一種武夷湍蛙抗菌肽及其編碼基因和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種武夷湍蛙抗菌肽及其編碼基因和應(yīng) 用。
【背景技術(shù)】
[0002] 近年來，隨著傳統(tǒng)抗生素的大規(guī)模和不恰當(dāng)使用，微生物對傳統(tǒng)抗生素產(chǎn)生了越 來越強的耐藥性。目前應(yīng)對微生物耐藥的唯一手段是使用新型或者替代性的抗生素藥物， 這就需要持續(xù)開發(fā)新型抗微生物劑。
[0003] 抗菌肽是一種生物體內(nèi)合成的天然小分子多肽，是多細胞生物天然免疫系統(tǒng)的重 要功能分子，對細菌、真菌、病毒和原蟲等均具有直接殺滅作用?？咕木哂蟹肿恿啃　⒔Y(jié)構(gòu) 簡單、殺菌活性強、殺菌機制獨特，不易引起耐藥性等優(yōu)點，被認(rèn)為是極具潛力的傳統(tǒng)抗生 素替代藥物，具有很大的開發(fā)應(yīng)用前景。
[0004] 兩棲類動物皮膚裸露，易于受到周圍環(huán)境中病原菌的攻擊，與此同時，兩棲類動物 獲得性免疫系統(tǒng)不健全，更多的依賴先天免疫系統(tǒng)抵御病原菌侵襲。抗菌肽作為先天免疫 系統(tǒng)的重要分子，在兩棲類動物體內(nèi)種類多樣，且含量豐富。到目前為止已從各種兩棲類動 物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)數(shù)百種不同的抗菌肽分子，并且其數(shù)目還在不斷增加。
[0005] 本發(fā)明提供一種從武夷端娃（Amolops wuyiensis)中提取出的具有廣譜高效的抗 菌活性和極低的溶血活性的新型抗菌肽，以及編碼這條多肽的核酸序列。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明提供一種從武夷湍蛙體內(nèi)提取所得的具有廣譜高效的抗菌活性和極低的 溶血活性的新型抗菌肽，以及編碼這條多肽的核酸序列。
[0007] 本發(fā)明所述武夷湍蛙抗菌肽由24個氨基酸殘基組成，分子量2708. 5Da，等電點 10. 25,其氨基酸序列為：
[0008] Lysl-Lys2-Cys3-Lys4-Phe 5-Leu6-Cys7-Lys8-Val9-Lys io-Lysll-Lys12-Leu13-Lys 14-Se Ia5-Vall6-Glyi7-Leu l8-Gln19-Ile2c1-Serf1-Met 22-Gly23-Ile24 (SEQ ID :1)，其中 Cys3和 Cys 7之 間形成一對分子內(nèi)二硫鍵。
[0009] 武夷湍蛙抗菌肽編碼基因通過從武夷湍蛙皮膚提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈 cDNA，采用長末端聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（LD-PCR)方法擴增第二鏈cDNA。
[0010] 根據(jù)抗菌肽信號肽區(qū)的保守序列，人工設(shè)計合成正向引物5'-ATGGAGGTCTGGCAGTG TGTGTTAT-3'（SEQID :3)，反向引物5'-CGGGGTACGATGAGACACCAT-3'（SEQID:4)。PCR反應(yīng) 擴增，擴增完成后回收目的片段，將回收的目的片段連接到質(zhì)粒載體上，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞， 篩選挑取陽性菌落，進行核苷酸測序。
[0011] 該武夷湍蛙抗菌肽前體的編碼基因由699個核苷酸組成，其5'端至3'端序列為 SEQ ID N0:2所示的核苷酸序列：
[0012] atggaggtct ggcagtgtgt gttatggctc tgtgcagtca cattggaggt ggctcactct 60 cagtctttgg atcagggagg acggatcaga gaagctttgg atctctacaa ccagagagaa 120 gctggagagt tcctctttaa actcctgtct gtgctcccca ccccgcacct ggaggaggag 180 ggagactcta cagcaatcgc tttcttgata aaggagacgg actgccccaa atctgaggag 240 aaagccttgg agacatgtga ctacagggag gacggggagg tgaaggtctg cgctcggcac 300 cgcgaggaag aggaggtgaa gtgcgttagc ctgaccgaga attcgcgcag caagagatcc 360 agtaaaaaga aaaagtgcaa attcctctgc aaagtgaaaa agaagctcaa atctgtcggc 420 ctccagatct: ctatgggaat ataatctctc tatatggaat ttaataagta aatcaccgcg 480 ccatcagtgc aagacgagcg caacgccgac cctcccccgt gtacaccgcg caatctccgc 540 ttcatcacaa atattctcta tcatggatac attgtatact gtgtgtgatt gtatcagatg 600 atctgcagat gacggttttc atttccttct aacatttctg caaattaatc caaataaaat 660 tatattccga aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaa 699
[0013] 編碼武夷湍蛙抗菌肽的為第370-441位核苷酸。
