200稀釋的陽標記抗人類IgG(南方生物技術（SouthernBiotech)) 和不同濃度的AlexaFluor647標記的TNF-a在冰上雙重染色1小時，用FACS緩沖液（磯 酸鹽緩沖鹽水（PB巧加0. 5%牛血清白蛋白炬SA))洗涂并在化CS化libuHBD)上分析。利 用濃度介于20nM到0.26nM范圍內的AlexaFluor647標記的TNF-a執(zhí)行滴定曲線。各 曲線的中點（此處發(fā)生半數(shù)最大結合）定義抗體/抗原復合物的EC。。。野生型D2E7的結 果顯示于圖5中。在此分析中，表面展示的D2E7F油W0. 15nM的ECg。結合到TNF-a。
[0143]使抗D2E7抗體1H1U5A1和10F8(抗個體基因型，抗Id)與生物素偶聯(lián)。使Img各 抗Id與43ygSul化-N服-LC-生物素（皮爾斯（Pierce))試劑于室溫下反應2小時。通 過在亞米康（Amicon)微量離也過濾器中旋轉移除過量生物素。將經PCW600-D2E7轉染的 293C18細胞用1/200稀釋的陽標記抗人類IgG(南方生物技術）和生物素化抗Id雙重染 色1小時，用FACS緩沖液（磯酸鹽緩沖鹽水牌巧加0. 5%牛血清白蛋白炬SA))洗涂，隨 后用1/200稀釋的抗生蛋白鏈菌素-APC染色。W濃度介于20nM到0. 26nM范圍內的抗Id 執(zhí)行滴定曲線。各曲線的中點（此處發(fā)生半數(shù)最大結合）定義抗Id/D2E7復合物的ECg。。 各抗個體基因型的結果顯示于圖6中。在此分析中，表面展示的D2E7F油分別W0. 77nM、 0. 37nM和 1. 28nM的ECs。結合到抗Id1H1U5A1 和 10F8。 陽144]連例3 :D2E7單一氨某酸突巧體庫的構筑
[0145] 祀向各D2E7CDR氨基酸位置（在圖1A中加下劃線，總共34個Vh位置和27個Vl 位置）用于NNK隨機化。使用NNK編碼方案（其中N=A、C、G或T且K=G或T)，該是因 為1)編碼所有20種天然氨基酸僅需要32個密碼子，2) 32個密碼子中僅包括單一終止密碼 子（TAG),和3)最大簡并性（編碼單一氨基酸的不同密碼子數(shù)）是3,而不是在完全64密 碼子遺傳密碼中出現(xiàn)的最大6倍簡并性。
[0146] 由合成基因的商業(yè)供應商值NA2.0, 口洛帕克，加利福尼亞州）合成61個不同 DNA片段，其各自在不同CDR位置具有NNK簡并性。利用引物D2E7reampFwd(5'-CTCGAAAA TAATAAAGGGAAAATCAG-3,）（SEQIDN0:11)和D2E7reampRev(5, -TGGTAGTGTGGGGACTC-3,） (SEQIDNO: 12)對該些片段進行PCR擴增。純化PCR產物，隨后用NgoMIV和SacI消化Vh 片段，并用Notl和化〇1消化￥^片段。在瓊脂糖凝膠上運行所有片段，純化并亞克隆到攜 帶相對野生型可變區(qū)片段的質粒PCW600-D2E7中。將所得質粒單獨轉型到埃希氏大腸桿菌 Top10細胞（英杰，力巧Ij福尼亞州）中W形成61個不同DNA片段中的各者的轉型體的子 庫。執(zhí)行所述轉型，使得所獲得的埃希氏大腸桿菌轉型體是各子庫中可能密碼子的總數(shù)的 至少10倍。匯集Vh和VL的所得子庫W產生兩個最終庫-包含34個位置和1088個不同密 碼子的D2E7Vh庫，W及包含27個位置和總計864個不同密碼子的D2E7VJ#。 