一種無血清的脂肪干細(xì)胞培養(yǎng)基及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于干細(xì)胞技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種無血清的脂肪干細(xì)胞培養(yǎng)基及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]脂肪干細(xì)胞(adipose-derived stem cells，ADSCs)是從脂肪組織中分離得到的一種具有多向分化潛能的干細(xì)胞。研宄發(fā)現(xiàn)ADSCs細(xì)胞能夠在體外穩(wěn)定增殖且衰亡率低，同時具有來源廣泛，體內(nèi)儲備量大，取材容易，少量組織即可獲取大量干細(xì)胞，適宜大規(guī)模培養(yǎng)，對機體損傷小等優(yōu)點。
[0003]傳統(tǒng)的含動物血清的干細(xì)胞培養(yǎng)基給干細(xì)胞的生產(chǎn)與科研帶來多種不利因素。血清能為干細(xì)胞提供生長增殖所需的激素、生長因子、轉(zhuǎn)移蛋白和其它營養(yǎng)物質(zhì)，但其存在諸多缺點:批間差異較大，來源不穩(wěn)定，需要大量驗證工作，價格昂貴，使用不方便，成分不明確，有抑制細(xì)胞生長的成分，不利于疫苗和單克隆抗體等目的產(chǎn)品的分離純化，容易被病毒和支原體感染等。無血清培養(yǎng)基是在基礎(chǔ)培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，加入成分明確的血清替代成分，既能滿足干細(xì)胞的培養(yǎng)要求，又能有效避免因使用血清帶來的諸多不利因素。因此，發(fā)展無血清培養(yǎng)基是干細(xì)胞走向臨床應(yīng)用的重要條件。
[0004]目前已有一些市售干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基，比如Life Technology公司的間充質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基StemPro MSC SFM無血清培養(yǎng)基。但是，現(xiàn)有市售無血清培養(yǎng)基存在細(xì)胞貼壁差，操作不便等缺陷，比如Gibco無血清培養(yǎng)基的應(yīng)用需要進行培養(yǎng)瓶包被。此外，現(xiàn)有市售無血清培養(yǎng)基還存在細(xì)胞增殖不夠理想等缺陷。中國專利CN103255103公開了一種無血清的脂肪干細(xì)胞培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基以DMEM-LG為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，雖然添加了肝素、谷氨酰胺和白血病抑制因子等組分，但未添加胰島素、白蛋白等營養(yǎng)成分，脂肪干細(xì)胞的生長增殖效果不夠理想。中國專利CN102732477公開了一種無血清的脂肪干細(xì)胞培養(yǎng)基，以高糖型DMEM為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，葡萄糖的濃度高達4500mg/L，添加?；撬帷⑦€原型谷胱甘肽和銅藍蛋白等組分，但沒有促進貼壁的細(xì)胞因子，存在細(xì)胞貼壁性差、增殖緩慢的缺陷。
[0005]因此，現(xiàn)有技術(shù)存在細(xì)胞貼壁性差，細(xì)胞增殖速率不夠理想等問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]為解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的細(xì)胞貼壁性差，細(xì)胞增殖速率不夠理想的問題，發(fā)明人通過大量試驗篩選，得到一種新脂肪干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基無需進行培養(yǎng)瓶包被，操作簡便，細(xì)胞貼壁性和形態(tài)良好，細(xì)胞增殖速率高。
[0007]本發(fā)明的目的將通過下面的詳細(xì)描述來進一步體現(xiàn)和說明。
[0008]本發(fā)明提供一種無血清的脂肪干細(xì)胞培養(yǎng)基，包括MDM基礎(chǔ)培養(yǎng)基，還包括如下組分及其濃度:重組人胰島素0.5~5mg/mL、重組轉(zhuǎn)鐵蛋白1~5 μ g/mL、維生素C 5-50 μ g/mL、人血清白蛋白0.5~5mg/mL、成纖維細(xì)胞生長因子5~50ng/mL、血小板衍生生長因子5~50ng/mL、表皮生長因子5~50ng/mL、胰島素樣生長因子5~50ng/mL、轉(zhuǎn)化生長因子5~50ng/mL、纖維連接蛋白5~50ng/mL、胎球蛋白0.5~5mg/mL、茶多酸5~50yg/mL和干細(xì)胞生長因子5~30ng/mL。