[0014] 武夷湍蛙抗菌肽和含有該武夷湍蛙抗菌肽的組合物可以用作抗菌和抑制細菌生 長的藥物、殺菌劑、抗微生物制劑、動物飼料、化妝品和防腐保鮮等領(lǐng)域，尤其應(yīng)用在制備抵 抗和抑制革蘭氏陽性細菌、革蘭氏陰性細菌和真菌生長的藥物中，特別針對大腸桿菌、銅綠 假單胞菌、不動桿菌、肺炎克雷伯菌、產(chǎn)酸克雷伯菌、痢疾桿菌、白色念珠菌、光滑念珠菌、嗜 麥芽窄食單胞菌、表皮葡萄球菌和屎腸球菌的抗菌和抑菌效果良好。
[0015] 本發(fā)明的武夷湍蛙抗菌肽的編碼基因，可以應(yīng)用于多肽重組表達、轉(zhuǎn)基因動物、植 物、植物部分、動物細胞或植物細胞中。
[0016] 本發(fā)明中的武夷湍蛙抗菌肽具有分子量小、人工合成簡單、抗菌作用廣譜高效、溶 血活性低的優(yōu)點，具有廣泛的應(yīng)用前景。
【具體實施方式】
[0017] 下面用實施例，對本發(fā)明的【具體實施方式】作進一步詳細描述。以下實施例用于說 明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。
[0018] 實施例1 :
[0019] 武夷湍蛙抗菌肽編碼基因克?。?br>[0020] 1)武夷湍蛙皮膚總RNA提取：
[0021] ①取200mg武夷湍蛙背部皮膚組織，放入研缽中加入液氮研磨成粉末，轉(zhuǎn)移到EP 管中，加入1ml總RNA提取緩沖液（Trizol，美國Life公司產(chǎn)品），充分混勻，而后于4°C， 12000rpm 離心 lOmin。
[0022] ②離心取上清，加入0. 2ml氯仿溶液，劇烈混勻，室溫放置10分鐘，而后以4°C， 12000rpm離心10分鐘，棄除沉淀。
[0023] ③上清加入等體積的異丙醇，室溫放置10分鐘，以4°C，12000rpm離心10分鐘，收 集沉淀用75% (V/V)乙醇洗一次，晾干，管底沉淀物即為武夷湍蛙皮膚總RNA。
[0024] 2)武夷湍蛙皮膚cDNA二鏈合成：采用CL0NTECH公司In-Fusion SMARTer? Directional cDNA Library Construction Kit 合成。
[0025] (I) cDNA第一鏈合成（mRNA反轉(zhuǎn)錄）：
[0026] ① RNase-free的PCR管中加入1 μ 1武夷湍蛙皮膚總RNA、1 μ 1 3'端一鏈合成引 物（3' In-Fusion SMARTer CDS Primer)和 2. 5 μ I RNase-free 水使總體積達到 4. 5 μ 1， 混勻后短暫離心（2000rpm，30s)，離心后于72°C保溫3分鐘；保溫后再將離心管在42°C孵 育2分鐘。
[0027] ②在上述離心管中加入以下試劑（均為CL0NTECH公司In-Fusion SMARTer? Directional cDNA Library Construction Kit 建庫試劑盒中配備），2. 0 μ 15 X 第一鏈緩 沖液、0·25μ1 IOOmM DTT、1.0yl IOmM dNTP Mix、L0yl SMARTerV Oligonucleotide、 0·25μ I RNase Inhibitor 和 I. 0μ I SMARTScribe Reverse Transcriptase 反轉(zhuǎn)錄酶，混 合離心管中試劑并短暫離心（2000rpm，30s)，在42°C保溫90min，然后68°C保溫10min。保 溫處理后將離心管置于冰上中止第一鏈的合成。從離心管取2 μ 1所合成的cDNA第一鏈備 用。
[0028] (2)采用長末端聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（LD-PCR)方法擴增第二鏈（所用試劑均為 CL0NTECH 公司 In-Fusion SMARTer? Directional cDNA Library Construction Kit 建庫 試劑盒中配備）
[0029] ①將 2μ1 cDNA 第一鏈（mRNA 反轉(zhuǎn)錄）、80 μ 1 去離子水、10 μ IlOXAdvantage 2PCR 緩沖液、2μ1 50XdNTP 混合物、2μ1 5'PCR 引物、2μ1 CDSIII/3'PCR 引物以及 2μ1 50XAdvantage 2Polymerase Mix 在 95°C預(yù)熱的 PCR 管中進行混合。
[0030] ②在PCR儀中按以下程序擴增：
[0031] 95°C，Imin ; 18 個循環(huán)：95°C，15sec，65°C，30sec，68°C，6min。循環(huán)結(jié)束后，將離心 管中合成的cDNA雙鏈一 80 °C保存。
[0032] (3)武夷湍蛙抗菌肽編碼基因克?。?br>[0033] 根據(jù)娃科cathelicidins家族抗菌肽信號肽區(qū)的保守序列，人工設(shè)計合成正向 引物 5' _:5' -ATGGAGGTCTGGCAGTGTGTGTTAT-3'，反向引物為 CL0NTECH 公司 In-Fusion SMARTer? Directional cDNA Library Construction Kit 中的 3' -PCR 引物，其序列為 5' -CGGGGTACGATGAGACACCAT-3'。PCR 反應(yīng)在如下條件下進行：95°C 4min，95°C 30sec， 57°C 3〇sec和72°C lmin，30個循環(huán)。擴增完成后用膠回收試劑盒（天根生物）進行目的片 段回收。將回收的目的片段連接到PMD19-T載體（Takara，大連），轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細胞。 涂板并進行氨芐青霉素篩選，挑取單菌落用M13引物PCR檢測插入片段大小。挑取陽性菌 落，搖菌提取質(zhì)粒