水稻抗病相關(guān)基因OsPAD4的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域。具體涉及一個(gè)水稻抗病相關(guān)基因0SPAD4的 功能驗(yàn)證及應(yīng)用。該基因編碼一個(gè)類甘油三酯脂酶（triacylglycerollipase),它正向調(diào) 控水稻對(duì)白葉枯病和細(xì)菌性條斑病的抗性以及創(chuàng)傷誘導(dǎo)的系統(tǒng)抗性。
【背景技術(shù)】
[0002] 水稻是世界上重要的糧食作物，但病害的影響會(huì)造成其產(chǎn)量和品質(zhì)的下降。水稻 白葉枯病是由黃單孢桿菌水稻致病變種一白葉枯病菌（Xanthomonasoryzaepv.oryzae) 引起，是世界上對(duì)水稻危害最大的細(xì)菌性病害之一。另外，由黃單孢桿菌的另一個(gè)水 稻致病變種一細(xì)菌性條斑病菌引起的細(xì)菌性條斑病（細(xì)條??；Xanthomonasoryzae pv.oryzicola)也是水稻的重要病害；在我國(guó)，它是水稻檢疫病害。
[0003] 植物的抗病反應(yīng)是多基因參于調(diào)控的復(fù)雜過程。參于植物抗病反應(yīng)的基因分為兩 大類：（1)主效抗病基因，又稱MR(majorresistance,Zhang和Wang2013)基因和（2)抗 病相關(guān)基因。七個(gè)已經(jīng)被克隆的主效抗白葉枯病基因（Xal，Xa3/Xa26,xa5,xal3,Xa21，xa25 和Xa27)編碼的蛋白質(zhì)是多樣性的，說明水稻與白葉枯病菌互作關(guān)系的復(fù)雜性（Zhang和 Wang2013)。主效抗病基因介導(dǎo)的抗病反應(yīng)抗性強(qiáng)，是很好的基因資源。但由于下述原 因，使利用主效抗病基因改良植物抗性受到限制：（1)主效抗病基因的資源有限，如目前知 道的抵抗水稻重要病害白葉枯病的主效抗病基因只鑒定了大約37個(gè)；目前還沒有在水稻 中發(fā)現(xiàn)抵抗細(xì)條病的主效抗病基因；（2)主效抗病基因具有病原種類和病原生理小種特異 性，抗病范圍有限；（3)因?yàn)椴≡目焖偻蛔儯粋€(gè)主效抗病基因的作用往往幾年或者十幾 年后就會(huì)喪失?？共∠嚓P(guān)基因是指除主效抗病基因外所有參于抗病反應(yīng)的基因，它們的編 碼蛋白質(zhì)參于合成植物體內(nèi)抗病信號(hào)分子、參于信號(hào)傳導(dǎo)、阻止信號(hào)傳導(dǎo)或參于防衛(wèi)反應(yīng) 等。很多抗病相關(guān)基因的特點(diǎn)是病原誘導(dǎo)后它們的表達(dá)量升高或減少，因此人們可以根 據(jù)病原誘導(dǎo)前后基因的表達(dá)量的差異，大規(guī)模地鑒定植物抗病相關(guān)基因（Maleck等，2000 ; Schenk等，2000 ;Zhou等，2002)。目前，人們對(duì)抗病相關(guān)基因的認(rèn)識(shí)有限。根據(jù)已有報(bào)道，絕 大多數(shù)抗病相關(guān)基因單獨(dú)作用時(shí)的抗性能力可能比主效抗病基因小。但根據(jù)下述原因，它 們是值得大力開發(fā)的基因資源：（1)由于絕大多數(shù)抗病相關(guān)基因編碼的蛋白質(zhì)不需要直接 與病原物相互作用，這類基因可能是具有持久抗性的基因資源；（2)大多數(shù)抗病相關(guān)基因 參于的抗病反應(yīng)沒有病原特異性，因此它們是具有廣譜抗性的基因資源；（3)這類基因的 資源豐富。雖然已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了很多在水稻一病原互作中表達(dá)量發(fā)生了改變的基因（Zhou等， 2002 ;Chu等，2004)，但是這些基因是否直接參與調(diào)控水稻抗病反應(yīng)（即屬于抗病相關(guān)基因） 卻不清楚。