陽147]連例4 :D2E7Vj日V,點突巧體F油庫針對TNF-g結合的FACS染朽巧4路分洗[014引 用 0. 5yg庫質粒、lOOygpUC19 載體質粒和 250y1lipofectamine將D2E7Vh和 VJ#轉染到293cl8細胞中，2天后用0. 8yg/ml嘿嶺霉素選擇并再培養(yǎng)18天，之后進行FACS分選。將細胞用0. 15納摩爾濃度的AlexaFluor647-TNF-a和1:200陽標記的抗 IgG(南方生物技術）染色并在MoFloFACS機（大科北美值akoNodhAmerica)公司，卡 平特里亞，加利福尼亞州）上進行分選。野生型D2E7和Vh點突變庫的FACS分選概況顯示 于圖7A-7B中。圖A顯示經野生型D2E7F油表達質粒PCW600轉型的細胞的FACS概況；X軸 顯示用PE-抗IgG染色且y軸顯示用AlexaFluor647-TNF-a染色。由于細胞群體中的 抗體是異源表達，故FACS概況顯示大致沿指向右上象限的對角線排列的個別數(shù)據(jù)點。
[0149]基于FACS間將Vh點突變庫的TNF-a染色細胞分選為4個子群（圖7A-7B，圖B)。 使用野生型抗體在類似FACS條件下的特征來設定間W將細胞分選為較高親和性（H)群體 (R4)、中性或'中等'親和性（M)群體巧5)、較低親和性（L)群體（R6)和IgG非表達狂）群 體巧3)。X軸顯示抗IgG-PE染色且y軸顯示用人類-TNF-a-AF647染色。 。巧0] 連例5 :D2E7Vj日V,點突巧體F油庫針對杭Id結合的FACS染朽巧2路分洗
[015U將表達D2E7的細胞用0. 15納摩爾濃度AlexaFluor647-TNF-a和EC日。（1H11為 0. 77nM，5A1為0. 37nM和10F8為1. 28nM)的生物素化抗個體基因型mAb共染色，隨后于室 溫下培育2小時。隨后洗涂細胞并于4C下與抗生蛋白鏈菌素-APC和抗人類IgGK-門TC 一起培育1小時。洗涂細胞，隨后在MoFloFACS機（大科北美公司，卡平特里亞，加利福尼 亞州）上進行分選。經mil染色的野生型D2E7和Vh庫的FACS分選概況顯示于圖8A-8B中。抗IgG-PE染色顯示于X軸上且抗IdlHll-APC染色顯示于y軸上。執(zhí)行2路分選，從 而W"分選"（與抗個體基因型結合較低的細胞）和"表達"（對抗人類IgGKFITC呈陽性 的細胞）間收集最少200萬個細胞。
[0152] 由于抗體在細胞群體中異源表達，故FACS概況顯示大致沿指向右上象限的對角 線排列的個別數(shù)據(jù)點。D2E7WT和VH點突變庫的FACS概況分別顯示于圖8的圖A和B中。 為收集各庫中W所有表達點突變在庫中的正確頻率含有所述點突變的參考細胞群體，繪制 具有平行于y軸的左邊緣的間；利用該些間的分選收集所有IgG表達超出一定水平的細 胞，不管所展示抗體與抗Id的結合程度如何。該些間和群體命名為"表達間"和"表達群 體"（圖B"R4")。W大致平行于野生型群體的主對角線并在其正下方繪制的間的頂部進行 其它分選；該些間經設計W收集表達對抗個體基因型的結合親和性降低的抗體的細胞，不 管其IgG表達的整體水平如何。該些間和群體稱作"分選間"和"分選群體"（圖B"R3")。 W"分選"和"表達"間二者收集約2, 000, 000個細胞。 。巧引 連例6 :"表武"巧"分洗"群體的大規(guī)樽平行測序
