GGCAGAATGGAGCCCATC CGG P2: CCAGCTGCAGCCAAGAGCCACCGGATGGGCTCCATTCTGCCCCGTCCATTGAAGTAGTGA P3: GCAGAATGGAGCCCATCCGGTGGCTCTTGGCTGCAGCTGGAGTGGAGTTTGAAGAGAAAT P4: ATCTTCTGCAGATCCTATAAATTTCTCTTCAAACTCCACTCCAGCTGCAGCCAAGAGCCA P5:AGTGGAGTTTGAAGAGAAATTTATAGGATCTGCAGAAGATTTGGGAAAGTTAAGAAATGA P6:GCTGGAACATCAAACTCCCATCATTTCTTAACTTTCCCAAATCTTCTGCAGATCCTATAA P7:TTGGGAAAGTTAAGAAATGATGGGAGTTTGATGTTCCAGCAAGTACCAATGGTTGAGATT P8:TGTACCAACTTCATCCCATCAATCTCAACCATTGGTACTTGCTGGAACATCAAACTCCCA P9:TGGGAGTTTGATGTTCCAGCAAGTACCAATGGTTGAGATTGATGGGATGAAGTTGGTACA P10:AGTTGAGAATGGCTCTGGTCTGTACCAACTTCATCCCATCAATCTCAACCATTGGTACTT P11:GATGGGATGAAGTTGGTACAGACCAGAGCCATTCTCAACTACATTGCCAGCAAATACAAC P12:TTTATGTCTTTCCCGTAGAGGTTGTATTTGCTGGCAATGTAGTTGAGAATGGCTCTGGTC P13:ACATTGCCAGCAAATACAACCTCTACGGGAAAGACATAAAGGAGAGAGCCCTAATTGATA P14:TGCCATACCTTCTGTATACATATCAATTAGGGCTCTCTCCTTTATGTCTTTCCCGTAGAG P15:GGAGAGAGCCCTAATTGATATGTATACAGAAGGTATGGCAGATTTGAATGAAATGATCCT P16:GTCGACATAAGGGCAGAAGAAGGATCATTTCATTCAAATCTGCCATACCTTCTGTATACA P17:GATTTGAATGAAATGATCCTTCTTCTGCCCTTATGTCGACCTGAGGAAAAAGATGCCAA P18:TTCTCTTTGATCAAGGCAATCTTGGCATCTTTTTCCTCAGGTCGACATAAGGGCAGAAGA P19:CTGAGGAAAAAGATGCCAAGATTGCCTTGATCAAAGAGAAAACAAAAAGTCGCTATTTCC P20:TAACACTTTTTCGAAGGCAGGGAAATAGCGACTTTTTGTTTTCTCTTTGATCAAGGCAAT P21:AACAAAAAGTCGCTATTTCCCTGCCTTCGAAAAAGTGTTACAGAGCCATGGACAAGACTA P22:TCAGCTTGTTGCCAACAAGGTAGTCTTGTCCATGGCTCTGTAACACTTTTTCGAAGGCAG P23:CAGAGCCATGGACAAGACTACCTTGTTGGCAACAAGCTGAGCCGGGCTGACATTAGCCTG P24:ACATAGTAGAGAAGTTCCACCAGGCTAATGTCAGCCCGGCTCAGCTTGTTGCCAACAAGG P25:GCCGGGCTGACATTAGCCTGGTGGAACTTCTCTACTATGTGGAAGAGCTTGACTCCAGCC P26:CAGAGGGAAGTTGGAGATAAGGCTGGAGTCAAGCTCTTCCACATAGTAGAGAAGTTCCAC P27:GGAAGAGCTTGACTCCAGCCTTATCTCCAACTTCCCTCTGCTGAAGGCCCTGAAAACCAG P28:CCGTGGGCAGGTTGCTGATTCTGGTTTTCAGGGCCTTCAGCAGAGGGAAGTTGGAGATAA P29:CTGAAGGCCCTGAAAACCAGAATCAGCAACCTGCCCACGGTGAAGAAGTTTCTACAGCCT P30:GGAGGCTTCCTTGGGCTGCCAGGCTGTAGAAACTTCTTCACCGTGGGCAGGTTGCTGATT P31:TGAAGAAGTTTCTACAGCCTGGCAGCCCAAGGAAGCCTCCCGCAGATGCAAAAGCTTTAG P32:AAGAGCTCCTGAAAATCTTTCTGGCTTCTTCTAAAGCTTTTGCATCTGCGGGAGGCTTCCTTGGGCTG CC PCR反應(yīng)體系：10XPCRbuffer5.0yl;dNTPs(各2.5mM)4yl;內(nèi)側(cè)引物（P2-P31) 的添加量為10ng，外側(cè)引物（Pl，P32)添加量為100ng;KODFXtaq0. 4yl(預(yù)變性后 加入）；加無(wú)菌水定容至50y1。
