為突出鏈（OS)，其基本上與雙鏈的同源鏈分離，變成單鏈。因此當(dāng)插入 區(qū)外的殘余雙鏈具有導(dǎo)致Tm低于環(huán)境溫度的長(zhǎng)度和序列的情況下，完整的雙鏈將解離產(chǎn) 生兩個(gè)單鏈末端（其可以結(jié)合末端引物）。
[0094] 大部分重組酶從寡核苷酸的5'區(qū)向其3'區(qū)聚合，一旦包被的寡核苷酸插入雙鏈， 則SIS繼續(xù)聚合到插入寡核苷酸的3'的雙鏈(下游)。插入系統(tǒng)的包被元件比未包被區(qū)結(jié) 合更緊密。還值得注意的是與模板（被重組酶包被）結(jié)合的引物不能被延伸，直至重組酶 去聚合（depolymerised)并被除去。
[0095] 作為上述觀察的結(jié)果，如果IO的模板雙鏈末端上游接近插入?yún)^(qū)，則所述末端將分 離，因?yàn)樗鼪](méi)有包被重組酶，引物可能結(jié)合并延伸置換10,這樣的話它可以被所述系統(tǒng)再次 使用。在相同情況下，下游末端將結(jié)合在一起，直至重組酶去聚合/脫離（falls off)(其 也是按照5'到3'方向）。如果下游末端的Tm比環(huán)境溫度更高，則其鏈甚至在重組酶去聚 合后仍然相連，但鏈仍將分離，因?yàn)樯嫌我镅由觳⒅脫Q初始雙鏈的鏈。這使得下游引物隨 后能夠結(jié)合和延伸（圖2)。
[0096] 如果上游末端不接近插入?yún)^(qū)但下游末端的相鄰足夠接近以允許熔解，則可以預(yù)料 下游末端將在重組酶去聚合后分離。意外的是情況不是這樣，因?yàn)楫?dāng)重組酶去聚合置換插 入的寡核苷酸、在其伴侶上重新定位突出鏈并重新形成初始雙鏈時(shí)，雙鏈的閉合上游末端 分枝迀移并且不給下游引物結(jié)合提供機(jī)會(huì)。在這種情況下，分枝迀移是快速的，因?yàn)橥怀鲦?仍然以具絞旋線的構(gòu)象圍繞復(fù)合物，即使被置換時(shí)仍與其同源鏈緊密相連。
[0097] 這些事件的后果是對(duì)于有效的系統(tǒng)來(lái)說(shuō)，SIS實(shí)現(xiàn)雙鏈分離，然后靶雙鏈的上游末 端必須在鏈插入事件期間分離。這通過(guò)確保鄰近插入位點(diǎn)的雙鏈上游區(qū)具有接近或低于環(huán) 境溫度的熔解溫度得以實(shí)現(xiàn)。這可以由技術(shù)人員使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)輕易確定，但受到系統(tǒng)成分 諸如單鏈結(jié)合蛋白、金屬離子濃度和鹽濃度的影響。
[0098] 因此，應(yīng)當(dāng)優(yōu)選的將IO設(shè)計(jì)為：其與靶分子互補(bǔ)，在同源區(qū)的任一邊只留下約 10-20個(gè)堿基，優(yōu)選的約15-17個(gè)堿基。因此，例如，當(dāng)所述應(yīng)用在40°C進(jìn)行時(shí)，給系統(tǒng)提供 不可延伸的10,這樣的話其在同源區(qū)的任一邊留下雙鏈的10-17個(gè)堿基。當(dāng)IO插入時(shí)，雙 鏈的上游末端（相對(duì)于插入寡核苷酸）熔解，而3'末端結(jié)合在一起，這歸因于重組酶在下 游雙鏈上的插入依賴性聚合。上游引物結(jié)合熔解的雙鏈上游末端并延伸，從而置換10。雙 鏈的下游末端可以通過(guò)上游引物的連續(xù)延伸而分離，或其足夠短以致當(dāng)重組酶去聚合時(shí)它 也發(fā)生熔解。
[0099] 上文方案描述了重組酶按5' -3'方向（上游到下游）聚合的結(jié)果。此處說(shuō)明描述 了利用這類重組酶的擴(kuò)增。當(dāng)使用按相反方向聚合的重組酶時(shí)，然后該系統(tǒng)的配置也是 顛倒的。大部分重組酶傾向于IO上游末端的12-15個(gè)堿基的區(qū)域以促進(jìn)重組酶的接種 (seeding)，可以包括這一特征，這樣的話IO包括上游非同源區(qū)。
