Gprasp2突變型基因、其鑒定方法和檢測試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于遺傳學(xué)、分子生物學(xué)，具體涉及遺傳性疾病致病基因的鑒定方法，特別 涉及GPRASP2突變型基因、其鑒定方法和檢測試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 耳聾是導(dǎo)致交流障礙最常見的疾病，至2013年為止，在全球約有3. 6億人患有耳 聾[1]，其中約有50%的患者發(fā)病與遺傳有關(guān)。遺傳性耳聾可分為綜合征型耳聾（Syndromic Hearing Loss，SHL)和非綜合征型耳聾（Non-syndromic Hearing Loss，NSHL)，其中 SHL約 占30%，其臨床表型除了耳聾外，還有眼、骨腎、皮膚等其他病變。迄今為止約有300種SHL， 其中約有70種為X連鎖遺傳的SHL [h]。雖然在世界范圍內(nèi)不斷有新的SHL大家系被定位 及新的致病基因被發(fā)現(xiàn)，但新的X連鎖遺傳的SHL大家系甚少被定位。并且由于聽覺系統(tǒng) 結(jié)構(gòu)、功能的復(fù)雜性，涉及聽覺相關(guān)的基因種類和數(shù)量多，至今定位與克隆的SHL基因與預(yù) 期的還相距甚遠(yuǎn)。
[0003] 在包括連鎖分析和純合子定位在內(nèi)的傳統(tǒng)的疾病基因檢測方法中[4' 5]，利用遺傳 標(biāo)記來發(fā)現(xiàn)基因組區(qū)域，然后在基因組區(qū)域中通過原位克隆以及對候選基因的研宄來發(fā)現(xiàn) 致病突變。而在對耳聾基因的檢測和定位過程中，由于該疾病所表現(xiàn)出的的極端異質(zhì)性使 得該過程變得更加繁瑣。隨著高通量測序（High-Throughput Sequencing)技術(shù)的引入以 及外顯子組測序（Exome sequencing)的發(fā)展，基于其高通量，低成本和高準(zhǔn)確率的特點(diǎn)，在 遺傳性疾病基因檢測中得到了廣泛應(yīng)用，已有一系列高水平的相關(guān)外顯子組測序用于遺傳 性疾病的基因研宄的報道 [6<。
[0004] 發(fā)明人采集到一個罕見的呈典型的X染色體隱性遺傳的先天性SHL大家系，該家 系患者的臨床特征除了耳聾外，還伴有耳廓及外耳道畸形、小眼以及雙眼瞼下垂等為特征 的面部畸形，研宄排除了已知的常染色體顯性遺傳性耳聾致病基因與家系耳聾表型的相關(guān) 性，結(jié)合孟德爾遺傳方式分析，認(rèn)為該家系是一個新的呈X連鎖遺傳的SHL，并且是由一個 新的基因致病。如果采用傳統(tǒng)的單基因遺傳性疾病基因的定位方法，由于連鎖區(qū)域?qū)⑸婕?已知基因、未知基因和預(yù)測基因，這將是一個耗時費(fèi)力的過程。因此，外顯子組測序技術(shù)結(jié) 合生物信息學(xué)分析、候選致聾基因新突變致病性分析等實現(xiàn)對耳聾性基因的鑒定。
[0005] 參考文獻(xiàn)
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【發(fā)明內(nèi)容】

[0014] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種GPRASP2突變型基因。
[0015] 本發(fā)明還要解決的技術(shù)問題是提供上述突變型基因的鑒定方法。
[0016] 本發(fā)明最后要解決的技術(shù)問題是提供檢測上述突變型基因的檢測試劑盒。
