塊，將濃度為0.25%的胰蛋白酶和0.08%膠原酶II按體積為1:1配比混合后，24°C對脾臟組織消化8分鐘，用步驟(I)制備的專用培養(yǎng)液充分懸浮，收集組織塊均勻接種于多個(gè)25cm2培養(yǎng)瓶中，24°C下倒置干貼4.5小時(shí)后加5ml步驟(I)制備的專用培養(yǎng)液啟動(dòng)原代培養(yǎng)，培養(yǎng)5d后，顯微鏡下可見大量細(xì)胞從組織塊中迀移出來并貼壁，剛貼壁的細(xì)胞形態(tài)呈上皮樣或成纖維樣。
[0054]細(xì)胞傳代培養(yǎng):
[0055]待細(xì)胞從組織塊周圍迀出形成單層，鋪滿70%的瓶底時(shí)，開始第I次傳代。先吸出所有組織塊和培養(yǎng)液，用3ml的無菌磷酸緩沖液洗滌兩次，加入質(zhì)量濃度0.25%胰酶溶液lml，24°C培箱中消化2分鐘，待細(xì)胞單層解離成單個(gè)細(xì)胞后，迅速加入3ml的專用培養(yǎng)液以中和過量的胰酶溶液，1000r/min離心3分鐘，收集細(xì)胞并用專用培養(yǎng)液重懸細(xì)胞沉淀，將重懸后得到的細(xì)胞懸液分別等量接種于兩個(gè)培養(yǎng)瓶中，24°C培養(yǎng)箱中進(jìn)行傳代培養(yǎng)。培養(yǎng)3d后，可見脾臟組織細(xì)胞的形態(tài)多呈成纖維樣。之后，按照(3)中傳代培養(yǎng)的步驟，每隔4d傳代一次。
[0056]細(xì)胞的冷凍保存和復(fù)蘇:
[0057]在MEM基礎(chǔ)培養(yǎng)液中添加體積濃度為10% 二甲基亞砜，體積濃度為30%胎牛血清，200IU/ml青霉素和鏈霉素、0.5 μ g/ml兩性霉素B，配制成細(xì)胞冷凍保存液，置冰上預(yù)冷，取對數(shù)期生長的細(xì)胞，加入質(zhì)量濃度0.25%胰酶溶液消化2分鐘，之后按照(3)中傳代培養(yǎng)的步驟操作得到細(xì)胞懸液，取少許的細(xì)胞懸液，測定細(xì)胞的密度和直徑，調(diào)節(jié)細(xì)胞密度至5X 106/ml，離心去上清，將細(xì)胞沉淀用預(yù)冷的冷凍保存液重懸，轉(zhuǎn)入2ml凍存管中，將凍存管放入凍存盒中，先在4°C冰箱中平衡30分鐘，然后在液氮面平衡5分鐘，最后將凍存管轉(zhuǎn)入液氮中，長期保存，細(xì)胞在液氮中保存一個(gè)月后，將細(xì)胞凍存管從液氮中取出，迅速投入37°C水浴解凍，離心重懸細(xì)胞沉淀，轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)觀察，18小時(shí)后更換新鮮達(dá)氏鋳脾臟細(xì)胞專用培養(yǎng)液，直到得到達(dá)氏鋳脾臟組織細(xì)胞，即可完成達(dá)氏鋳脾臟組織細(xì)胞系的構(gòu)建。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種達(dá)氏鋳脾臟組織細(xì)胞系的構(gòu)建方法，其特征在于，包括如下步驟:制備專用培養(yǎng)液，細(xì)胞的原代培養(yǎng)，細(xì)胞的傳代培養(yǎng)以及細(xì)胞的冷凍保存和復(fù)蘇， (1)專用培養(yǎng)液的具體制備步驟為:選取健康的達(dá)氏鋳，尾靜脈取血，分離出的血清過濾除菌后將該達(dá)氏鋳魚血清、胎牛血清、青霉素、鏈霉素、兩性霉素B、人表皮生長因子和人堿性成纖維樣細(xì)胞生長因子添加到Minimum Essential