β母液、纖維連接蛋白母液、胎球蛋白母液、茶多酚母液和干細(xì)胞生長因子母液，攪拌均勻，過膜除菌即得。
[0036]重組人胰島素母液的制備:取lg，用0.01mol/L鹽酸溶解，配成100mg/mL的母液，-20度保存。重組轉(zhuǎn)鐵蛋白母液的制備:取10mg，用MDM基礎(chǔ)培養(yǎng)基溶解，配成2.5mg/mL的母液，-20度保存。維生素C母液的制備:取10g，用MDM基礎(chǔ)培養(yǎng)基溶解，配成16.1mg/mL的母液，-20度保存。bFGF母液的制備:取10mg，用MDM基礎(chǔ)培養(yǎng)基溶解，配成lmg/mL的母液，-20度保存。H)GF-bb母液的制備:取10mg，用MDM基礎(chǔ)培養(yǎng)基溶解，配成lmg/mL的母液，-20度保存。EGF母液的制備:取10mg，用MDM基礎(chǔ)培養(yǎng)基溶解，配成lmg/mL的母液，-20度保存。IGF-1母液的制備:取10mg，用MDM基礎(chǔ)培養(yǎng)基溶解，配成lmg/mL的母液，-20度保存。TGF-β母液的制備:取10mg，用MDM基礎(chǔ)培養(yǎng)基溶解，配成lmg/mL的母液，-20度保存。纖維連接蛋白母液的制備:取10mg，用MDM基礎(chǔ)培養(yǎng)基溶解，配成lmg/mL的母液，-20度保存。Fetuin母液的制備:取lg，用MDM基礎(chǔ)培養(yǎng)基溶解，配成100mg/mL的母液，-20度保存。茶多酚母液的制備:取lOOmg，用MDM基礎(chǔ)培養(yǎng)基溶解，配成10mg/mL的母液，-20度保存。干細(xì)胞生長因子母液的制備:取100 yg，用MDM基礎(chǔ)培養(yǎng)基溶解，配成10mg/mL的母液，-20度保存。
[0037]實施例三無血清的脂肪干細(xì)胞培養(yǎng)基
無血清的脂肪干細(xì)胞培養(yǎng)基，包括MDM基礎(chǔ)培養(yǎng)基，還包括如下組分及其濃度:重組人胰島素2mg/mL、重組轉(zhuǎn)鐵蛋白2yg/mL、維生素C 20 μ g/mL、人血清白蛋白lmg/mL、bFGF 15ng/mL、PDGF-bb 10ng/mL、EGF 15ng/mL、IGF-1 10ng/mL、TGF-β 10ng/mL、纖維連接蛋白15ng/mL、胎球蛋白2mg/mL、茶多酸15 μ g/mL和干細(xì)胞生長因子15ng/mL。
[0038]制備方法:與實施例二中的制備方法類似。
[0039]實施例四無血清的脂肪干細(xì)胞培養(yǎng)基
無血清的脂肪干細(xì)胞培養(yǎng)基，包括MDM基礎(chǔ)培養(yǎng)基，還包括如下組分及其濃度:重組人胰島素lmg/mL、重組轉(zhuǎn)鐵蛋白I μ g/mL、維生素C 10 μ g/mL、人血清白蛋白1.5mg/mL、bFGF 20ng/mL、PDGF-bb 15ng/mL、EGF 10ng/mL、IGF-1 15ng/mL、TGF-β 10ng/mL、纖維連接蛋白10ng/mL、胎球蛋白lmg/mL、茶多酸15 μ g/mL和干細(xì)胞生長因子5ng/mL。
[0040]制備方法:與實施例二中的制備方法類似。
[0041]實施例五脂肪干細(xì)胞在培養(yǎng)基中培養(yǎng)的形態(tài)
將Pl代ADSCs以5000個/cm2的密度接種于培養(yǎng)瓶中，分別用培養(yǎng)基1、培養(yǎng)基2和培養(yǎng)基3培養(yǎng)，待細(xì)胞匯合度達(dá)85%時進(jìn)行傳代培養(yǎng)，直至P5代，顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，結(jié)果如圖2所示。從圖2可知，本發(fā)明提供的培養(yǎng)基I所培養(yǎng)的細(xì)胞形態(tài)更為均一，呈梭形，維持良好的干細(xì)胞幼稚狀態(tài)，而其他培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞形態(tài)不一，并呈現(xiàn)出老化狀態(tài)。
[0042]實施例六脂肪干細(xì)胞在培養(yǎng)基中培養(yǎng)的增殖
將Pl代ADSCs以5000個/cm2的密度接種于六孔板中，分別用培養(yǎng)基1、培養(yǎng)基2和培養(yǎng)基3培養(yǎng)，每3天將細(xì)胞用0.25%胰酶消化下來，收集細(xì)胞并計算數(shù)量，并以5000個/cm2的密度再次接種培養(yǎng)，直至P5代，根據(jù)每個代次的細(xì)胞收獲數(shù)量，繪制細(xì)胞增殖曲線，結(jié)果如圖3所示。從圖3可知，本發(fā)明提供的培養(yǎng)基I所培養(yǎng)的細(xì)胞增殖速率更高。