[0009]采用上述技術(shù)方案的無血清的脂肪干細(xì)胞培養(yǎng)基，無需添加動物血清，可以實現(xiàn)脂肪干細(xì)胞的快速增殖，維持良好的干細(xì)胞幼稚狀態(tài)，具有良好的細(xì)胞誘導(dǎo)分化潛能。
[0010]本發(fā)明提供的無血清的脂肪干細(xì)胞培養(yǎng)基中，通過纖維連結(jié)蛋白(fibronectin)和胎球蛋白(Fetuin)的協(xié)同作用，大大增強了脂肪干細(xì)胞的貼壁性能；茶多酚有助于維持脂肪干細(xì)胞的幼稚狀態(tài)和細(xì)胞干性，防止脂肪干細(xì)胞的老化；干細(xì)胞生長因子(SCF)則可促進脂肪干細(xì)胞的生長增殖。
[0011]優(yōu)選地，本發(fā)明提供的無血清的脂肪干細(xì)胞培養(yǎng)基，包括MDM基礎(chǔ)培養(yǎng)基，還包括如下組分及其濃度:重組人胰島素0.5~2mg/mL、重組轉(zhuǎn)鐵蛋白1~4 yg/mL、維生素C5~30 μ g/mL、人血清白蛋白0.5~2mg/mL、成纖維細(xì)胞生長因子5~20ng/mL、血小板衍生生長因子5~20ng/mL、表皮生長因子5~20ng/mL、胰島素樣生長因子5~20ng/mL、轉(zhuǎn)化生長因子5~20ng/mL、纖維連接蛋白5~20ng/mL、胎球蛋白0.5~3mg/mL、茶多酸5~20yg/mL和干細(xì)胞生長因子5~15ng/mL。
[0012]更優(yōu)選地，本發(fā)明提供的無血清的脂肪干細(xì)胞培養(yǎng)基，包括MDM基礎(chǔ)培養(yǎng)基，還包括如下組分及其濃度:重組人胰島素lmg/mL、重組轉(zhuǎn)鐵蛋白2.5yg/mL、維生素C16.1 μ g/mL、人血清白蛋白lmg/mL、成纖維細(xì)胞生長因子10ng/mL、血小板衍生生長因子10ng/mL、表皮生長因子10ng/mL、胰島素樣生長因子10ng/mL、轉(zhuǎn)化生長因子10ng/mL、纖維連接蛋白10ng/mL、胎球蛋白lmg/mL、茶多酸10 μ g/mL和干細(xì)胞生長因子10ng/mL。
[0013]優(yōu)選地，所述成纖維細(xì)胞生長因子為堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)，所述血小板衍生生長因子為roGF-bb，所述胰島素樣生長因子為胰島素樣生長因子-1 (IGF-1)，所述轉(zhuǎn)化生長因子為轉(zhuǎn)化生長因子-β (TGF-β)。
[0014]優(yōu)選地，本發(fā)明提供的無血清的脂肪干細(xì)胞培養(yǎng)基，還包括1%體積百分比的非必需氨基酸，例如，購自廣州賽業(yè)生物科技有限公司的非必須氨基酸，貨號ΝΕΑΑ-10201-100。本領(lǐng)域技術(shù)人員還可在本發(fā)明的基礎(chǔ)上，根據(jù)實際需要添加其他不會導(dǎo)致負(fù)面效果的成分。
[0015]相應(yīng)地，本發(fā)明還提供無血清的脂肪干細(xì)胞培養(yǎng)基的制備方法，包括如下步驟:向MDM基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，按所述濃度加入重組人胰島素母液、重組轉(zhuǎn)鐵蛋白母液、維生素C母液、人血清白蛋白、成纖維細(xì)胞生長因子母液、血小板衍生生長因子母液、表皮生長因子母液、胰島素樣生長因子母液、轉(zhuǎn)化生長因子母液、纖維連接蛋白母液、胎球蛋白母液、茶多酚母液和干細(xì)胞生長因子母液，攪拌均勻，過膜除菌即得。
[0016]優(yōu)選地，所述成纖維細(xì)胞生長因子為堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)，所述血小板衍生生長因子為roGF-bb，所述胰島素樣生長因子為胰島素樣生長因子-1 (IGF-1)，所述轉(zhuǎn)化生長因子為轉(zhuǎn)化生長因子-β (TGF-β)。
[0017]相應(yīng)地，本發(fā)明還提供無血清的脂肪干細(xì)胞培養(yǎng)基在脂肪干細(xì)胞培養(yǎng)中的用途。
[0018]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是:本發(fā)明提供了一種新的無血清的脂肪干細(xì)胞培養(yǎng)基，與傳統(tǒng)的含血清培養(yǎng)基和其他無血清培養(yǎng)基相比，本發(fā)明提供的培養(yǎng)基培養(yǎng)的脂肪干細(xì)胞能夠保持較好的干細(xì)胞幼稚形態(tài)，具有更好的細(xì)胞增殖速率、細(xì)胞干性和細(xì)胞誘導(dǎo)分化潛能。本發(fā)明提供的制備方法簡單，制得的無血清的脂肪干細(xì)胞培養(yǎng)基用于脂肪干細(xì)胞的培養(yǎng)，表現(xiàn)出優(yōu)異的細(xì)胞性能。