分離克隆抗病相關(guān)基因是對(duì)水稻抗病機(jī)理研究和應(yīng)用于水稻抗性改良的前提。 同時(shí)，與主效抗病基因的應(yīng)用相比，抗病相關(guān)基因的應(yīng)用能提供植物更為廣譜及長(zhǎng)效的抗 性。了解病害的發(fā)病機(jī)制，有助于利用高效途徑改良水稻的抗性，控制病害的發(fā)生。通過超 量表達(dá)作為抗病反應(yīng)正調(diào)控因子的抗病相關(guān)基因，或者通過抑制表達(dá)作為抗病反應(yīng)負(fù)調(diào)控 因子的抗病相關(guān)基因進(jìn)行作物品種的改良，將進(jìn)一步增強(qiáng)作物的抗病性，拓寬作物的抗譜。 這些方面是采用常規(guī)作物育種和改良技術(shù)所不能達(dá)到的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是鑒定一個(gè)水稻0sPAD4基因在水稻一病原互作中的功能，為利用 這個(gè)基因改良水稻抵御病害的能力奠定基礎(chǔ)。申請(qǐng)人將這個(gè)基因命名為0sPAD4。
[0005] 本發(fā)明涉及的0sPAD4基因賦予水稻對(duì)由白葉枯病菌和細(xì)菌性條斑病菌所引起的 病害產(chǎn)生抗病反應(yīng)。該基因的DNA序列如序列表SEQIDNO: 1所示，或者基本上相當(dāng)于SEQ IDN0 :1所示的DNA序列，或者其功能相當(dāng)于SEQIDN0 :1所示序列的亞片段。對(duì)其序列 進(jìn)行分析表明，它編碼一種類甘油三酯脂酶。阻止〇sPAD4表達(dá)，減弱水稻對(duì)白葉枯病和細(xì) 條病的抗性，同時(shí)也減弱水稻對(duì)創(chuàng)傷誘導(dǎo)的系統(tǒng)抗性。
[0006] 在本發(fā)明的實(shí)施例部分，我們闡述了 0SPAD4基因的分離、功能驗(yàn)證和該基因的特 點(diǎn)。
【附圖說明】
[0007] 序列表SEQIDNO: 1是0sPAD4基因的核苷酸序列和它對(duì)應(yīng)編碼的氨基酸序列。
[0008] 圖1.本發(fā)明鑒定和分離克隆水稻抗病相關(guān)基因0sPAD4以及驗(yàn)證該基因功能的流 程圖。
[0009] 圖 2.用定量反轉(zhuǎn)錄一PCR(quantitativereversetranscription-PCR,qRT-PCR) 技術(shù)檢測(cè)08?八04基因的表達(dá)模式。水稻材料(牡丹江8、他49、0490116)在成株期接種白葉枯 病菌生理小種PX061。"ck"表示沒有任何處理的對(duì)照樣品。"a"和"b"分別表示與ck相比 差異的顯著性水平在P〈〇. 01和P〈〇. 05;雙星號(hào)（**)和單星號(hào)（*)分別表示在同一時(shí)間點(diǎn)， 轉(zhuǎn)基因株系（Rb49或D490M6)與對(duì)照牡丹江8相比差異的顯著性水平在P〈0. 01和P〈0. 05。
[0010] 圖3.抑制0sPAD4基因表達(dá)的遺傳轉(zhuǎn)化載體的主要結(jié)構(gòu)特征圖。它是在PDS1301 載體的多克隆位點(diǎn)插入了 566個(gè)核苷酸的0sPAD4基因的cDNA片段的反向重復(fù)序列。RB 和LB代表T-DNA右和左邊界；Hpt代表潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因（篩選基因）;35S代表花椰菜 花葉病毒啟動(dòng)子；AdhI代表玉米乙醇脫氫酶基因內(nèi)含子I;Waxy-a代表水稻W(wǎng)axy基因內(nèi)含 子；0CS代表章魚堿合成酸基因終止子；⑶S代表0 -葡萄糖苷酸酶基因(標(biāo)記基因)。