[0023]PCR反應(yīng)程序：94°C預(yù)熱 10min;94 °C，30s;54 °C，30s;72 °C，40s;35 個(gè)循環(huán)；最后72 °C延伸10min。
[0024](二）試驗(yàn)結(jié)果： 經(jīng)過(guò)1. 0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物為一條約700bp的片段（圖1)。
[0025] 實(shí)施例2 克隆鑒定、序列測(cè)定 (一）試驗(yàn)方法： 擴(kuò)增片段采用愛(ài)思進(jìn)生物技術(shù)(杭州）有限公司DNA瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收后，克 隆到大連寶生物工程有限公司的pMD-18-Simple T載體上進(jìn)行克隆鑒定和序列測(cè)定。
[0026] 本發(fā)明通過(guò)核苷酸序列測(cè)定分析，最終獲得人抗逆相關(guān)基因HsGSTA3基因，其堿 基和氨基酸序列信息如SEQIDNo1和SEQIDNo2所示。
[0027](二）試驗(yàn)結(jié)果： 測(cè)序分析結(jié)果顯示：人抗逆相關(guān)基因HsGSTA3編碼閱讀框長(zhǎng)669bp，編碼的蛋白質(zhì)含 222個(gè)氨基酸。
[0028] 實(shí)施例3 HsGSTA3基因超量表達(dá)載體的構(gòu)建 將實(shí)施例2中測(cè)序鑒定正確的含有序列表SEQIDNo1所示核苷酸的DNA片段用及洲1 和5^1進(jìn)行雙酶切，回收純化后與含有雙35S啟動(dòng)子和N0S終止子的pYPX245(Genbank: AY78049. 1)質(zhì)粒連接，酶切鑒定和序列測(cè)定表明含有谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶基因的植物表達(dá) 單元，將該表達(dá)單元插入植物表達(dá)載體pCambial301，構(gòu)建擬南芥谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶的植 物表達(dá)載體pCAM:HsGSTA3。該表達(dá)載體還包含⑶S報(bào)告基因和帶內(nèi)含子潮霉素抗性標(biāo)記 基因。
[0029] 實(shí)施例4 擬南芥的遺傳轉(zhuǎn)化 (一）試驗(yàn)方法： 將實(shí)施例3構(gòu)建的擬南芥谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶的植物表達(dá)載體pCAM:HsGSTA3用蘸花 法轉(zhuǎn)化擬南芥，具體方法如下： 1.農(nóng)桿菌的準(zhǔn)備： 1)將pCAM: HsGSTA3用電擊法轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌GV3101，或EHA105,或LBA4404菌株(Biovector Co.，LTD)，得到含有pCAM: HsGSTA3的重組農(nóng)桿菌，并涂布于含有卡那霉素抗 性的平板篩選轉(zhuǎn)化子。
[0030] 2)挑取農(nóng)桿菌單菌接種于5mLLB液體培養(yǎng)基(利福平50yg/mL，氯霉素100 yg/mL)中，28 °C，250rpm培養(yǎng) 20h。
[0031] 3)取1mL菌液轉(zhuǎn)接入20-30mLLB液體培養(yǎng)基(利福平50yg/mL，氯霉素100 yg/mL)中，28 °C，250rpm培養(yǎng)約 12h，測(cè) 0D600 ~ 1.5。
[0032] 4) 8000rpm，4 °C，10min離心收集菌體，重懸于農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化滲透液（5%鹿糖， 0.05%SilwetL-77)并稀釋至 0D600 ~ 0.8。
[0033] 2?擬南芥蘸花法轉(zhuǎn)化： 1)將擬南芥的花薹浸入滲透液中，輕輕攪動(dòng)約10S后取出，全部轉(zhuǎn)化完畢后，用保鮮袋 罩住擬南芥，以保持濕潤(rùn)環(huán)境，水平放置，22 °C避光培養(yǎng)，24h后去掉保鮮袋直立培養(yǎng)。