[0017] 針對上述問題，發(fā)明人首先采用人基因組外顯子捕獲與高通量測序技術(shù)獲得候選 SHL相關(guān)基因的突變位點(diǎn)，再結(jié)合常規(guī)測序的方法對候選基因突變位點(diǎn)逐一進(jìn)行遺傳共分 離驗證、外顯子以及外顯子-內(nèi)含子邊界的序列比對與分析，最終找到了一個SHL相關(guān)的新 基因。由此可見，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)致病基因的方法高效、快捷和準(zhǔn)確度高，同時僅需對部分家系 成員的樣本進(jìn)行外顯子捕獲測序，大大降低了成本。
[0018] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：
[0019] 一種GPRASP2突變型基因，其在人的GPRASP2基因（NM_001004051. 3)序列的第5 外顯子編碼區(qū)第1717~1718位核苷酸GC突變成為核苷酸AA(c. 1717-1718GC > AA)。
[0020] 其中，突變后的人的GPRASP2基因序列的第5外顯子區(qū)，其核苷酸序列如SEQ IDNo:5 所示。
[0021] 一種重組載體，其含有上述的GPRASP2突變型基因。
[0022] -種重組細(xì)胞，其含有上述的重組載體。
[0023] 一種綜合征型耳聾（SHL)檢測試劑盒，其至少包括：根據(jù)GPRASP2基因所有5個外 顯子及其外顯子-內(nèi)含子交界區(qū)序列設(shè)計的PCR引物；所述PCR引物用于PCR擴(kuò)增，其擴(kuò)增 產(chǎn)物包含GPRASP2基因第5外顯子區(qū)的核苷酸序列；
[0024] 所述的PCR引物序列為如下引物對中的至少一對：SEQ ID No:6和SEQ ID No:7、 SEQ ID No:8 和 SEQ ID No:9、SEQ ID No: 10 和 SEQ ID No: 11、SEQ ID No: 12 和 SEQ ID No: 13、SEQ ID No:14 和 SEQ ID No:15、SEQ ID No:16 和 SEQ ID No:17;
[0025] 其中，引物SEQ ID No: 12和SEQ ID No: 13其擴(kuò)增產(chǎn)物為GPRASP2基因第5外顯 子編碼區(qū)第1-744位核苷酸序列；SEQ ID No: 14和SEQ ID No: 15其擴(kuò)增產(chǎn)物為GPRASP2基 因第5外顯子編碼區(qū)第689-1879位核苷酸序列；SEQ ID No: 16和SEQ ID No: 17其擴(kuò)增產(chǎn) 物為GPRASP2基因第5外顯子編碼區(qū)第1857-2517位核苷酸序列。
[0026] 其中，所述編碼區(qū)是從SEQ ID No:5中第334位的atg開始起始，到第2850位的 taa處終止。
[0027] 其中，上述綜合征型耳聾（SHL)檢測試劑盒還包括用于PCR的DNA擴(kuò)增酶和相應(yīng) 緩沖液。
[0028] -種遺傳性疾病的相關(guān)基因的鑒定方法，包括以下步驟：
[0029] 1)利用人X染色體外顯子組捕獲和高通量測序技術(shù)對采集的綜合征型耳聾（SHL) 家系的患者以及正常個體X染色體外顯子組捕獲和分析，獲得候選的遺傳性疾病相關(guān)基因 的突變位點(diǎn)；
[0030] 2)結(jié)合常規(guī)的測序方法對候選的遺傳性疾病相關(guān)基因的突變位點(diǎn)進(jìn)行鑒定：
[0031] 2A)家系內(nèi)未參與X染色體外顯子組捕獲的其余樣本進(jìn)行遺傳共分離驗證；
[0032] 2B)對步驟2A)驗證基因的外顯子及外顯子-內(nèi)含子交界區(qū)的序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增 和檢測；
[0033] 2C)擴(kuò)大樣本量驗證，以此鑒定遺傳性疾病的相關(guān)基因。
