一種副球菌及其菌劑和制備方法與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種副球菌及其菌劑和制備方法與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中隨著化肥的大量施用，農(nóng)作物的產(chǎn)值、產(chǎn)量都有了很大的提高，同 時也導(dǎo)致了土壤有機質(zhì)降低、土壤板結(jié)、土地生產(chǎn)力下降等一系列問題。土壤微生物具有促 進(jìn)土壤養(yǎng)分轉(zhuǎn)化、活化土壤養(yǎng)分、增加養(yǎng)分供應(yīng)的作用。土壤微生物參與土壤養(yǎng)分轉(zhuǎn)化的各 種生物化學(xué)反應(yīng)，與土壤養(yǎng)分的供應(yīng)和損失密切相關(guān)。在土壤中，有機質(zhì)礦化與腐殖化、氮 素的硝化和反硝化、含磷鉀礦物的有效化等過程均有土壤微生物的參與，土壤微生物制約 著土壤氮、磷、鉀營養(yǎng)元素的供應(yīng)和生物有效性，影響煙株的產(chǎn)、質(zhì)量。而土壤養(yǎng)分大部分以 無效態(tài)存在，氮大部分為有機氮，含磷和含鉀礦物占土壤全磷鉀的95%以上。有機氮在微生 物的作用下礦化為無機氮，供給植物營養(yǎng)；土壤中的溶磷解鉀微生物能分泌甲酸、乙酸、草 酸、檸檬酸、丁二酸等，溶解含磷和含鉀礦物，釋放磷鉀，提高它們的生物有效性，改善作物 營養(yǎng)。在土壤中，存在共生固氮菌、自生固氮菌和聯(lián)合固氮菌等多種固氮微生物，通過不同 方式固定空氣中的氮，增加土壤的氮素養(yǎng)分，供給植物營養(yǎng)之需要。而一種微生物具有多種 作用的菌劑未見相關(guān)報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明第一目的在于提供一種副球菌，第二目的在于提供一種以所述副球菌作為 活性成分的菌劑，第三目的在于提供所述以副球菌作為活性成分的菌劑制備方法，第四目 的在于提供所述菌劑的應(yīng)用。
[0004] 本發(fā)明第一目的是這樣實現(xiàn)的，所述的副球菌為副球菌屬（Paracoccus limosus) A36,保藏單位：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（CGMCC)，保藏 日：2014年11月21日，保藏編號：CGMCC No. 10032 ;所述副球菌屬于細(xì)菌界，變形菌門， α -變形菌綱，紅桿菌目，紅桿菌科，副球菌屬。
[0005] --副球菌屬（Paracoccus limosus) Α36的獲得與鑒定 (1)副球菌屬（Paracoccus limosus) A36的獲得與鑒定 本發(fā)明所述的副球菌，是采用硅酸鹽細(xì)菌培養(yǎng)基從玉溪市紅塔區(qū)大營鎮(zhèn)黃官煙田的紫 色土壤中分離出來，在硅酸鹽細(xì)菌培養(yǎng)基上選擇菌落透明、發(fā)亮、粘性較大的菌落再轉(zhuǎn)接到 無機磷細(xì)菌培養(yǎng)基上，出現(xiàn)溶磷圈后，記錄菌落直徑和溶磷圈大小，取溶磷圈較大的菌重新 純化培養(yǎng)，再挑到40%的滅菌干油管中4°C保存?zhèn)溆谩?br>[0006] 所用培養(yǎng)基配方： 1、硅酸鹽細(xì)菌培養(yǎng)基： 蔗糖 5g、土壤礦物 1.0 g、MgSO4 · 7H20 0· 5g、CaCO3 0· lg、Na2HPO4 2. Og、FeCl3 (1%) 0.21111、瓊脂2(^、蒸餾水 10001111邛!17.0~7.5。
[0007] 2、無機磷細(xì)菌培養(yǎng)基： 葡萄糖 10 g、（NH4)2SO4 0.5 g、NaCl 0.3 g、KCl 0.3 g、MgS04.7H20 0.3g、FeS04.7H20 0.03g、MnSO4 ·4Η20 0.03 g、CaCO3 5 g、Ca3(PO4)2 10g、瓊脂 18-20g、蒸餾水 1000ml、pH 7. 0~7. 5 〇
[0008] 對上述分離的菌株A36， 通過常規(guī)方法進(jìn)行生物學(xué)和生理生化特性檢測與分子生物學(xué)方法鑒定。分子鑒定方 法如下：細(xì)菌基因組 DNA 的提取用 TaKaRa MiniBEST Bacterial Genomic DNA Extraction Kit Ver. 2. 0,方法參見試劑盒說明書。PCR擴增選用引物F27/R1492,常規(guī)條件擴增，擴增 產(chǎn)物委托上海英駿生物技術(shù)有限公司進(jìn)行序列測定。
[0009] 該菌呈桿狀，無芽孢，革蘭氏染色陰性，葡萄糖發(fā)酵陰性，接觸酶陽性，氧化酶陽 性，甲基紅試驗陰性，VP試驗陰性，硝酸鹽還原陽性.。
[0010] 16S rDNA序列分析：通過序列比對和生理生化特性將A36菌株鑒定為副球菌屬 (Paracoccus limosus)。
[0011] (2)副球菌屬（Paracoccus limosus) A36 的保藏 通過上述鑒定結(jié)果，確認(rèn)菌株NB 88 (T)為放射型副球菌（Paracoccus limosus)的 一個株系，命名為A36,于2014年11月21日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通 微生物中心(簡稱CGMCC，地址為：北京市朝陽區(qū)大屯路，中國科學(xué)院微生物研宄所，郵編 100080)，其保藏編號為 CGMCC No. 10032。