[0154] 從"表達"和"分選"細胞群體回收質粒并執(zhí)行PCR擴增W制備適于大規(guī)模平行測 序的短擴增子。使用PCR引物，其緊鄰D2E7Vh和Vl結構域的CDR1和CDR3區(qū)外退火。引物 是；乂11正向引物〇267_￥山〔01?1_5，-7^617616口'6〔41'〔4661'1'1'-3,669 10側：13)八11反向引 物D2E7_VH_CDR3_rev 5，-GGTCACCAGTGTTCCCTGAC-3,（SEQ ID N0:14) ;Vl正向引物D2E7_ VL_CDR1_5，-GTAGGCGACAGGGTCACMT-3，（SEQ ID N0:15);和Vl反向引物D2E7_VL_CDR3_rev 5'-AGTCCGTTTGATCTCGACCTT-3'（SEQ ID N0:16)。因此，各擴增子含有完整CDR 1、CDR2和 CDR3區(qū)用于對所有點突變進行定位和制表，但省略框架1和4的大部分。隨后使用基因組 巧1|序儀FLX如由制造商所指導對D2E7Vh和V "分選"和"表達"擴增子進行測序。（454 生命科學（Life Sciences),布蘭福德，康涅狄格州）。
[0155] 使用計算機程序檢驗序列并將在"表達"和"分選"群體中發(fā)現(xiàn)各點突變的次數(shù)制 表。計算機程序首先讀數(shù)并將各密碼子制表。對于具有一個W上密碼子的氨基酸，程序將 各氨基酸中不同密碼子的出現(xiàn)率加在一起，W整體概述各子群中所述氨基酸變體的特征。
[0156] 對于評價與TNF-a的結合的D2E7庫的4路分選，給出各密碼子變體的富集比 巧時評分。ER表示在H群體中發(fā)現(xiàn)變體的頻率與其整體頻率相比高多少或低多少。類似地， 可計算M、L和Z群體各者中各變體的富集比。預計較高親和性變體在H群體中富集巧R〉l) 且在L群體中缺乏巧R<1)。相反地，預計較低親和性突變體在H群體中缺乏巧R<1)且在L 群體中富集巧R〉l)?？蓛H通過查看H群體的富集比來識別較高、較低和中性親和性變體。
[0157] 在評價D2E7庫與抗個體基因型的結合的2路FACS分析中，"分選"群體含有與抗 個體基因型結合較低的變體。在該種情形中，分選變體的較高ER表示與抗個體基因型的結 合降低。 。巧引 連例7 :具有所需巧質的點突巧體的識別
[0159] 為分析數(shù)據(jù)，針對對位置測序的次數(shù)規(guī)范化在給定位置發(fā)現(xiàn)突變的次數(shù)且表示為 每1000個序列的頻率。隨后用分選群體中的突變頻率除W所表達群體中的頻率W給出富 集比巧時，其指示與所表達群體相比，突變在分選群體中是否富集或缺乏W及其程度。在分 選群體中富集的突變與TNF-a的結合將增強，而缺乏的突變的結合將降低。類似地，與抗 個體基因型的結合降低的分選細胞將對特定抗個體基因型具有高富集比。 陽160] 連例8:沉默野牛巧密碼子分析
[0161] 在測定庫中的變體在分選子群中是否富集或缺乏時，有用地在相同實驗條件下比 較變體的特征與野生型蛋白質的特征。該可通過跟蹤沉默WT密碼子的特征容易地進行，所 述沉默WT密碼子是編碼WT蛋白質但含有因NNK隨機化產生的沉默密碼子變化的變體DNA 序列。舉例來說，在野生型密碼子是GGG(甘氨酸）的庫位置處，NNK隨機化將產生GGT密 碼子，其仍編碼甘氨酸，但在本文所述分選和統(tǒng)計分析方法中可如任何其它變體一般對其 加W跟蹤。