例僅 用于解釋和說明，而不是W任何方式限制本發(fā)明。
[003引實驗材料；
[0039] BALB/c小鼠；購自北京大學醫(yī)學部實驗動物中屯、。
[0040] rhNGF;重組人神經(jīng)生長因子，由申請人單位表達并純化（樂偉，彭踰佳，史權 威，等.重組人神經(jīng)生長因子的高效表達和生物活性評價研究.中國藥事.2014, 28化）； 601-606.)〇
[0041] NGF依賴的TF-1-A2細胞；由申請人單位本公司馴化后克隆化篩選的TF-1細胞 (劉荷中、樂偉、霍立紅，等.亞克隆細胞株TF-1-A2及其制備方法與用途.中國發(fā)明專利 授權號；ZL201210119401.X.)。
[0042] 注射用鼠神經(jīng)生長因子（蘇膚生，北京舒泰神藥業(yè)有限公司，批號；201211148)
[0043]AP標記的羊抗鼠IgG;購自SIGMA公司（Cat.No. :A3562)。
[0044] 本發(fā)明未特別說明的實驗試劑均為本領域常規(guī)試劑，可W通過商購或采用本領域 常規(guī)方法制備而得，規(guī)格為實驗純級即可。
[0045] 實施例1.抗hNGF單克隆抗體的制備
[0046]l、BALB/c小鼠免疫
[0047] riiNGF制備；由申請人自行表達、純化并制備（樂偉，彭踰佳，史權威，等.重組人 神經(jīng)生長因子的高效表達和生物活性評價研究.中國藥事.2014, 28化）；601-606.)。
[0048] 選取5只雌性BALB/c小鼠，將riiNGF抗原與弗氏完全佐劑（sigma公司）混合，乳 化完全后皮下注射，每只小鼠的免疫劑量為80yg免疫。首次免疫后，間隔2周及3周，將 rhNGF抗原與弗式不完全佐劑（sigma公司）進行乳化后重復免疫兩次，小鼠尾部取血，用 間接化ISA方法檢測血清特異性抗體的效價（結果如圖1所示），其中2#小鼠效價可達1 ; 1〇4,分別對1#、2#、3#、4#和5#小鼠進行融合試驗。融合前3天，腹腔加強免疫1次。
[0049] 2、雜交瘤細胞的制備
[0化0] 超凈臺內(nèi)無菌環(huán)境下取免疫BALB/c小鼠的脾臟研制成脾細胞懸液，用RPMI1640 培養(yǎng)基洗漆2次，收取1X1〇8脾細胞與2X10 7-5X1〇7骨髓瘤細胞SP2/0混合于一支50ml融合管中，補加RPMI1640培養(yǎng)基至30ml，充分混勻。10(K)r/min離屯、10分鐘，將上清盡量 吸凈。在手掌上輕擊融合管底，使沉淀細胞松散均勻。用1ml吸管在1分鐘左右加預熱 至37°C的50%PEG2000(PH8. 0)lml，邊加邊輕輕轉動，肉眼可見有顆粒出現(xiàn)，緩慢加入 RPMI1640培養(yǎng)基至20ml。100化/min離屯、6分鐘，棄去上清。前10天在HAT選擇性培養(yǎng)基 中進行培養(yǎng)，之后直至第一次克隆化完成前選用HT培養(yǎng)基培養(yǎng)。2周后用間接酶聯(lián)免疫吸 附法巧LISA法）檢測融合細胞的陽性率，選出陽性值較高的孔，經(jīng)有限稀釋對檢測出的陽 性雜交瘤細胞進行克隆，連續(xù)克隆化3次使陽性克隆孔的陽性率達兩次100%后，選出值高 的孔轉孔并擴大培養(yǎng)并凍存。獲得了穩(wěn)定分泌抗hNGF單克隆抗體的雜交瘤細胞株，其編號 為 11F1 和 12C11，送保藏，保藏號分別為；CGMCCNo. 8772 和CGMCCNo. 8773。
[0化1] 3、抗hNGF單克隆抗體腹水的制備、腹水效價測定及抗體純化
[0化引采用體內(nèi)誘生法大量制備單克隆抗體。取6-8周齡的健康Ba化/c雌性小鼠，腹腔 注射石蠟（0. 5ml/只）。1周后，雜交瘤細胞離屯、洗漆，用PBS調(diào)整細胞數(shù)至1X106個/ml, 每只小鼠注射0.5ml。5~7d后，待小鼠腹部膨大后，采集腹水并對腹水效價進行檢測。腹 水離屯、后收集上清，用ProteinASe地arose純化抗體。分裝后于-70°C保存。
[0化3]實施例2.抗hNGF單克隆抗體亞類鑒定
[0化4]義用Pierce公司的RapidELISAMouseAntibodyIsotypingKit(Cat.No. :37503)鑒定單抗的類及亞類，按照試劑盒說明書操作。
