20 基因的小麥 / 黑麥 6RL/6BS易位系TAM104S(Triticumaestivum)在 文獻"萬平，令利軍，周文娟，張文俊，凌宏清，朱立煌，張相岐.小麥鋅指蛋白基因的克隆、 序列與表達分析.遺傳學報，2004,9:895-900"中公開過，公眾可從中國科學院遺傳與發(fā)育 生物學研究所獲得。
[0049] 實施例1、抗白粉病相關(guān)基因ScRAG-6RL2的獲得及其功能驗證
[0050]-、取生長7天的小麥/黑麥6RL/6BS易位系TAM104R的葉片，洗凈后放入經(jīng)DEPC 處理、滅菌后的研缽中研磨粉碎，加入TRIzol(購自Invitrogen)充分混勻，室溫放置5分 鐘，經(jīng)氯仿抽提2次，取上清，用異丙醇沉淀總RNA，空氣干燥后，溶于適量DEPC水。以O(shè)ligo dT-引物（購自TaKaRa)進行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。
[0051] 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件如下：
[0052] DEPC水 2.Oul，總RNA3.Oul(I. 0iig)，OligodT-引物I.Oul(IOmM)，總體積為 6.Oul。
[0053] 70 °C保溫10分鐘，立刻置于冰上2分鐘，再在上述體系中加入 dNTPO. 5ul(dATP,dGTP,dITP,dCTP分別為IOmM)，RNase抑制劑 0? 25ul(I. 0 個單位），IOX 反轉(zhuǎn)錄緩沖液I.Oul，M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶0. 25ul(I. 0個單位），DEPC水2.Oul，整個體系總體 積為 10.Oul。
[0054] 42°C保溫60分鐘，70°C保溫15分鐘，反應(yīng)完成后置于4°C。
[0055] 取上述反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物用以下引物進行擴增。
[0056]正向引物：ScRGA-6RL2-LF:5' -CCCAGAAAGTCAATGCTC-3，；
[0057]反向引物：ScRGA-6RL2-LR:5' -CGTCGTGGTTACTCCTAC-3'。
[0058]PCR反應(yīng)條件：94°CImin;然后 94°C15s，57°C15s，72°C4min，30 個循環(huán)；最后 72。。5min。
[0059] 將PCR擴增產(chǎn)物連接到pMD19_T載體上，經(jīng)測序得到4374bp的產(chǎn)物，將其 命名為ScRGA-6RL2,將ScRGA-6RL2連接到pMD19-T上，得到重組質(zhì)粒，將其命名為 pMD19-T-ScRGA-6RL2〇
[0060]ScRGA-6RL2基因的cDNA序列如SEQIDNo. 1所示，其編碼框為SEQIDNo. 1中 自5'末端起第126位至第3935位核苷酸所示，其編碼的ScRGA-6RL2蛋白的氨基酸序列如 SEQIDNo. 2 所示。
[0061] 二、通過病毒介導的基因沉默實驗驗證ScRGA-6RL2基因的抗白粉病功能
[0062](一）誘導ScRGA-6RL2 基因沉默的BSMV-VIGS載體系統(tǒng)BSMV:ScRGA-6RL2 的構(gòu)建
[0063] 以步驟一獲得的重組質(zhì)粒pMD19-T-ScRGA-6RL2為模板，以如下引物對為引物進 行PCR擴增，得到PCR擴增產(chǎn)物。
[0064]ScRGA-6RL2-VIGS-F:5，-TCAGCTAGCGGTGTAACTGAGCTATGTGC-3;；
[0065]ScRGA-6RL2-VIGS-R:5' -CAAGCTAGCGAGCCTCTTCATAACAGGAC-3;。