【附圖說明】
[0019]圖1含不同濃度干細(xì)胞生長因子的培養(yǎng)基對細(xì)胞增殖的影響。
[0020]圖2 P5代脂肪干細(xì)胞在3種培養(yǎng)基中培養(yǎng)的形態(tài)。
[0021]圖3脂肪干細(xì)胞在3種培養(yǎng)基中的增殖曲線。
[0022]圖4 P3代脂肪干細(xì)胞在3種培養(yǎng)基中的細(xì)胞克隆數(shù)量。
[0023]圖5培養(yǎng)基I培養(yǎng)的P5代脂肪干細(xì)胞的表面抗原表達水平。
[0024]圖6培養(yǎng)基2培養(yǎng)的P5代脂肪干細(xì)胞的表面抗原表達水平。
[0025]圖7培養(yǎng)基3培養(yǎng)的P5代脂肪干細(xì)胞的表面抗原表達水平。
[0026]圖8 3種培養(yǎng)基培養(yǎng)的P5代脂肪干細(xì)胞的成脂誘導(dǎo)分化染色結(jié)果圖。
[0027]圖9 3種培養(yǎng)基培養(yǎng)的P5代脂肪干細(xì)胞在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的成脂誘導(dǎo)分化相關(guān)基因FABP4的表達結(jié)果圖。
[0028]圖10 3種培養(yǎng)基培養(yǎng)的P5代脂肪干細(xì)胞的成骨誘導(dǎo)分化染色結(jié)果圖。
[0029]圖11 3種培養(yǎng)基培養(yǎng)的P5代脂肪干細(xì)胞在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的成骨誘導(dǎo)分化相關(guān)基因OPN的表達結(jié)果圖。
【具體實施方式】
[0030]下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明做進一步詳細(xì)說明。
[0031]本發(fā)明中的各組分均為常規(guī)市售產(chǎn)品，例如干細(xì)胞生長因子購自Sigma，貨號S7901。本發(fā)明中，培養(yǎng)基1:本發(fā)明實施例二提供的無血清的脂肪干細(xì)胞培養(yǎng)基；培養(yǎng)基2 -Life Tecnology公司的的StemPro MSC SFM無血清培養(yǎng)基，貨號A10332-01 ;培養(yǎng)基3:IMDM基礎(chǔ)培養(yǎng)基+10%體積百分比的FBS。
[0032]實施例一含不同濃度干細(xì)胞生長因子的培養(yǎng)基對細(xì)胞增殖的影響
發(fā)明人進行大量試驗篩選得到本發(fā)明提供的無血清的脂肪干細(xì)胞培養(yǎng)基配方，并進一步對干細(xì)胞生長因子的濃度影響進行了考察。將Pl代ADSCs以5000個/cm2的密度接種于六孔板中，分別用含不同濃度干細(xì)胞生長因子的無血清的脂肪干細(xì)胞培養(yǎng)基(與培養(yǎng)基I相比，區(qū)別僅在于干細(xì)胞生長因子的濃度不同)培養(yǎng)，每3天將細(xì)胞用0.25%胰酶消化，收集細(xì)胞并計算數(shù)量，并以5000個/cm2的密度再次接種培養(yǎng)，直至P5代，根據(jù)每個代次的細(xì)胞收獲數(shù)量，繪制細(xì)胞增殖曲線，結(jié)果如圖1所示。
[0033]從圖1可知，干細(xì)胞生長因子的濃度為10ng/mL時，細(xì)胞增殖速率最高，濃度為5ng/mL和20ng/mL時也具有較高的細(xì)胞增殖速率，但濃度達到30ng/mL時，不僅未提高細(xì)胞增殖速率，反而降低了細(xì)胞增殖速率。因此，干細(xì)胞生長因子的濃度對本發(fā)明提供的無血清的脂肪干細(xì)胞培養(yǎng)基具有至關(guān)重要的影響。
[0034]實施例二無血清的脂肪干細(xì)胞培養(yǎng)基
無血清的脂肪干細(xì)胞培養(yǎng)基，包括MDM基礎(chǔ)培養(yǎng)基，還包括如下組分及其濃度:重組人胰島素lmg/mL、重組轉(zhuǎn)鐵蛋白2.5 μ g/mL、維生素C 16.1 μ g/mL、人血清白蛋白lmg/mL、bFGF 10ng/mL、PDGF-bb 10ng/mL、EGF 10ng/mL、IGF-1 10ng/mL、TGF-β 10ng/mL、纖維連接蛋白10ng/mL、胎球蛋白lmg/mL、茶多酸10 μ g/mL和干細(xì)胞生長因子10ng/mL。
[0035]制備方法:向MDM基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，按所述濃度加入重組人胰島素母液、重組轉(zhuǎn)鐵蛋白母液、維生素C母液、人血清白蛋白、bFGF母液、PDGF-bb母液、EGF母液、IGF-1母液、TGF-