[0化5]表1抗hNGF單抗亞型的鑒定結果
[0化6]
【主權項】
1. 抗人神經(jīng)生長因子的中和性單克隆抗體IlFl，由保藏號為CGMCCNo. 8773的雜交瘤 細胞所分泌，所述中和單克隆抗體與人神經(jīng)生長因子具有中和反應效應，其分類亞型為：重 鏈IgGl、輕鏈Kappa。
2. 分泌人神經(jīng)生長因子中和性單克隆抗體IlFl的雜交瘤細胞株，其保藏號為CGMCC No.8773〇
3. -種止痛藥劑，其特征在于：其藥效成分包含權利要求1所述的中和性單克隆抗體 IlFlo
4. 一種抗過敏藥劑，其特征在于：其藥效成分包含權利要求1所述的中和性單克隆抗 體 11F1。
5. -種抗抗哮喘的藥劑，其特征在于：其藥效成分包含權利要求1所述的中和性單克 隆抗體IlFl。
6. -種用于治療銀肩病的藥劑，其特征在于：其藥效成分包含權利要求1所述的中和 性單克隆抗體IlFl。
7. -種鑒定抗神經(jīng)生長因子NGF抗體的中和活性的方法，步驟如下： (1) 用維持培養(yǎng)基配制抗體樣品溶液，在預稀釋濃度40yg/ml的基礎上，進行2倍系列 稀釋，共9個稀釋度，將待測樣品溶液轉移至96孔板中，每個濃度3個復孔，每孔50y1，另 選擇3個孔加入不含抗體的培養(yǎng)基作為陰性對照，每孔100y1 ; 所述 9 個稀釋度分別為：10yg/ml、5yg/ml、2. 5yg/ml、l. 25yg/ml、0. 625yg/ml、 0. 3125yg/ml、0. 15625yg/ml、0. 078125yg/ml、0. 039063yg/ml; (2) 另用維持培養(yǎng)基配制200ng/ml的NGF蛋白溶液，將其添加至含有抗NGF抗體樣品 溶液的96孔板中，每孔50y1，陰性對照孔不添加NGF培養(yǎng)基，另選擇3個孔加入陽性對照 溶液lOOng/mlNGF，每孔100y1，然后將96孔板放置于37°C培養(yǎng)箱孵育Ih; (3) 取足量TF-I細胞培養(yǎng)物，離心收集TF-I細胞，PBS洗滌2次，離心收集的細胞用維 持培養(yǎng)基重懸，配成每Iml含5XIO4個細胞的細胞懸液，接種于96孔細胞培養(yǎng)板中含有NGF 蛋白及抗NGF抗體的孔、陰性對照孔和陽性對照孔中，每孔100y1 ;將96孔板置于37°C， 5 %二氧化碳培養(yǎng)；72h后，每孔加入MTS溶液20y1，于37 °C，5 %二氧化碳培養(yǎng)3小時； (4) 從培養(yǎng)箱中取出96孔板，放入酶標儀，于波長490nm處測定吸光度，記錄測定結 果； (5) 通過待測制品的吸光度，按照公式：抗NGF抗體孔的中和抑制率（％) = [(陽性孔 0D490nm平均值-陰性孔0D490nm平均值）-(抗體孔0D490nm平均值-陰性孔0D490nm平 均值）V(陽性孔〇D490nm平均值-陰性孔0D490nm平均值），計算每孔的中和抑制率，中和 抑制率越高，則抗NGF抗體的中和活性越強。
【專利摘要】本發(fā)明“抗人神經(jīng)生長因子的中和性單克隆抗體11F1及其雜交瘤細胞株”，涉及免疫學領域?？谷松窠?jīng)生長因子的中和性單克隆抗體，由保藏號為CGMCC No.8773的雜交瘤細胞所分泌，所述中和性單克隆抗體與人神經(jīng)生長因子具有中和反應效應，其分類亞型為：重鏈IgG1、輕鏈Kappa。對人神經(jīng)生長因子具有特異性中和活性，可作為人神經(jīng)生長因子的拮抗劑。CGMCC No. 877320140116CGMCC No. 877220140116
【IPC分類】A61P37-08, A61P17-06, A61P11-06, G01N33-577, A61K39-395, C07K16-22, A61P29-00, C12N5-20, G01N33-68
【公開號】CN104774265
【申請?zhí)枴緾N201510073966
【發(fā)明人】劉荷中, 霍立紅, 何景昌, 樂偉, 史權威
【申請人】北京華安科創(chuàng)生物技術有限公司
【公開日】2015年7月15日
【申請日】2015年2月12日