擬態(tài)弧菌ta系統(tǒng)毒素蛋白及其編碼基因和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】：
[0001] 本發(fā)明屬于微生物基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種擬態(tài)弧菌（Vibriomimicus)TA系 統(tǒng)毒素蛋白及其編碼基因和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】：
[0002] 毒素-抗毒素（toxin-antitoxin,TA)系統(tǒng)最初發(fā)現(xiàn)于一些低拷貝質(zhì)粒中，它們是 一對(duì)密切相關(guān)的基因組合，其中一個(gè)編碼穩(wěn)定的毒素，另一個(gè)編碼不太穩(wěn)定的抗毒素（王 曉蕾等，2008)。當(dāng)細(xì)菌細(xì)胞分裂時(shí)，如果子代細(xì)胞丟失此質(zhì)粒，不太穩(wěn)定的抗毒素很快降 解，而穩(wěn)定的毒素則發(fā)揮毒性殺死細(xì)胞，這種效應(yīng)被稱作分裂后致死效應(yīng)，質(zhì)粒借此得以在 宿主中穩(wěn)定存在（Jump等，2001)。隨著生物測(cè)序技術(shù)及生物信息學(xué)分析技術(shù)的發(fā)展，至 2008年已經(jīng)在測(cè)序的原核生物中發(fā)現(xiàn)671個(gè)TA系統(tǒng)位點(diǎn)，分布于126個(gè)物種中，它們隸屬 于7個(gè)經(jīng)典的TA基因家族。（王曉蕾等，2008)。TA系統(tǒng)并不局限于細(xì)菌質(zhì)粒中，也存在于 細(xì)菌染色體的一些潛在的移動(dòng)遺傳元件上（Ghafourian等，2013)。
[0003] 近年來(lái)，微生物學(xué)家開(kāi)始在生物研宄中應(yīng)用細(xì)菌的TA系統(tǒng)作為工具，來(lái)自于TA系 統(tǒng)的致死基因常用作載體的選擇標(biāo)記（Ghafourian等，2013)。其中以致死基因ccdB、sacB 應(yīng)用最為廣泛?？寺』蚱问欠肿由飳W(xué)最常規(guī)的操作，進(jìn)行微生物的基因缺失突變是 微生物分子生物學(xué)最常見(jiàn)的研宄基因功能的手段。ccdB常用于制作克隆載體或基于基因 缺失目的用于反向選擇的標(biāo)記（如：Bernard等，1996 ;Mondon等2000 ;Traore等，2011); sacB則常用于構(gòu)建自殺載體，便于同源重組子的反向篩選（Kaniga等，1991 ;Philippe等， 2004 ;Qu6n6e等，2005)。Invitrogen公司基于ccdB基因構(gòu)建了一系列用于克隆的商業(yè)化 載體，用于提高陽(yáng)性克隆篩選的效率等目的（賈丼等，2009)。然而在實(shí)際應(yīng)用中，我們發(fā) 現(xiàn)含有ccdB源質(zhì)粒的大腸桿菌在IPTG誘導(dǎo)的情況下，平板上仍然會(huì)有一些克隆長(zhǎng)出，表 明ccdB的毒性并非足夠強(qiáng)烈到殺死所有的大腸桿菌細(xì)胞或者細(xì)菌細(xì)胞容易針對(duì)ccdB的 靶位點(diǎn)進(jìn)行自我修飾；此外還發(fā)現(xiàn)：當(dāng)ccdB源的自殺載體發(fā)生第一次同源重組整合至弧菌 基因組時(shí)，在IPTG誘導(dǎo)的情況下則完全不能發(fā)揮殺死弧菌細(xì)胞的作用，這表明ccdB表達(dá) 產(chǎn)物的毒性具有宿主特異性。來(lái)源于芽孢桿菌的sacB致死基因表達(dá)后會(huì)代謝蔗糖并產(chǎn)生 對(duì)多數(shù)革蘭氏陰性菌致死的代謝產(chǎn)物（Gay等，1985)，然而后來(lái)發(fā)現(xiàn)在基于sacB自殺質(zhì)粒 的同源重組中，一些細(xì)菌對(duì)于蔗糖代謝產(chǎn)物并不敏感，導(dǎo)致缺失突變株的篩選并不容易成 功（Milton等，1996);此外，sacB容易發(fā)生自發(fā)點(diǎn)突變，造成篩選時(shí)大量假陽(yáng)性克隆的出現(xiàn) (Blomfield等，2006)。
[0004] 綜合上述，迫切需要發(fā)掘微生物遺傳資源，篩選出新的具有廣泛適用性和足夠強(qiáng) 烈毒性的致死基因，并應(yīng)用于克隆載體或自殺載體，新的微生物致死基因的應(yīng)用將大大提 高目的片段陽(yáng)性克隆的效率或篩選缺失突變體的效率。

【發(fā)明內(nèi)容】