根據(jù)起始密碼子，可在任一位置出現(xiàn)0到3個沉默野生型密碼子；在實踐中該 確保在覆蓋50-65個不同位置的典型CDR庫中將可獲得數(shù)十個沉默野生型密碼子?？墒褂?該些沉默野生型富集比的平均值確定實驗的中點；高于此中點，將發(fā)現(xiàn)親和性改良的變體； 低于此中點，將發(fā)現(xiàn)親和性較低的變體；且在所述中點附近將發(fā)現(xiàn)中性變體。圖9顯示沉默 野生型密碼子分析的結果。有益突變（即，那些具有與抗個體基因型1H11的降低結合和與 TNF-a的中性結合者）可具有高于0. 25(平均值+1SD)的IHll-m?和介于1. 21與1. 59之 間（平均值 +/-1SD)的TNF-a-ER。 陽16引連例9 :單點FACS分析
[0163] 為預測CDR中可導致與抗個體基因型的結合降低的位置，用僅有一個位置突變?yōu)?32個可能密碼子的子庫轉染平鋪于96孔板中的293C18細胞（圖10)。培養(yǎng)2天后，收獲 細胞并用與PE偶聯(lián)的抗個體基因型巧Q。）和TNF-a-647 (ECw)染色。FACS分析顯示具有 與抗個體基因型的結合低的大細胞群體的位置。圖11顯示，Vh中的一些位置（加圓圈）可 經突變W降低1H11結合，并且無立置可導致類似效應。類似地，圖12顯示，V錐中某些 位置的突變可降低與抗個體基因型5A1和10F8的結合。Vh鏈中的突變不會降低與5A1和 10F8的結合。
[0164] Vh中具有經預測對1H11結合重要的變灰位置的D2E7的Pymol模型顯示于圖 13A-13D中。所預測表位顯示，盡管所述位置散布在H個CDR之間，但其在模型中她鄰并形 成不連續(xù)構象表位。類似地，圖14A-14D顯示，￥^中對5A1和10F8結合重要的位置形成構 象或不連續(xù)表位。
[0165] 為確認與抗個體基因型的結合降低，在細胞表面上表達單一突變體全長IgG，隨 后用與AF647偶聯(lián)的抗個體基因型巧Cg。）和抗IgG-PE染色。為確認與祀的中性結合，用 TNF-a-AF64^ECs。）和抗IgG-PE對細胞表面上的全長IgG染色。
[016引VhCDR1-2 (Y32)從Y突變?yōu)镵、R、S、T或V。圖15顯示突變體的單點FACS分析。 用抗個體基因型1H11進行的FACS染色確認所有變體的結合降低。TNF-a染色顯示除T 外的所有突變體都是中性結合，該與圖16中此突變體的較低ER相關。選擇圖16中所示的 D2E7Vj勺有益突變作為與1H11具有降低結合（1H11-ER高于0. 25)且與TNF-a具有中性 結合（TNF-a-ER為1. 21-1. 60)者。不期望突變呈灰色。
[0167] 圖17提供平均1H11富集比（W位置計）。D2E7Vh中具有高平均邸的位置具有 更多的可能氨基酸取代，從而使抗體與抗Id1H11的結合降低。
[0168] 圖18提供平均5A1富集比（^位置計）。〇267￥^中具有高平均邸的位置具有更 多的可能氨基酸取代，從而使抗體與抗個體基因型5A1的結合降低。
[0169] 圖19提供平均10F8富集比（^位置計）。〇267￥^中具有高平均邸的位置具有 更多的可能氨基酸取代，從而使抗體與抗個體基因型10F8的結合降低。
[0170]連例10 :D2E7橋接分析
