達(dá)的巨大關(guān)注。這些初步的努 力利用在體內(nèi)固有地不穩(wěn)定的單鏈、未修飾的寡脫氧核糖核苷酸或寡核糖核苷酸（Agrawal 等人（1992) Ann. NY Acad. Sci. 660:2-10)在體內(nèi)結(jié)合mRNA并產(chǎn)生雙鏈RNA模板，用于酶 或RNA酶降解。隨后進(jìn)行的努力確定引入了抗核酸酶的硫代磷酸酯和/或甲基膦酸酯聯(lián) 接的寡脫氧核糖核苷酸的用途（Agrawal 等人（1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85 :7079_7083; Metelev 和 Agrawal US 5, 652, 355 ;Metelev 和 Agrawal US 6, 143, 881 ;Matsukura 等人 (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. 84 :7706) 〇
[0008] 另一類抑制基因表達(dá)的基于RNA的分子被稱為核酶（ribozymes)。核酶形成莖 環(huán)結(jié)構(gòu)并且結(jié)合于RNA祀標(biāo)從而直接調(diào)節(jié)其切割（Cech，T. (1990)Ann. Rev. Biochem. 59 : 543)。核酶選擇性地與靶RNA結(jié)合并且催化酯交換或水解反應(yīng)，以切割單鏈RNA中特定的 磷酸二酯聯(lián)接。如果被導(dǎo)入到細(xì)胞中，核酶具有與靶mRNA結(jié)合并抑制該mRNA的翻譯的能 力。和單鏈反義技術(shù)一樣，已經(jīng)通過向核酶結(jié)構(gòu)中引入一定的化學(xué)修飾證明了核酶的穩(wěn)定 性和活性（Goodchild US 6,204,027 ;Goodchild US 6,573,072)。隨著反義寡核苷酸和核 酶技術(shù)的持續(xù)進(jìn)步，也發(fā)現(xiàn)了其它基于寡核苷酸的技術(shù)。
[0009]基于 Fire 和 Mello 的開拓性發(fā)現(xiàn)（Fire 等人（1998)Nature，391 :806_811)，人 們的努力已經(jīng)轉(zhuǎn)向在哺乳動物系統(tǒng)中的RNA干擾（RNAi)技術(shù)（例如短干擾-RNA(siRNA)、 微小 RNA (miRNA)、DNA 指導(dǎo)的 RNAi (ddRNAi)、以及單鏈 RNAi (ssRNAi))。RNAi 是指利用設(shè) 計為與特定的mRNA革E1標(biāo)雜交的短寡核苷酸的轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)抑制過程（Fire等人（1998) Nature 391 :806-811 ;Zamore 等人（2000)Cell，101 :25-33)。在 siRNA 的情況下，短的、 雙鏈的RNA分子利用細(xì)胞酶機(jī)制來切割同源靶RNA分子（Rana (2007) Nature Rev. Mol. Cell. Biol. 8 :23-36)。雙鏈RNAi技術(shù)依賴于雙鏈RNA(dsRNA)的施用或表達(dá)，雙鏈RNA - 旦出現(xiàn)在細(xì)胞內(nèi)，則會與被稱為dicer的酶結(jié)合并切割成21-23個核苷酸。結(jié)果產(chǎn)生的 dicer-dsRNA復(fù)合物被轉(zhuǎn)移至含有Argonaut的蛋白質(zhì)復(fù)合物并與之相互作用，該復(fù)合物被 稱為RNA-誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物（RISC)。認(rèn)為RISC存在于細(xì)胞中并且催化地分解特定的mRNA 分子。一旦與RISC結(jié)合，該dsRNA會展開得到ssRNA-RISC復(fù)合物，其能夠水解靶mRNA。一 旦發(fā)生雜交，則該RISC復(fù)合物分解mRNA。在一些情況下，使用單鏈RNAi (ssRNAi)組合物 可以避開dicer的dsRNA特異性過程，該單鏈RNAi (ssRNAi)組合物與RISC直接相互作用 從而實現(xiàn)基因表達(dá)的抑制（Holen等人（2003) Nuc. Acids Res. 31:2401-2407)。盡管RNAi 技術(shù)能夠選擇性地與靶mRNA結(jié)合，但已經(jīng)認(rèn)識到這樣的分子會通過與TLR3的相互作用誘 導(dǎo)非特異性的免疫刺激（Kleinman 等人（2008) Nature 452 :591-597 ;De Veer 等人（2005) Immun. Cell Bio. 83 :224-228 ;Kariko 等人（2004) J. Immunol. 172 :6545-6549)。這樣的非 特異性免疫激活在RNAi技術(shù)作為藥劑的應(yīng)用方面引發(fā)了問題。