[0066](下劃線所示序列為NheI酶切識別位點）
[0067]PCR擴增產(chǎn)物的核苷酸序列如SEQIDNo. 1中自5'末端起第3396位至第4103位 核苷酸所示。
[0068]NheI酶切PCR擴增產(chǎn)物，得到基因片段；NheI酶切BSMV-VIGS系統(tǒng)載體Y質(zhì)粒 的NheI位點（RNAy鏈Yb基因后），得到載體大片段；將基因片段與載體大片段連接，得 到重組質(zhì)粒。
[0069] 以引物ScRGA-6RL2-VIGS-F以及引物Y-strain-p5'-CAACTGCCAATCGTGAGTAG G-3'對重組質(zhì)粒進行PCR擴增鑒定，陽性克隆為SEQIDNo. 1中自5'末端起第3396位至 第4103位基因片段按基因表達方向的反向插入Y質(zhì)粒的的NheI位點，將該重組質(zhì)粒命 名為Y-ScRGA-6RL2重組質(zhì)粒。
[0070] Y-ScRGA-6RL2與a和P質(zhì)粒共同構(gòu)成了可沉默ScRGA_6RL2基因的完整重組病 毒載體系統(tǒng)BSMV:ScRGA-6RL2。
[0071] 圖1為大麥條紋花葉病毒（BSMV)載體結(jié)構(gòu)示意圖，圖中分別為a，@和Y鏈的 結(jié)構(gòu)。
[0072] (二）BSMV-VIGS實驗
[0073] 1、重組病毒載體的制備
[0074] 具體制備程序如下：
[0075] 按照GenEluteTMPlasmidMiniprepKit(Sigma)說明書分別抽提BSMV病毒載體 a、3、nScRGA-6RL2 質(zhì)粒，其中a、YY -ScRGA_6RL2 用Mlul，@ 用SpeI分別進行線 性化酶切。體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)按照RiboMAX?LargeScaleRNAProductionSystem_T7(Promega) 說明書進行操作：
[0076] 線性化質(zhì)粒 6. 5ul，5XTranscriptionBuffer4.Oul，Capl. 5ul，rNTP PreMix6.Oul，EnzymeMix2.Oul，反應(yīng)總體積20. 0ul，37°C反應(yīng)4小時，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物置-70°C保 存?zhèn)溆谩?br>[0077] a、0和Y (三個質(zhì)粒構(gòu)成BSMV病毒空載體）及a、0和Y -ScRGA_6RL2 (三個 質(zhì)粒構(gòu)成BSMV:ScRGA-6RL2重組病毒載體）三鏈轉(zhuǎn)錄物均用DEPC處理過的水稀釋3倍后 等體積混合，加入等體積的2XGKPBufTer(GKPBuffer含有50mM甘氨酸（glycine), 30mM K2HP04,pH9. 2, 1% 膨潤土（bentonite)，1% 硅藻土（celite))，分別得到BSMV病毒空載體溶 液以及BSMV:ScRGA-6RL2重組病毒載體溶液。
[0078] 2、實驗植物材料的培養(yǎng)及接種
[0079] 將小麥/黑麥6RL/6BS易位系TAMl04R播種于營養(yǎng)土中，待生長至二葉期，取 8-10iiLBSMV:ScRGA-6RL2重組病毒載體溶液涂抹接種于小麥/黑麥6RL/6BS易位系 TAM104R平展的第二葉上，10分鐘后用滅菌超純水噴施葉面，覆保鮮膜保濕24小時，之后 轉(zhuǎn)為22°C正常條件培養(yǎng)，得到轉(zhuǎn)BSMV:ScRGA-6RL2植株。將小麥/黑麥6RL/6BS易位系 TAM104R接種BSMV病毒空載體溶液，得到轉(zhuǎn)BSMV植株作為陰性對照（CK)，將小麥/黑麥 6RL/6BS易位系TAM104R涂抹IXGKP(buffer模擬接種），得到Mock植株作為空白對照 (Mock)。