[0100] 在上述方法中，盡管擴(kuò)增假象被降到最低，但是引物有可能在IO上非特異性拷 貝，并且這種延伸的產(chǎn)物可以被置換，如圖5所示在其他引物上拷貝。
[0101] 圖5顯示通過(guò)其引物假象可以在不包括下游元件的三部分系統(tǒng)中存在的機(jī)制。
[0102] 5A:誘導(dǎo)假象擴(kuò)增的系統(tǒng)成分包括上游引物（I)，中間寡核苷酸（II)和下游引物 (III) 5B:下游引物偶爾可以在中間寡聚物上拷貝。
[0103] 5C :任意其他的寡核苷酸引物可以在下游引物占據(jù)的位置上游的中間物上拷貝。
[0104] :其他寡核苷酸引物的延伸將導(dǎo)致下游引物延伸產(chǎn)物的置換。
[0105] 5E :最后，如果上游引物在置換的產(chǎn)物上拷貝，則可以產(chǎn)生可擴(kuò)增的單元。
[0106] 這些事件比那些涉及圖1描述的雙引物系統(tǒng)的引物二聚體假象產(chǎn)生的事件更復(fù) 雜，這導(dǎo)致用于評(píng)價(jià)待測(cè)模板存在的系統(tǒng)的靈敏性高于只依賴于雙引物的系統(tǒng)。
[0107] 盡管這類事件是罕見(jiàn)的，但所得的寡核苷酸序列將有可能是可擴(kuò)增單元。但是，這 種偶然性將被下文描述的本發(fā)明實(shí)施方案消除。為了消除非特異擴(kuò)增的任何可能性，可以 利用下列現(xiàn)象。
[0108] 當(dāng)由于IO的插入導(dǎo)致只有雙鏈的一端被分離時(shí)，同源引物可以結(jié)合解離的末端， 但部分栓系的突出鏈仍保持非常接近。因?yàn)橥怀鲦溸€包括與引物相同的區(qū)域，其能夠與引 入的引物競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合模板。此外，在重組酶去聚合后栓系的末端也可以分枝迀移，在結(jié)合分離 末端的引物有機(jī)會(huì)延伸前恢復(fù)初始雙鏈。在這些情況以及只有上游末端被熔解時(shí)，上游引 物的延伸受到影響，變成依賴于下游末端的分離，這樣的話雙鏈的鏈不再栓系并脫離。通過(guò) 這種方法，消除突出鏈的競(jìng)爭(zhēng)。因此，可以將系統(tǒng)設(shè)計(jì)成：無(wú)論雙鏈上游方面的分離與否，上 游引物只在下游末端也被分離的條件下是有效的。該系統(tǒng)對(duì)兩個(gè)末端分離的依賴增加了系 統(tǒng)的特異性，可以通過(guò)以下方式實(shí)現(xiàn)：改變有利于突出鏈恢復(fù)的上游引物的能力，或使用低 濃度的聚合酶或具有弱的鏈置換活性（Klenow exo-活性）的聚合酶，因?yàn)檫@也將影響引物 延伸與雙鏈恢復(fù)的平衡。無(wú)論如何當(dāng)雙鏈的兩條鏈分離時(shí)，發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增基本上更快。因此如 果特定靶的擴(kuò)增誘導(dǎo)鏈分離，不給予這一性質(zhì)的假象擴(kuò)增將被超越。