[0011] 圖4.用實(shí)時(shí)定量RT-PCR技術(shù)檢測(cè)0SPAD4基因在對(duì)照(牡丹江8)和I；代遺傳轉(zhuǎn) 化植株（D146RM)中的表達(dá)量以及表達(dá)量與接種白葉枯病菌PX061后植株病斑面積大小的 關(guān)系。"a"和"b"分別表示與對(duì)照(牡丹江8)相比差異的顯著性水平在P〈0. 01和P〈0. 05。
[0012] 圖5.用實(shí)時(shí)定量RT-PCR技術(shù)檢測(cè)0sPAD4基因在對(duì)照(牡丹江8)和代遺傳轉(zhuǎn) 化植株（D146RM)中的表達(dá)量以及表達(dá)量與接種白葉枯病菌PX099后植株病斑面積大小的 關(guān)系。"a"和"b"分別表示與對(duì)照(牡丹江8)相比差異的顯著性水平在P〈0. 01和P〈0. 05。
[0013] 圖6.白葉枯病菌PX061在兩個(gè)遺傳轉(zhuǎn)化家系（D146RM6-7和D146RM7-3)和對(duì) 照(牡丹江8)水稻植株中的生長(zhǎng)分析。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的細(xì)菌數(shù)是來自3片葉的細(xì)菌生長(zhǎng)數(shù) (colony-formingunit,cfu)的平均數(shù)。"0天"代表接種1小時(shí)后取樣。
[0014] 圖7. 0sPAD4基因在水稻品種牡丹江8中受創(chuàng)傷誘導(dǎo)表達(dá)模式。水稻樣品為創(chuàng)傷處 理1、3、6、12、24、48、72小時(shí)后的未創(chuàng)傷葉(水稻植株的上部葉）和創(chuàng)傷葉(水稻植株的下部 葉)。"a"和"b"分別表示創(chuàng)傷處理植株與未創(chuàng)傷植株（ck)相比差異的顯著性水平在P〈0. 01 和P〈0.05。
【具體實(shí)施方式】
[0015] 本發(fā)明的前期結(jié)果顯示，在水稻一細(xì)菌性病原互作中，0SPAD4基因的表達(dá)量發(fā)生 改變，提示該基因可能參于水稻一病原互作的調(diào)控（Qiu等，2007)。但是該基因是正向調(diào)控 水稻抗病反應(yīng)還是負(fù)向調(diào)控水稻抗病反應(yīng)卻不清楚。為了回答這些問題，產(chǎn)生了本發(fā)明。
[0016] 以下實(shí)施例中進(jìn)一步定義本發(fā)明，圖1描敘了鑒定和分離克隆0sPAD4基因以及驗(yàn) 證該基因功能的流程。根據(jù)以上的描述和這些實(shí)施例，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以確定本發(fā)明的 基本特征。
[0017] 實(shí)施例一 ：0sPAD4基因的表達(dá)模式分析
[0018] 本發(fā)明涉及的基因在MSU Rice Genome Annotation Project (http://rice. plantbiology. msu. edu/)中的編號(hào)為L(zhǎng)0C_0sllg09010。為了進(jìn)一步證實(shí)0sPAD4基因的 表達(dá)是否受病原入侵水稻的影響，我們采用定量反轉(zhuǎn)錄一PCR (quantitative reverse transcription-PCR，qRT-PCR)技術(shù)（Qiu等，2007)，分析了接種白葉枯病菌PX061后， 0sPAD4基因在感病水稻品種牡丹江8和抗病水稻家系Rb49和D490M6中的表達(dá)模式。牡丹 江8是常用的感病水稻品種，Rb49是牡丹江8背景、攜帶主效抗白葉枯病基因Xa3/Xa26的 轉(zhuǎn)基因株系（Sun等，2004;Cao等，2007) ;D490M6是牡丹江8背景、攜帶主效抗白葉枯病基 因Xa21的轉(zhuǎn)基因株系（Zhao等，2009)。白葉枯病菌生理小種PX061由菲律賓國(guó)際水稻研 究所惠贈(zèng)（Sun等，2004;見《遺傳資源來源