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[0005] 本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種擬態(tài)弧菌TA系統(tǒng)毒素蛋白及其編碼基因。
[0006] 本發(fā)明的擬態(tài)弧菌TA系統(tǒng)毒素蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQIDNo. 2 所示。
[0007] 本發(fā)明的編碼擬態(tài)弧菌TA系統(tǒng)毒素蛋白的基因，其特征在于，編碼氨基酸序列如 SEQIDNo. 2所示的擬態(tài)弧菌TA系統(tǒng)毒素蛋白。
[0008] 編碼擬態(tài)弧菌TA系統(tǒng)毒素蛋白的基因，優(yōu)選，其核苷酸序列如SEQIDNo. 1所示。 [0009] 本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種表達(dá)載體，其特征在于，含有上述編碼擬態(tài)弧菌 TA系統(tǒng)毒素蛋白的基因。
[0010] 所述的表達(dá)載體，優(yōu)選為嚴(yán)謹(jǐn)控制型表達(dá)載體PBAD30。長(zhǎng)期以來(lái)缺乏既能在大腸 桿菌內(nèi)進(jìn)行遺傳操作并復(fù)制，又能在弧菌等海洋細(xì)菌中穩(wěn)定保存的穿梭表達(dá)載體。本發(fā)明 通過(guò)實(shí)驗(yàn)手段證實(shí)了PBAD30是一種穿梭能力強(qiáng)的表達(dá)載體，且能方便地對(duì)插入基因進(jìn)行 開(kāi)啟和關(guān)閉。
[0011] 本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種含有上述表達(dá)載體的微生物。
[0012] 本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供編碼擬態(tài)弧菌TA系統(tǒng)毒素蛋白的基因在構(gòu)建克隆載 體和自殺載體中的應(yīng)用。
[0013] 本發(fā)明首先在擬態(tài)弧菌LP177的基因組survey中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)具有潛在移動(dòng)能力 的基因島GIVmi573,在進(jìn)一步對(duì)GIVmi573進(jìn)行生物信息學(xué)解析時(shí)發(fā)現(xiàn)一對(duì)基因vmi480/ Vmi470,其疑似TA系統(tǒng)。為了驗(yàn)證其功能，本發(fā)明通過(guò)基因缺失方法驗(yàn)證vmi480功能，該 方法主要采用A同源重組的方式對(duì)vmi480及功能相關(guān)基因vmi470進(jìn)行敲除，首先分別構(gòu) 建Avmi48〇-470、Avmi480、Avmi470缺失突變株，再構(gòu)建pBAD3〇-vmi480表達(dá)載體，將此 表達(dá)載體成功電轉(zhuǎn)入大腸桿菌、野生海洋細(xì)菌溶藻弧菌E001和海藻施萬(wàn)氏菌E114，并在其 中操控表達(dá)，以此確定其對(duì)于弧菌、海藻施萬(wàn)氏菌以及大腸桿菌等具有強(qiáng)烈的致死作用。
[0014] 本發(fā)明首次在擬態(tài)弧菌中發(fā)現(xiàn)了TA系統(tǒng)的存在，并通過(guò)實(shí)驗(yàn)手段證實(shí)了TA系統(tǒng) 中關(guān)鍵毒素基因vmi480的功能，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明vmi480是一種新型的毒素基因，該基因的產(chǎn) 物對(duì)細(xì)菌細(xì)胞具有強(qiáng)烈的致死作用，且毒性作用范圍廣泛，因此可以替代目前應(yīng)用廣泛但 假陽(yáng)性較嚴(yán)重的致死基因ccdB、sacB等。在實(shí)際應(yīng)用中只需要將vmi480替換以往克隆載 體中使用的ccdB基因（如：Invitrogen公司的系列Gateway?'載體）等毒素基因即可，或 用于替代自殺載體中用于反向選擇的毒素基因，如：sacB(如：Qu6n6e等，2005)。將vmi480 應(yīng)用于克隆載體和自殺載體的構(gòu)建將大大提高陽(yáng)性重組子的篩選效率，減少實(shí)驗(yàn)室的工作 量。鑒于基因克隆以及基因功能研宄的廣泛性，vmi480將有廣闊的應(yīng)用前景并產(chǎn)生可觀的 經(jīng)濟(jì)價(jià)值。