[0171] 研發(fā)D2E7橋接分析W使D2E7與從人類供體獲得的抗阿達木單抗抗體（ADAb)的 結合可視化。于4°C下用PBMS中的0. 5yg/ml野生型D2E7抗體涂布Immobilon高結合 ELISA板過夜。第二天，用含有0. 1 %吐溫（Tween)-20的PBS(PBS/吐溫）洗涂板。用PBS 中的1 %人類AB血清化uAB/PB巧將板于室溫下封阻1-2小時。將人類血清試樣（生物再 生炬ioreclamation)，紐約）在huAB/PBS中稀釋并添加到化ISA板中。最后，添加生物素化 野生型D2E7抗體到15ng/ml的最終濃度。將板在4C下培育過夜。第二天，在PBS/吐溫中 洗涂板。根據(jù)制造商的推薦在huAB/PBS中W1:1000稀釋抗生蛋白鏈菌素-HRPO(MABTECH) 并W100y1/孔添加到板中。將板于室溫下培育30分鐘，隨后用PBS/吐溫洗涂一次并用 蒸觸水洗涂兩次。添加TMB單組份炬io巧實驗室炬io巧L油oratories))并顯色15分鐘。 于650nm下讀板。包括陽性對照（鼠類抗人類D2E7單克隆抗體）。 陽17引連例11 :巧于輪證D2E7V式日點突巧體的抑制分析
[0173] 使用實例10的橋接分析篩選來自在其知情同意書上列示阿達木單抗而非氨甲蝶 嶺作為藥劑的人類供體的市售血清試樣中的抗阿達木單抗（"ADAb")的存在。選擇顯示 ADAb的證據(jù)的供體用于進一步研究。通過使用下述陽性和陰性對照執(zhí)行抑制分析來確認 ADAb的特異性。所選供體的ADAb對D2E7的Fab片段具有特異性。
[0174] 針對D2E7橋接分析的抑制篩選識別為與D2E7相比對鼠類抗個體基因型抗體的結 合降低的變體抗體。變體抗體在橋接分析中的抑制顯示，變體仍能夠結合患者血清ADAb。 因此，不干擾橋接分析的變體不與ADAb交叉反應，且因此代表D2E7的抗體結合表位內的突 變。
[017引將ImmobilonELISA板用0. 5yg/ml野生型D2E7涂布過夜，洗涂并封阻。在單獨 96孔板中，將D2E7變體抗體在huAb/PBS中稀釋到10yg/ml。W-式兩份測試各變體。使 用赫賽汀化erceptin)和DP10 (與D2E7無關的IgGi抗體）作為抗阿達木單抗抗體結合的 陰性對照。使用野生型D2E7抗體作為抑制的陽性對照。還分別使用DP10和D2E7F油片段 作為陰性和陽性對照。將來自對阿達木單抗展現(xiàn)免疫反應的供體的血清在huAB/PBS中稀 釋到1:25,并且將100y1添加到含有變體和對照的孔中。供體血清的最終濃度是1:50。將 100y1稀釋血清和所添加的變體和對照轉移到D2E7涂布板。立刻將100y1于huAB/PBS 中的30ng/ml生物素化D2E7添加到板中。將板于4°C下培育過夜。第二天，洗涂板，并添 加稀釋抗生蛋白鏈菌素-HRP0。將板用PBS/吐溫-40洗涂一次，并添加TMB單組份炬io巧 實驗室）并顯色15分鐘。于650皿下讀板。
[0176] 包括無關抗體DP10作為所有測試中的對照且其對ADAb與板上的D2E7的結合無 影響。對ADAb與DP10結合的抑制％平均為88+/-12 %。利用來自四個商業(yè)供體的ADAb陽 性血清試樣執(zhí)行抑制分析。所有四個供體的結果大部分重疊，VhCDR3的變化對ADAb結合 的影響最大（圖20A-20B)。W兩種方式選擇優(yōu)選變體：圖21A顯示所有抑制百分比比所測 試的所有變體的平均值高大于2個標準偏差的變體的列表。圖21B顯示所有在四個供體的 任一者中具有任何顯著活性的變體。所識別的最佳點突變是T100V，抑制％為53+/-10%。 V95W次佳，平均值為47%。除VhCDR3外的最佳變體是具有2個變體氨基酸取代的VlR30， 平均百分比為23%。