[0043]實施例七脂肪干細(xì)胞在培養(yǎng)基中培養(yǎng)的克隆增殖
取P3代ADSCs 100個接種于1cm培養(yǎng)皿中，分別加入1mL培養(yǎng)基1、培養(yǎng)基2和培養(yǎng)基3進(jìn)行培養(yǎng)，每3天半量換液一次，待最大的細(xì)胞克隆所含細(xì)胞數(shù)目為200個以上時，用結(jié)晶紫進(jìn)行染色，肉眼計算培養(yǎng)皿中的細(xì)胞克隆數(shù)量，結(jié)果如圖4所示。從圖4可知，本發(fā)明提供的培養(yǎng)基I所培養(yǎng)的細(xì)胞克隆數(shù)量更多。
[0044]實施例八脂肪干細(xì)胞在培養(yǎng)基中培養(yǎng)的表面抗原表達(dá)
取實施例五中分別用培養(yǎng)基1、培養(yǎng)基2和培養(yǎng)基3培養(yǎng)的P5代細(xì)胞，應(yīng)用流式細(xì)胞儀鑒定細(xì)胞表面抗原⑶59、⑶45、⑶90、HLA-DR的表達(dá)水平，結(jié)果如圖5至圖7所示。從圖5至圖7可知，培養(yǎng)基1、培養(yǎng)基2和培養(yǎng)基3培養(yǎng)的細(xì)胞表面抗原均符合脂肪干細(xì)胞的表面抗原要求。
[0045]實施例九脂肪干細(xì)胞在培養(yǎng)基中培養(yǎng)的成脂誘導(dǎo)分化潛能
取實施例五中分別用培養(yǎng)基1、培養(yǎng)基2和培養(yǎng)基3培養(yǎng)的P5代細(xì)胞，以5000個/cm2的密度接種于六孔板中，并添加相應(yīng)的培養(yǎng)基1、培養(yǎng)基2和培養(yǎng)基3進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞匯合度達(dá)80%時，棄去培養(yǎng)基，并加入成脂誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基(購自Life Tecnology公司，貨號A10070-01)，每3天換液一次，培養(yǎng)3周后，用油紅O進(jìn)行成脂鑒定，結(jié)果如圖8所示。同時，用qPCR鑒定成脂細(xì)胞相關(guān)基因FABP4的表達(dá)水平，結(jié)果如圖9所示。從圖8和圖9可知，本發(fā)明提供的培養(yǎng)基I所培養(yǎng)的細(xì)胞成脂誘導(dǎo)分化潛能更佳。
[0046]實施例十脂肪干細(xì)胞在培養(yǎng)基中培養(yǎng)的成骨誘導(dǎo)分化潛能
取實施例五中分別用培養(yǎng)基1、培養(yǎng)基2和培養(yǎng)基3培養(yǎng)的P5代細(xì)胞，以5000個/cm2的密度接種于六孔板中，并添加相應(yīng)的培養(yǎng)基1、培養(yǎng)基2和培養(yǎng)基3進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞匯合度達(dá)80%時，棄去培養(yǎng)基，并加入成骨分化培養(yǎng)基(購自Life Tecnology公司，貨號A10072-01 )，每3天換液一次，培養(yǎng)4周后，用茜素紅進(jìn)行成骨鑒定，結(jié)果如圖10所示。同時，用qPCR鑒定成骨細(xì)胞相關(guān)基因OPN的表達(dá)水平，結(jié)果如圖11所示。從圖10和圖11可知，本發(fā)明提供的培養(yǎng)基I所培養(yǎng)的細(xì)胞成骨誘導(dǎo)分化潛能更佳。
[0047]以上內(nèi)容是結(jié)合具體的優(yōu)選實施方式對本發(fā)明所作的進(jìn)一步詳細(xì)說明，不能認(rèn)定本發(fā)明的具體實施只局限于這些說明。對于本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干簡單推演或替換，都應(yīng)當(dāng)視為屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【主權(quán)項】