[0015] 本發(fā)明的擬態(tài)弧菌（Vibriomimicus)LP177為發(fā)明人所在實(shí)驗(yàn)室保藏，本申請(qǐng)人 保證自申請(qǐng)日起20年內(nèi)向公眾提供該擬態(tài)弧菌（Vibriomimicus)LP177。
【附圖說(shuō)明】：
[0016] 圖1是毒素基因vmi480所在操縱子結(jié)構(gòu)示意圖，其中P代表啟動(dòng)子區(qū)；
[0017] 圖2是與毒素基因vmi480相關(guān)的基因vmi470編碼蛋白保守結(jié)構(gòu)域，其中黑色三 角形代表Vmi470與抗毒素蛋白HipB在保守結(jié)構(gòu)域基序中共有的氨基酸殘基位點(diǎn)；
[0018] 圖3是毒素基因vmi480編碼蛋白的Blastx比對(duì)結(jié)果圖；
[0019] 圖4是毒素基因vmi480在不同細(xì)菌中的嚴(yán)謹(jǐn)控制表達(dá)，其中1A，1B，1C分別代表 大腸桿菌NEB5a(pBAD30-vmi480)在LB平板A，B，C生長(zhǎng)情況；2A，2B，2C分別代表溶藻弧 菌E0601 (pBAD30-vmi480)在LB平板A，B，C生長(zhǎng)情況；3A，3B，3C分別代表海藻施萬(wàn)氏菌 E114(pBAD30-vmi480)在LB平板A，B，C生長(zhǎng)情況。
【具體實(shí)施方式】：
[0020] 以下實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步說(shuō)明，而不是對(duì)本發(fā)明的限制。下列實(shí)施例中未 注明具體實(shí)驗(yàn)條件和方法的均為采用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。
[0021] 以下實(shí)施例中所涉及的材料及來(lái)源如下：
[0022] 擬態(tài)弧菌LP177為本實(shí)驗(yàn)室保存菌株，pBAD30、pKD46、pKD4、pCP20、pVCR94質(zhì)粒 及其宿主大腸桿菌NEB5a、大腸桿菌MG1655由加拿大舍布魯克大學(xué)饋贈(zèng)。EcoRI、XbaI、 T4DNA連接、ThempolTaq聚合酶、pfu高保真酶、Q5高保真酶、PCR產(chǎn)物純化試劑盒、質(zhì)粒提 取試劑盒購(gòu)自NEB公司。LB培養(yǎng)基購(gòu)自Amersco公司。腦心浸液培養(yǎng)基購(gòu)自BD公司。
[0023] 實(shí)施例1 :
[0024] 1、擬態(tài)弧菌LP177基因組測(cè)序、注釋及vmi480基因發(fā)現(xiàn)
[0025] 傳統(tǒng)酚/氯仿法提取擬態(tài)弧菌LP177基因組DNA，DNA送交華大基因（深圳）進(jìn)行 Illumina平臺(tái)測(cè)序，測(cè)序共獲得127個(gè)scaffold序列。序列遞交在線RAST微生物基因組注 釋工具（ http://rast.nmpdr.org/)進(jìn)行注釋。在對(duì)注釋結(jié)果進(jìn)行分析時(shí)，發(fā)現(xiàn)scaffold7 序列存在一個(gè)完整的疑似可移動(dòng)的小型基因島，命名MGIVmi-1。
[0026] 對(duì)MGIVmi-1詳細(xì)分析發(fā)現(xiàn)，該小型基因島具備左右二端相同的att位點(diǎn)、整合酶 基因int，剪切酶基因xis，參與識(shí)別轉(zhuǎn)移起始位點(diǎn)（oriT)的基因mobl以及在整合性結(jié)合 元件（ICE)中常見(jiàn)的限制性修飾系統(tǒng)（RM)。其它多數(shù)基因功能未知，基因vmi480與vmi470 緊密相鄰，位于同一操縱子上（如圖1所示）。
[0027] Blastx(http://blast, ncbi. nlm. nih. gov/Blast. cgi?CMD=ffeb&PAGE_TYPE= BlastHome)搜索發(fā)現(xiàn)Vmi470屬于可以與DNA結(jié)合的XRE蛋白家族成員，大腸桿菌TA系統(tǒng) 的hipB抗毒素蛋白與Vmi470相似性非常低（小于30%)，但是二者同屬XRE家族，具有相 同的關(guān)鍵基序的殘基（如圖2所示），因此推測(cè)二者具有類似的功能。Blastx搜索未得到 vmi480潛在功能的任何預(yù)測(cè)結(jié)果，提示這是一個(gè)功能未知的新基因（如圖3所示）。
[0028]vmi480基因DNA序列如SEQIDNO. 1所示，vmi480編碼氨基酸序列如SEQIDN0. 2 所示。
[0029] 2、擬態(tài)弧菌LP177基因vmi48