Medium的基礎(chǔ)培養(yǎng)液中，制備成達(dá)氏鋳脾臟細(xì)胞完全培養(yǎng)液，置于4°C保存?zhèn)溆茫? (2)細(xì)胞原代培養(yǎng)的具體步驟為:選取健康的達(dá)氏鋳，在20ppm高錳酸鉀溶液中藥浴30分鐘，再用70%乙醇擦拭魚體表面2分鐘，置于超凈工作臺中解剖取脾臟組織，用過量的的青霉素和鏈霉素，兩性霉素B的高三抗杜氏磷酸緩沖液連續(xù)漂洗若干次后，將脾臟組織剪成Imm3的小塊，在25°C下，采用胰蛋白酶和膠原酶的混合物對脾臟組織消化5_8分鐘，再將脾臟組織置于步驟(I)的專用培養(yǎng)液中進(jìn)行懸浮，收集脾臟組織塊均勻接種于培養(yǎng)瓶中，25°C下倒置干貼6小時(shí)后加步驟(I)制備的專用培養(yǎng)液啟動(dòng)脾臟組織原代培養(yǎng)，培養(yǎng)2-3d后，得到原代培養(yǎng)的脾臟組織細(xì)胞； (3)細(xì)胞傳代培養(yǎng)的具體步驟為:待脾臟組織細(xì)胞從組織塊周圍迀出形成單層，培養(yǎng)瓶底部覆蓋率達(dá)70%以上時(shí)，開始第I次傳代，先吸出所有組織塊和培養(yǎng)液，用無菌磷酸緩沖液洗滌兩次，再加入質(zhì)量濃度0.25%胰酶溶液，25°C培箱中消化1-3分鐘，待細(xì)胞單層解離成單個(gè)細(xì)胞后，加入步驟(I)中的專用培養(yǎng)液以中和過量的胰酶溶液，1200r/min離心3_6分鐘，收集細(xì)胞并用專用培養(yǎng)液重懸細(xì)胞沉淀，將重懸后得到的細(xì)胞懸液分別等量接種于兩個(gè)培養(yǎng)瓶中，25°C培養(yǎng)箱中進(jìn)行傳代培養(yǎng)，每隔3-4d，重復(fù)一次傳代培養(yǎng)的步驟，得到傳代培養(yǎng)的細(xì)胞； (4)細(xì)胞的冷凍保存和復(fù)蘇具體步驟為:在MinimumEssential Medium基礎(chǔ)培養(yǎng)液中加入二甲基亞砜，胎牛血清，青霉素、鏈霉素、兩性霉素B，配制成細(xì)胞冷凍保存液，置冰上預(yù)冷，取傳代培養(yǎng)的細(xì)胞，加入胰酶溶液消化2分鐘后按照(3)中傳代培養(yǎng)的步驟操作得到細(xì)胞沉淀，將細(xì)胞沉淀用預(yù)冷的冷凍保存液重懸，再轉(zhuǎn)入凍存管中，將凍存管放入凍存盒中進(jìn)行連續(xù)降溫后，再放入液氮超低溫保存；復(fù)蘇時(shí)，取出冷凍的細(xì)胞直接投入37°C水浴解凍，離心重懸細(xì)胞沉淀，將該細(xì)胞沉淀轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中，加入步驟(I)中的專用培養(yǎng)液，且每12-24小時(shí)后更換新鮮達(dá)氏鋳脾臟細(xì)胞專用培養(yǎng)液，得到貼壁生長的達(dá)氏鋳脾臟組織細(xì)胞，即，完成達(dá)氏鋳脾臟組織細(xì)胞系的構(gòu)建。2.如權(quán)利要求1所述的達(dá)氏鋳脾臟組織細(xì)胞系的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟I)中，所述的達(dá)氏鋳魚血清的體積濃度為0.5%，胎牛血清的體積濃度為30%、青霉素的濃度為200IU/ml、鏈霉素的濃度為200 IU/ml、兩性霉素B濃度為0.5 μ g/ml、人表皮生長因子濃度為20ng/ml、人堿性成纖維樣細(xì)胞生長因子濃度為20ng/ml。3.如權(quán)利要求2所述的達(dá)氏鋳脾臟組織細(xì)胞系的構(gòu)建方法，其特征在于，按體積分?jǐn)?shù)計(jì)體積濃度為0.5%的達(dá)氏鋳魚血清200-300 μ 1、體積濃度為30%的胎牛血清10_18ml、10000 IU/ml 的青霉素 0.6-1.4ml、10000 IU/ml 的鏈霉素 0.6-1.4ml、12.5 μ g/ml 的兩性霉素B 0.6-1.4ml、10 μ g/ml的人表皮生長因子80-120 μ 1、10 μ g/ml人堿性成纖維樣細(xì)胞生長因子 80-120 μ 1、Minimum Essential Medium 基礎(chǔ)培養(yǎng)液 30_33ml。4.如權(quán)利要求2所述的達(dá)氏鋳脾臟組織細(xì)胞系的構(gòu)建方法，其特征在于，按體積分?jǐn)?shù)計(jì)體積濃度為0.5%的達(dá)氏鋳魚血清250 μ 1、體積濃度為30%的胎牛血清15ml、10000 IU/ml的青霉素Iml、10000 IU/ml的鏈霉素Iml、12.5 μ g/ml的兩性霉素B Iml、10 μ g/ml的人表皮生長因子100 μ 1、10 μ g/ml人堿性成纖維樣細(xì)胞生長因子100 μ KMinimum EssentialMedium基礎(chǔ)培養(yǎng)液31.55ml。