1.一種無血清的脂肪干細(xì)胞培養(yǎng)基，其特征在于:包括MDM基礎(chǔ)培養(yǎng)基，還包括如下組分及其濃度:重組人胰島素0.5~5mg/mL、重組轉(zhuǎn)鐵蛋白1~5 μ g/mL、維生素C 5-50 μ g/mL、人血清白蛋白0.5~5mg/mL、成纖維細(xì)胞生長因子5~50ng/mL、血小板衍生生長因子5~50ng/mL、表皮生長因子5~50ng/mL、胰島素樣生長因子5~50ng/mL、轉(zhuǎn)化生長因子5~50ng/mL、纖維連接蛋白5~50ng/mL、胎球蛋白0.5~5mg/mL、茶多酸5~50yg/mL和干細(xì)胞生長因子5~30ng/mL。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的無血清的脂肪干細(xì)胞培養(yǎng)基，其特征在于:包括IMDM基礎(chǔ)培養(yǎng)基，還包括如下組分及其濃度:重組人胰島素0.5~2mg/mL、重組轉(zhuǎn)鐵蛋白1~4 μ g/mL、維生素C 5~30 μ g/mL、人血清白蛋白0.5~2mg/mL、成纖維細(xì)胞生長因子5~20ng/mL、血小板衍生生長因子5~20ng/mL、表皮生長因子5~20ng/mL、胰島素樣生長因子5~20ng/mL、轉(zhuǎn)化生長因子5~20ng/mL、纖維連接蛋白5~20ng/mL、胎球蛋白0.5~3mg/mL、茶多酸5~20 μ g/mL和干細(xì)胞生長因子5~15ng/mL。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的無血清的脂肪干細(xì)胞培養(yǎng)基，其特征在于:包括IMDM基礎(chǔ)培養(yǎng)基，還包括如下組分及其濃度:重組人胰島素lmg/mL、重組轉(zhuǎn)鐵蛋白2.5yg/mL、維生素C 16.1 μ g/mL、人血清白蛋白lmg/mL、成纖維細(xì)胞生長因子10ng/mL、血小板衍生生長因子10ng/mL、表皮生長因子10ng/mL、胰島素樣生長因子10ng/mL、轉(zhuǎn)化生長因子1ng/mL、纖維連接蛋白10ng/mL、胎球蛋白lmg/mL、茶多酸10 μ g/mL和干細(xì)胞生長因子1ng/mL。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項所述的無血清的脂肪干細(xì)胞培養(yǎng)基，其特征在于:所述成纖維細(xì)胞生長因子為堿性成纖維細(xì)胞生長因子，所述血小板衍生生長因子為H)GF-bb，所述胰島素樣生長因子為胰島素樣生長因子-1，所述轉(zhuǎn)化生長因子為轉(zhuǎn)化生長因子-β。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項所述的無血清的脂肪干細(xì)胞培養(yǎng)基，其特征在于:還包括1%體積百分比的非必需氨基酸。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的無血清的脂肪干細(xì)胞培養(yǎng)基的制備方法，其特征在于:包括如下步驟:向MDM基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，按所述濃度加入重組人胰島素母液、重組轉(zhuǎn)鐵蛋白母液、維生素C母液、人血清白蛋白、成纖維細(xì)胞生長因子母液、血小板衍生生長因子母液、表皮生長因子母液、胰島素樣生長因子母液、轉(zhuǎn)化生長因子母液、纖維連接蛋白母液、胎球蛋白母液、茶多酚母液和干細(xì)胞生長因子母液，攪拌均勻，過膜除菌即得。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的無血清的脂肪干細(xì)胞培養(yǎng)基的制備方法，其特征在于:所述成纖維細(xì)胞生長因子為堿性成纖維細(xì)胞生長因子，所述血小板衍生生長因子為roGF-bb，所述胰島素樣生長因子為胰島素樣生長因子-1，所述轉(zhuǎn)化生長因子為轉(zhuǎn)化生長因子-β。
8.根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項所述的無血清的脂肪干細(xì)胞培養(yǎng)基在脂肪干細(xì)胞培養(yǎng)中的用途。
【專利摘要】本發(fā)明提供一種無血清的脂肪干細(xì)胞培養(yǎng)基，屬于干細(xì)胞技術(shù)領(lǐng)域，包括IMDM基礎(chǔ)培養(yǎng)基，還包括如下組分：重組人胰島素、重組轉(zhuǎn)鐵蛋白、維生素C、人血清白蛋白、成纖維細(xì)胞生長因子、血小板衍生生長因子、表皮生長因子、胰島素樣生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子、纖維連接蛋白、胎球蛋白、茶多酚和干細(xì)胞生長因子。本發(fā)明提供的無血清的脂肪干細(xì)胞培養(yǎng)基無需進(jìn)行培養(yǎng)瓶包被，細(xì)胞貼壁性和形態(tài)良好，細(xì)胞增殖速率高。
【IPC分類】C12N5-0775
【公開號】CN104877962
【申請?zhí)枴緾N201510177090
【發(fā)明人】陳海佳, 王一飛, 葛嘯虎, 戴國勝, 王小燕
【申請人】廣州賽萊拉干細(xì)胞科技股份有限公司
【公開日】2015年9月2日
【申請日】2015年4月15日