[0034] 2)初次轉(zhuǎn)化四天后，可再進(jìn)行一次轉(zhuǎn)化，重復(fù)兩次，總共轉(zhuǎn)化三次，這樣可以對(duì)花 序上發(fā)育的不同時(shí)期的花蕾進(jìn)行轉(zhuǎn)化，提高轉(zhuǎn)化效率。
[0035] 3)生長(zhǎng)約兩個(gè)月后，收集種子，4 °C冰箱儲(chǔ)存待用。
[0036](二）試驗(yàn)結(jié)果： 經(jīng)過(guò)蘸花法轉(zhuǎn)化的擬南芥生長(zhǎng)約兩個(gè)月后，正常開花結(jié)子。
[0037] 實(shí)施例5 擬南芥種子的篩選 (一）試驗(yàn)方法： 1)稱25-30mg種子放入1. 5ml離心管。
[0038] 2) 1ml75%乙醇消毒1min(不停搖晃振蕩)，8000rpm離心5s，去上清。
[0039] 3)加入1ml過(guò)濾后的漂白粉（2. 5%)消毒15min(不停搖晃振蕩，充分消毒)， 8000rpm離心5s，去上清。
[0040] 4)無(wú)菌水洗滌3-4次。
[0041] 5)將種子均勻的播撒到1/2 MS平板(潮霉素50 y g/mL)上，Parafilm膜封口，4 °〇冰箱放置兩天，22 °C，16 h光照培養(yǎng)10天。
[0042] 6)將抗性植株移栽到盆中培養(yǎng)，苗稍大后，進(jìn)行GUS活性檢測(cè)，選出陽(yáng)性植株（1\) 培養(yǎng)至開花結(jié)實(shí)，收集植株上所結(jié)T2種子。
[0043] 實(shí)施例6 抗逆相關(guān)基因HsGSTA3轉(zhuǎn)化植株后的抗逆分析 (一）試驗(yàn)方法： 將轉(zhuǎn)基因擬南芥自交純和一代，選取3個(gè)純合轉(zhuǎn)化株系，收取種子。播種后，幼苗生長(zhǎng) 10-20天，分別用NaCl、甘露醇處理，觀察植株的耐鹽，耐干旱效果。
[0044](二）試驗(yàn)結(jié)果： 結(jié)果表明：野生型和轉(zhuǎn)HsGSTA3基因擬南芥在存活率上有明顯的差異，轉(zhuǎn)基因植株比 野生型擬南芥抗鹽和干旱能力有明顯提高。經(jīng)過(guò)鹽、干旱處理的轉(zhuǎn)基因與野生型擬南芥的 存活率如表1所示。
[0045] 表1轉(zhuǎn)基因與野生型擬南芥的鹽、干旱處理后存活率
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 人谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶基因或其編碼的蛋白質(zhì)或多肽在提高植物抗逆性方面的用 途。
2. 如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述蛋白質(zhì)或多肽的序列如SEQIDNo2所 不O
3. 如權(quán)利要求2所述的用途，其特征在于，所述人谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶基因是編碼權(quán)利 要求2所述的蛋白質(zhì)或多肽的序列。
4. 如權(quán)利要求3所述的用途，其特征在于，所述人谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶基因的核苷酸序 列如SEQIDNo1所示。
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種人抗逆基因及其制備方法和用途。所述的人抗逆基因是HsGSTA3，其堿基序列如SEQ ID No1。其編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列如SEQ ID No2 所示。本發(fā)明利用PTDS技術(shù)人工合成HsGSTA3的基因序列，所獲得的GST基因能用于植物遺傳轉(zhuǎn)化，提高植物抗逆性。
【IPC分類】C12N15-54, A01H5-00, C12N9-10, C12N15-82
【公開號(hào)】CN104818259
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510129700
【發(fā)明人】許晶, 田永生, 邢曉娟, 姚泉洪, 彭日荷, 高建杰, 付曉燕, 韓紅娟
【申請(qǐng)人】上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【公開日】2015年8月5日
【申請(qǐng)日】2015年3月24日