[0109] 上游引物的能力可以通過(guò)數(shù)種機(jī)制改變，例如： (i)可以將上游引物設(shè)計(jì)成與插入IO重疊。重疊的區(qū)域優(yōu)選的是約5到10個(gè)核苷酸。 重疊引物的延伸將依賴于引物在模板上的預(yù)先分枝迀移置換10。在一些情況下，具體的是 存在單鏈結(jié)合蛋白的情況下，分枝迀移是緩慢的并暫停引物的延伸，這樣的話引物的結(jié)合 和延伸對(duì)起始雙鏈的恢復(fù)（re-instatement)的競(jìng)爭(zhēng)有利于恢復(fù)。該實(shí)施方案的另一個(gè)優(yōu) 點(diǎn)是如果長(zhǎng)度大于18-23個(gè)堿基，則鄰近IO的末端不分離。這樣的話熔解溫度高于反應(yīng)的 環(huán)境溫度（其中為約40°C )。該構(gòu)建體中描述的引物具有高于該數(shù)值的Tm，但產(chǎn)生具有低 于環(huán)境溫度的Tm的末端。如果使用這類引物，其可以結(jié)合熔解雙鏈的同源末端，其3'區(qū)將 分枝迀移到雙鏈的插入方面（如果其是同源的），隨后在聚合酶的作用下延伸。如果引物變 成非特異性/不依賴模板的產(chǎn)物的一部分，除非它用IO區(qū)精確定位，否則它不可能是有效 的擴(kuò)增單元。
[0110] (ii)上游引物可能被暫時(shí)阻斷，延伸前依賴酶促切割。這通過(guò)以下例證：3'阻斷 的引物包括鄰近3'末端的RNA堿基以及RNAse H。使用選擇性核酸內(nèi)切酶的類似系統(tǒng)可以 用做減緩引物進(jìn)展的任意機(jī)制。
[0111] 在如上所述的實(shí)施方案中，擴(kuò)增變成依賴于下游末端以及上游末端的熔解。設(shè)計(jì) 為依賴下游末端熔解的系統(tǒng)可以添加對(duì)擴(kuò)增的絕對(duì)特異性。如果下游引物的Tm高于環(huán)境 溫度，則下游末端不會(huì)熔解，另外非特異性的假象產(chǎn)物不會(huì)擴(kuò)增。這是使用這類引物的一個(gè) 優(yōu)點(diǎn)，但仍存在以下問(wèn)題：具有超過(guò)反應(yīng)環(huán)境溫度的Tm的引物如何誘導(dǎo)將分離的末端。這 通過(guò)利用其他附加的序列依賴性元件熔解下游末端來(lái)實(shí)現(xiàn)。
[0112] 例如，可通過(guò)一種或更多種附加寡核苷酸（其通過(guò)插入寡核苷酸促進(jìn)靶雙鏈的分 離，其功能取決于IO插入步驟）的結(jié)合分離下游栓系的末端。這種方法的價(jià)值在于這類寡 核苷酸可以被設(shè)計(jì)成能結(jié)合和分離雙鏈，但既不是聚合酶的底物也不是重組酶的底物。這 類寡核苷酸無(wú)法參與引物假象的產(chǎn)生，因?yàn)樗皇蔷酆厦傅孜?，如圖5所示這是重要的。優(yōu) 選的所述附加的寡核苷酸結(jié)合IO釋放的鏈，分枝迀移入鄰近的雙鏈核酸。重要地當(dāng)其功能 要求分枝迀移并且發(fā)現(xiàn)分枝迀移被單鏈結(jié)合蛋白抑制時(shí)，其可以被設(shè)計(jì)成不顯著結(jié)合單鏈 結(jié)合蛋白。該方法通過(guò)以下舉例說(shuō)明： (i) IO包括是其3'末端（下游元件，DE)延伸的序列，其與靶末端區(qū)同源，如圖3所示 以及下文的描述。
[0113] 在該實(shí)施方案中，DE包括元件，其不是聚合酶底物，任選的既不是重組酶底物也不 是SSB底物。通常這可以通過(guò)利用2'修飾的核苷酸實(shí)現(xiàn)。2'位的典型修飾包括羥化，甲基 化和烷化。它可選的可通過(guò)堿基糖或磷酸鹽成分的修飾（產(chǎn)生模板和/或引物無(wú)效的性質(zhì)） 進(jìn)行誘導(dǎo)。合適的元件包括RNA和RNA類似物，諸如鎖核酸（LNA)，嗎啉代，肽核酸（PNA)以 及實(shí)現(xiàn)雜交的其他核酸修飾。這些寡核苷酸是不同的，因?yàn)樗鼈兙哂胁煌闹麈溙堑匀?根據(jù)Watson和Crick配對(duì)與RNA或DNA結(jié)合，但不能擴(kuò)增，因?yàn)榫酆厦笩o(wú)法識(shí)別它們。重 要的是該元件能夠與其靶序列雜交。