[0080] 3、病毒誘導ScRGA-6RL2基因沉默的RT-PCR驗證
[0081] BSMV-VIGS系統(tǒng)沉默ScRGA-6RL2基因效果的具體檢測方法如下所述：
[0082] 將步驟2獲得的轉(zhuǎn)BSMV:ScRGA-6RL2植株、轉(zhuǎn)BSMV植株及Mock植株正常條件 下培養(yǎng)10天后，取第三葉按照實施例1中的方法提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄后通過定量PCR檢測 ScRGA-6RL2基因的表達。設(shè)置Actin為內(nèi)參。
[0083] 檢測檢測ScRGA_6RL2的引物如下：
[0084] ScRGA-6RL2-Q-F:5'-ATGAAGAGGCTCCCTACATG-3' ；
[0085] ScRGA-6RL2-Q-R:5' -CTAATCTCCGCAGAAGGCAT-3'。
[0086] 檢測Actin的引物如下：
[0087] Actin-F: 5,-CAACGAGCTCCGTGTCGCA-3，；
[0088] Actin-R: 5'-GAGGAAGCGTGTATCCCTCATAG-3'。
[0089] ScRGA_6RL2基因的相對表達量的檢測結(jié)果如圖2所示。
[0090] 圖 2 中，MOCK為Mock植株；CK為轉(zhuǎn)BSMV植株；BSMV:ScRGA-6RL2 為轉(zhuǎn) BSMV:ScRGA-6RL2 植株。
[0091] 圖2表明，與轉(zhuǎn)BSMV植株以及Mock植株相比，轉(zhuǎn)BSMV:ScRGA-6RL2植株的 ScRGA_6RL2轉(zhuǎn)錄水平顯著下降。（圖中的相對表達量通過AACt法計算得到，ABI7500型 熒光定量PCR儀自帶計算公式）。
[0092] 4、小麥葉片白粉病菌接種及觀察
[0093] 以上接種成功的材料10天后，在轉(zhuǎn)BSMV:ScRGA-6RL2植株和轉(zhuǎn)BSMV植株上可以 觀察到明顯的病毒斑。
[0094] Mock植株、轉(zhuǎn)BSMV植株以及轉(zhuǎn)BSMV:ScRGA-6RL2植株在第四葉平展后（約16天） 接種白粉病菌系E18,接種14天后觀察第四葉發(fā)病情況。結(jié)果沒有接種病毒的Mock植株 的葉片產(chǎn)生過敏性壞死斑，表現(xiàn)典型的過敏反應(yīng)（HR)，反應(yīng)型為0;級。轉(zhuǎn)BSMV植株的葉 片除了產(chǎn)生退綠病毒條斑外，也出現(xiàn)了HR反應(yīng)。相反，ScRGA-6RL2基因沉默效果明顯的轉(zhuǎn) BSMV:ScRGA-6RL2植株的HR反應(yīng)喪失，出現(xiàn)明顯的白粉病孢子堆，反應(yīng)型為3-4級，結(jié)果如 圖3所示。
[0095] 圖 3 中，MOCK為Mock植株；CK為轉(zhuǎn)BSMV植株；BSMV:ScRGA-6RL2 為轉(zhuǎn) BSMV:ScRGA-6RL2 植株。
[0096] 以上結(jié)果表明，ScRGA-6RL2基因表達量的降低使得小麥/黑麥6RL/6BS易位系 TAM104R對白粉病菌系E18由抗病轉(zhuǎn)為感病，說明ScRGA-6RL2基因是TAM104R抗白粉病過 程中的一個重要基因。
[0097] 三、利用表皮細胞瞬時表達驗證ScRGA_6RL2的功能
[0098] 小麥抗白粉病功能的發(fā)揮是單細胞的自主行為，并且白粉病菌只侵染寄主葉片的 表皮細胞。因此，表皮細胞瞬時表達是驗證小麥抗白粉病基因功能的一項有效技術(shù)。將目 標基因通過基因槍隨機導入到離體小麥葉