[0010] 盡管上述每種基于反義的技術(shù)在使用時均取得了一定的成功，但由于它們是基于 寡核苷酸的，這些技術(shù)均具有在體內(nèi)不穩(wěn)定以及可能產(chǎn)生脫靶效應(yīng)（例如非期望的免疫刺 激，（Agrawal 和Kandimalla(2004)Nature Biotech. 22 :1533_1537))等固有問題。在dsRNA 的情況下，這些寡核苷酸還存在到細(xì)胞的體內(nèi)傳遞不充分的問題（Medarova等人（2007) Nature Med. 13:372-377)。盡管有很多反義寡核苷酸藥物候選產(chǎn)品的臨床實驗，但僅有一 個這樣的化合物得到了 FDA的批準(zhǔn)作為藥物。該反義化合物被證實可以用于治療CMV，但是 從未作為產(chǎn)品上市。另外，尚沒有核酶或siRNA藥物候選產(chǎn)品通過了 FDA的批準(zhǔn)。
[0011] 所有這些技術(shù)的優(yōu)化手段都聚焦于解決生物穩(wěn)定性、靶標(biāo)識別（例如，細(xì)胞滲透 性、熱穩(wěn)定性）以及體內(nèi)活性等問題。通常，這些考慮因素是相互競爭的。例如，傳統(tǒng)的 反義寡核苷酸利用磷酸酯核苷酸間聯(lián)接，其被證實在生物學(xué)上過于不穩(wěn)定以至于無法有效 地使用。因此，人們曾關(guān)注于對反義寡核苷酸進(jìn)行修飾以使得其生物學(xué)上更為穩(wěn)定。早 期的方法關(guān)注于對核苷酸間聯(lián)接進(jìn)行修飾以使得它們對于細(xì)胞核酸酶的降解更有抗性。 這些手段導(dǎo)致大量具有非天然核苷酸間聯(lián)接（例如硫代磷酸酯、甲基膦酸酯（Sarin等人 (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85 :7448-7451))，以及基于肽的聯(lián)接（Matsukura 等人（1987) Proc. Natl. Acad. Sci. 84 :7706 ;Agrawal 等人（1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85 :7079_7083 ; Miller(1991)Bio_Technology 9:358)的反義寡核苷酸的開發(fā)。但是，這些修飾使得分子 的靶標(biāo)特異性降低，并且產(chǎn)生不需要的生物活性。
[0012] 后來的改善穩(wěn)定性并且保持特異性及生物活性的方法使用了混合的主鏈寡核苷 酸，混合的主鏈寡核苷酸含有磷酸二酯和硫代磷酸酯核苷酸間聯(lián)接。該混合的主鏈?zhǔn)沟?與僅具有磷酸二醋聯(lián)接的寡核苷酸相比，它們的生物穩(wěn)定性得到保持或改善（Agrawal等 人（1990) Proc. Natl. Acad. Sci. 87 :1401-1405 ;US 專利公開 No. 20010049436)?？v觀寡 核苷酸研宄，已經(jīng)認(rèn)識到這些分子在體內(nèi)對于外切核酸酶的降解敏感，其中主要的降解出 現(xiàn)在分子的 3' 端（Shaw 等人（1991)Nucleic Acids Res. 19:747-750 ;Temsamani 等人 (1993)Analytical Bioc. 215 :54-58)。因此，避免該外切核酸酶活性的途徑采用了下述方 式：（i)在 5' 和 / 或 3' 末端的帽狀結(jié)構(gòu)（Tesamani 等人（1992)Ann. NY Acad. Sci. 660 : 318-320 ;Temsamani 等人（1993)Antisense Res. Dev. 3 :277_284 ;Tang 等人（1993)Nucl. Acids Res. 20 :2729-2735)，（ii)通過分子之間的 5' -3'、5' -2、