[0177] 基于單一變體的數(shù)據(jù)產生組合變體。構筑在VH和化二者中含有變化的組合，在一 些情形中將所述取代納入變體化中，所述變體化在CDR-L1中具有取代G28S和A34S(卡 己特編號），其對應于如W0 2010/121140中最初描述的CDR-L1中的G5S+A11S組合。具有 G5S+A11S取代的變體化主鏈在本文中稱作化-SS。表達變體抗體并純化且在ADAb抑制分 析和TNF-a結合親和性分析中測試。對2個W上供體的ADAb結合結果取平均值。使用 表面等離子體共振測試（拜爾科炬iacore))評價結合。結果顯示于圖22中。變體Y32K/ SS-R30T和Y32K/SS-R30I展現(xiàn)降低ADA結合與保留抗TNFa親和性的最佳組合。
[0178] 本申請案中引用的所有出版物、專利、專利申請案和其它文件都是出于所有目的 全文W引用方式并入本文中，其并入程度如同出于所有目的將每一個別出版物、專利、專利 申請案或其它文件個別指明W引用方式并入一般。
[0179] 盡管已闡釋并描述各個具體實施例，但應了解，可在不背離本發(fā)明的精神和范圍 的情況下進行各種改變。
【主權項】
1. 一種識別具有降低免疫原性的參考抗體變體的方法，其包含以下步驟： (a) 使宿主細胞庫與特異性結合到參考抗體的抗個體基因型抗體接觸，所述參考抗體 是結合到靶分子的單克隆抗體，所述宿主細胞庫包含各自在細胞表面上表達與所述參考抗 體相差單一氨基酸點突變的抗體變體的哺乳動物宿主細胞； (b) 識別所述宿主細胞庫中表達抗體變體的細胞群體，所述抗體變體展示相對于所述 參考抗體降低的與所述抗個體基因型抗體的結合；和 (c) 識別在所述群體中富集的抗體變體， 由此識別具有降低免疫原性的參考抗體變體。
2. 根據(jù)權利要求1所述的方法，其中步驟（b)包含對所述宿主細胞庫進行流式細胞計 數(shù)法并從所述宿主細胞庫分選所述群體。
3. 根據(jù)權利要求2所述的方法，其中所述流式細胞計數(shù)法是熒光活化細胞分選FACS。
4. 根據(jù)權利要求1到3中任一權利要求所述的方法，其進一步包含（d)測定所述抗體 變體是否保留其結合到所述靶分子的能力。
5. 根據(jù)權利要求4所述的方法，其中步驟（d)包含通過流式細胞計數(shù)法、磁性珠粒分 選、BIAcore、FACS、ELISA、AlphaLisa和KinExA分析所述抗體變體與所述祀分子的結合水 平。
6. 根據(jù)權利要求5所述的方法，其中步驟（d)包含在包含以下步驟的方法中通過流式 細胞計數(shù)法分析所述抗體變體與所述靶分子的結合水平：（i)使所述宿主細胞庫或所述群 體的細胞與熒光標記靶分子接觸；（ii)對所述細胞進行流式細胞計數(shù)法；（iii)依照結合 的熒光標記靶分子的量將所述細胞分選為子群；和（iv)測定所述抗體變體在表達抗體變 體的細胞子群中是否富集，所述抗體變體與所述靶分子的結合實質上等于或優(yōu)于所述參考 抗體，由此測定所述抗體變體是否保留結合到所述靶分子的能力。
7. 根據(jù)權利要求6所述的方法，其中步驟（d) (i)到（d) (iii)是在步驟（b)之前、同時 或之后實施。
8. 根據(jù)權利要求6到7中任一權利要求所述的方法，其中步驟（d) (iv)是在步驟（c) 之前、同時或之后實施。
9. 根據(jù)權利要求1到8中任一權