[0034] 本發(fā)明中，所述遺傳性疾病是指生殖細(xì)胞或受精卵的遺傳物質(zhì)（染色體和基因） 發(fā)生突變（或畸變）所引起的疾病，通常具有垂直傳遞的特征，具有以上特征的家族成員及 其關(guān)系稱為遺傳性疾病家系。
[0035] 本發(fā)明中，DNA樣本來自于組織、血液或各種體液等。
[0036] 上述GPRASP2突變型基因、或試劑盒在制備綜合征型耳聾（SHL)檢測試劑中的應(yīng) 用。
[0037] -種鑒定GPRASP2突變型基因的方法，其包括以下步驟：
[0038] 1)測定待測樣本中GPRASP2基因中外顯子和外顯子-內(nèi)含子交界區(qū)序列；
[0039]2)與野生型相比較，如果存在缺失、替換、插入則認(rèn)定該基因存在突變；
[0040] 步驟1)中，采用如下引物中的至少一對分別擴(kuò)增外顯子或外顯子-內(nèi)含子交界區(qū) 的序列：SEQ ID No:6 和 SEQ ID No:7、SEQ ID No:8 和 SEQ ID No:9、SEQ ID No:l(^PSEQ IDNo:ll、SEQIDNo:12*SEQIDNo:13、SEQIDNo:14*SEQIDNo:15、SEQIDNo:16 和 SEQ ID No:17;
[0041] 上述鑒定GPRASP2突變型基因的方法，具體來說包括以下步驟：
[0042] 1)測定待測樣品中GPRASP2基因第5外顯子區(qū)的序列；
[0043] 2)GPRASP2基因第5外顯子編碼區(qū)第1717-1718位核苷酸GC，則所述的綜合征型 耳聾（SHL)相關(guān)基因為野生型；GPRASP2基因第5外顯子的上述對應(yīng)位置突變?yōu)楹塑账酇A， 則所述的綜合征型耳聾（SHL)相關(guān)基因為突變型。
[0044] 步驟1)中，GPRASP2基因第5外顯子編碼區(qū)的第1717-1718位核苷酸GC的核苷 酸序列的測定采用？〇?的方法，所述？〇?引物序列如3￡0 10勵：14與3￡0 10勵：15所示。
[0045] 有益效果：本發(fā)明利用人X染色體外顯子組捕獲和高通量測序技術(shù)發(fā)現(xiàn)遺傳性疾 病的相關(guān)基因。該方法方便、便捷，而且由于只需取一個或少量的個體樣本進(jìn)行X染色體外 顯子組捕獲，大大降低了成本?；谏鲜龇椒?，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了一種SHL相關(guān)基因GPRASP2,該 基因編碼的G蛋白偶聯(lián)受體相關(guān)蛋白，這是首次發(fā)現(xiàn)該基因及其突變型與SHL的發(fā)生相關(guān)。 該基因的鑒定對SHL的易感和發(fā)生人群的基因診斷具有重要價值，對探索SHL致病機(jī)制和 開辟新的治療途徑具有重要意義。
【附圖說明】
[0046] 圖1 SHL相關(guān)基因突變位點(diǎn)的篩選與驗證流程圖。
[0047] 圖2該SHL家系參與X染色體外顯子組捕獲及測序的2例耳聾患者的典型聽力圖 (圖2-A :患者-1，男，57歲，右側(cè)外耳道閉鎖，左側(cè)外耳道過度狹窄，純音測聽示雙耳不對稱 的混合性聽力損失；圖2-B:患者-2,男，41歲，雙側(cè)外耳道閉鎖，純音測聽示雙耳對稱的混 合性聽力損失。
[0048] 圖3 GPRASP2基因第5外顯子編碼區(qū)1717-1718位及其側(cè)翼序列（參見SEQ ID N0:5)的測序結(jié)果（圖3-A:SHL家系內(nèi)男性患者，GPRASP2基因第5外顯子編碼區(qū)存在 c. 1717-1718GOAA半合子突變；圖3-B :SHL家系內(nèi)女性攜帶者，GPRASP2基因第5外顯子 編碼區(qū)存在c. 1717-1718GOAA雜合子突變；圖3-C :聽力正常人，測序圖無突變現(xiàn)象）。
【具體實施方式】