[0012] 本發(fā)明第二目的是這樣實現(xiàn)的，是以所述NB88 (T)經(jīng)平板培養(yǎng)、種子培養(yǎng)、發(fā)酵后 制成的菌劑。
[0013] 本發(fā)明的第三目的是這樣實現(xiàn)的，包括平板培養(yǎng)、種子培養(yǎng)、發(fā)酵、菌劑制備步驟， 具體包括： A、 平板培養(yǎng)：將副球菌屬（Paracoccus limosus) A36接種到平板培養(yǎng)基上，在溫度為 26~30°C下培養(yǎng)48~54h，得平板菌種； B、 種子培養(yǎng)：將平板菌種接種到液體培養(yǎng)基中，在溫度為26~ 30°C下?lián)u床上培養(yǎng) 55~65h，得液體發(fā)酵種子； C、 發(fā)酵：將液體發(fā)酵種子按發(fā)酵培養(yǎng)基體積8~12%的量接種入發(fā)酵罐，在28~32°C下 培養(yǎng)36~54h，攪拌速度為170~190 r/min，通氣量60~100%，得到副球菌屬（Paracoccus limosus) A36 發(fā)酵液； D、 菌劑制備：在發(fā)酵液中加入吸附劑吸附經(jīng)風(fēng)干至水分含量重量比小于13%得到目標(biāo) 固體菌劑。
[0014] 本發(fā)明第四目的是這樣實現(xiàn)的，所述菌劑在制備解磷、解鉀、提高土壤速效氮基肥 中的應(yīng)用。
[0015] 除非另有說明外，本發(fā)明中所采用的百分?jǐn)?shù)均為體積百分?jǐn)?shù)。
[0016] 本發(fā)明所述副球菌和以所述副球菌為活性成分的制劑的優(yōu)點： 本發(fā)明所用的副球菌具有將土壤中難溶的無機磷、鉀分解成植物易于吸收的磷、鉀，同 時提高土壤中全氮的含量，施用副球菌菌劑后可以促進(jìn)土壤直接釋放不被植物吸收的氮、 磷、鉀養(yǎng)分，適當(dāng)降低無機氮、磷、鉀肥料的施入；同時該菌是從煙田土壤中分離得到的，通 過增殖培養(yǎng)后再以有機肥的形勢施入田間，對植煙土壤環(huán)境改良具有較好的潛在應(yīng)用價 值。
【附圖說明】
[0017] 圖1為本發(fā)明工藝流程圖。
【具體實施方式】
[0018] 下面結(jié)合實施例和附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，但不以任何方式對本發(fā)明加以 限制，基于本發(fā)明教導(dǎo)所作的任何變換或改進(jìn)，均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0019] 本發(fā)明所述的副球菌為副球菌屬（Paracoccus limosus) A36,保藏單位：中國微 生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（CGMCC)，保藏日：2014年11月21日，保藏編號： CGMCC No. 10032 ;所述副球菌屬于細(xì)菌界，變形菌門，α -變形菌綱，紅桿菌目，紅桿菌科，副 球菌屬。
[0020] 本發(fā)明所述的副球菌為活性成分的菌劑，是以所述副球菌屬（Paracoccus limosus) A36經(jīng)平板培養(yǎng)、種子培養(yǎng)、發(fā)酵后制成的菌劑。
[0021] 本發(fā)明所述的副球菌為活性成分的菌劑的制備方法，包括平板培養(yǎng)、種子培養(yǎng)、發(fā) 酵、菌劑制備步驟，具體包括： A、 平板培養(yǎng)：將副球菌屬（Paracoccus limosus) A36接種到平板培養(yǎng)基上，在溫度為 26~30°C下培養(yǎng)48~54h，得平板菌種； B、 種子培養(yǎng)：將平板菌種接種到液體培養(yǎng)基中，在溫度為26~30°C下?lián)u床上培養(yǎng) 55~65h，得液體發(fā)酵種子； C、 發(fā)酵：將液體發(fā)酵種子按發(fā)酵培養(yǎng)基體積8~12%的量接種入發(fā)酵罐，在28~32°C下 培養(yǎng)36~54h，攪拌速度為170~190 r/min，通氣量60~100%，得到副球菌屬（Paracoccus limosus) A36 發(fā)酵液； D、 菌劑制備：在發(fā)酵液中加入吸附劑吸附經(jīng)風(fēng)干至水分含量重量比小于13%得到目標(biāo) 固體菌劑。
[0022] 所述的平板培養(yǎng)基為營養(yǎng)瓊脂NA培養(yǎng)基，其成分為：蛋白胨8~12g、牛肉粉4~6g、 氯化鈉4~6g，瓊脂粉16~20g，其余為水，pH值為7. 0~7. 5。
[0023] 所述的液體培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基均為NB培養(yǎng)基，其成分為蛋白胨8~12g、牛肉粉 4~6g、氯化鈉4~6g，其余為水，pH值為7. 0~7. 5。
[0024] 所述的B步驟中所述搖床的轉(zhuǎn)速為100~110r/min。
[0025] 所述的C步驟中發(fā)酵培養(yǎng)時，投料量為發(fā)酵罐的70~80%。
[0026] C步