[0114] DE可以是IO的延伸，能夠分枝迀移插入部分的下游，干擾剩余雙鏈并留下具有低 于環(huán)境溫度的Tm的完整雙鏈區(qū)，分離雙鏈，這樣的話引物可以結(jié)合和延伸。在下游引物和 DE之間存在同源重疊。重要的是DE和下游引物無(wú)法彼此拷貝，這樣的話DE不應(yīng)是引物，也 不應(yīng)是聚合酶的模板底物，即它不應(yīng)允許引物在超過(guò)其與IO的接頭的區(qū)以及在IO上結(jié)合 和延伸。DE的3'末端任選的可具有附加的假（spurious)堿基和/或被阻斷延伸以促進(jìn)其， 例如通過(guò)將不可延伸的單元置于其3'末端或通過(guò)在該區(qū)域添加非同源堿基。通常通過(guò)摻 入一個(gè)或更多個(gè)數(shù)種修飾的核苷酸阻斷3'末端的延伸。通常這將摻入末端核苷酸的3'修 飾。這些修飾核苷酸的實(shí)例是雙脫氧核苷酸，3'氨基-烯丙基，不同長(zhǎng)度的3'-碳間隔物， 相反方向摻入的核苷酸（3'-3'鍵），3'磷酸，3'生物素，3'salyl，3'-巰基。可選的所述末 端可以包括不適合被聚合酶延伸的核苷酸，這是因?yàn)樗鼈冚^差的作為底物的能力，諸如PNA 或LNA或2' -5' -連接的DNA或2' -0-甲基RNA。
[0115] (ii)可以提供附加的寡核苷酸（反向互補(bǔ)序列，RC)，其具有與IO 3'區(qū)同源的3' 區(qū)，以及與靶末端同源的5'區(qū)，如圖4所示以及下文的描述。
[0116] 反向互補(bǔ)序列具有與IO 3'區(qū)同源的3'區(qū)，并在該區(qū)域結(jié)合突出的模板鏈。RC的 5'末端與鄰近IO區(qū)的靶雙鏈同源并在突出鏈上。3'區(qū)應(yīng)當(dāng)足夠長(zhǎng)以結(jié)合突出鏈，并足夠 穩(wěn)定以誘導(dǎo)其5'方面分枝迀移入鄰近的雙鏈。通常該3'區(qū)長(zhǎng)度應(yīng)為10-20個(gè)堿基，優(yōu)選 的10-14個(gè)堿基。
[0117] 重要的是它不顯著干擾IO的功能，因?yàn)樗c該寡核苷酸同源，其優(yōu)選包括不是重 組酶底物的堿基，諸如2'修飾的元件，RNA或2-0-甲基RNA或PNA或LNA。此外該寡核苷 酸不是聚合酶的模板是有幫助的。在存在系統(tǒng)組件的條件下，5'區(qū)應(yīng)能按照類似于下游元 件的方式分枝迀移入鄰近的雙鏈。為這個(gè)目的優(yōu)選的該區(qū)域包括不是單鏈結(jié)合蛋白的底物 的修飾。
[0118] RC與下游引物指向相同方向，因此其與該元件的相互作用是不重要的。與下游元 件相比，RC結(jié)合雙鏈的相反鏈，因此下游引物將與RC重疊但不與其同源。因?yàn)镽C與IO的 一部分同源，以下對(duì)于IO來(lái)說(shuō)可能是優(yōu)點(diǎn)：被阻斷延伸(例如用假3'堿基或如上所述)和/ 或在其3'末端(不與模板同源)具有一些附加的堿基。這將防止IO形成可擴(kuò)增單元。對(duì)于 RC的3'末端也是如此，為這個(gè)目的可以在RC的3'末端將其阻斷以進(jìn)一步避免延伸，可以 在其3'末端（不與模板同源）包括一些附加的堿基。
[0119] 圖3顯示一種擴(kuò)增方法，其中下游元件用于防止非特異性的擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0120] 3A :該系統(tǒng)的元件如I-IV所示。雙鏈模板如虛線所示。I代表上游引物；II代 表插入寡核苷酸（IO) ;ΙΠ 代表下游元件（DE)，其是IO的3'延伸，可以正在其3'末端包 括非同源堿基。與IO不同，該下游元件不是聚合酶的底物，也可以不是重組酶的底物。IV 代表下游引物。
[0121] 擴(kuò)增的