5.如權(quán)利要求1所述的達(dá)氏鋳脾臟組織細(xì)胞系的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟2)中，所述的青霉素和鏈霉素的濃度均為500IU/ml，兩性霉素B的高三抗杜氏磷酸的濃度為1.25 μ g/ml ο6.如權(quán)利要求1所述的達(dá)氏鋳脾臟組織細(xì)胞系的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟2)中，所述的胰蛋白酶和膠原酶的混合物為質(zhì)量濃度為0.0625%-0.25%胰蛋白酶與質(zhì)量濃度為0.08%-0.1%膠原酶II按體積為1:1的混合物。7.如權(quán)利要求1所述的達(dá)氏鋳脾臟組織細(xì)胞系的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟4)中，所述的二甲基亞砜的體積濃度為10%，胎牛血清的體積濃度為30%，青霉素的濃度為200 IU/ml，鏈霉素的濃度為200 IU/ml，兩性霉素B的濃度為0.5 μ g/ml，胰酶的質(zhì)量濃度為0.25%。8.如權(quán)利要求7所述的達(dá)氏鋳脾臟組織細(xì)胞系的構(gòu)建方法，其特征在于，按體積比計(jì)，體積濃度為10%的二甲基亞砜80-120 μ 1、10000 IU/ml的青霉素15-23 μ 1、10000 IU/ml的鏈霉素15-25 μ 1,12.5 μ g/ml的兩性霉素B 15-23 μ 1、質(zhì)量濃度為0.25%胰酶1.8-2.5ml。9.如權(quán)利要求7所述的達(dá)氏鋳脾臟組織細(xì)胞系的構(gòu)建方法，其特征在于，按體積比計(jì)，體積濃度為10%的二甲基亞砜100 μ 1、10000 IU/ml的青霉素20 μ 1、10000 IU/ml的鏈霉素20 μ 1、12.5 μ g/ml的兩性霉素B 20 μ 1、質(zhì)量濃度為0.25%胰酶2ml。10.如權(quán)利要求1所述的達(dá)氏鋳脾臟組織細(xì)胞系的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟4)中，所述的連續(xù)降溫步驟為將置有細(xì)胞沉淀的凍存盒先在4°C冰箱中平衡10分鐘，然后在_80°C超低溫冰箱中置4小時(shí)以上，再將凍存管放入液氮面平衡5分鐘，最后將凍存管轉(zhuǎn)入液氮中，進(jìn)行長期保存。
【專利摘要】本發(fā)明提供一種達(dá)氏鱘脾臟組織細(xì)胞系的構(gòu)建方法，主要包括如下步驟：（1）制備含胎牛血清、人表皮生長因子，人堿性成纖維樣細(xì)胞生長因子和達(dá)氏鱘魚血清的pH值為7.2-7.4的MEM培養(yǎng)液，于4℃冰箱保存?zhèn)溆?；?）從達(dá)氏鱘魚體內(nèi)分離出脾臟組織，采用組織塊培養(yǎng)法進(jìn)行原代培養(yǎng)；（3）待細(xì)胞生長形成單層，底部覆蓋率70%以上時(shí)，用0.25%胰酶消化進(jìn)行傳代培養(yǎng)；（4）對生長旺盛，形態(tài)均一的脾臟細(xì)胞進(jìn)行液氮冷凍保存及復(fù)蘇培養(yǎng)。本發(fā)明構(gòu)建的脾臟組織細(xì)胞系，增殖快速，形態(tài)多呈成纖維樣，可連續(xù)傳代，并可凍存復(fù)蘇。該構(gòu)建方法技術(shù)簡單，易操作，可推廣到其它鱘魚類脾臟細(xì)胞的培養(yǎng)，還可望用于達(dá)氏鱘物種資源保護(hù)及鱘魚疾病病原尤其是病毒病原的分離鑒定。
【IPC分類】C12N5/071
【公開號】CN104894056
【申請?zhí)枴緾N201510342724
【發(fā)明人】劉娟娟, 杜合軍, 肖衎, 劉雪清, 趙珣
【申請人】中國長江三峽集團(tuán)公司中華鱘研究所
【公開日】2015年9月9日
【申請日】2015年6月19日