親水性重組蛋白的部分精制方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及親水性重組蛋白的部分精制（partial purification)方法，詳細(xì)而 言，本發(fā)明涉及從表達(dá)親水性指數(shù)（hydropathy index)為0以下的重組蛛絲蛋白等親水性 重組蛋白的宿主中將該親水性重組蛋白部分精制的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 蛛絲纖維已知是具有高強(qiáng)度和韌性的纖維，其比高強(qiáng)度鋼、尼龍6(注冊商標(biāo)）纖 維等具有更高的強(qiáng)度和韌性。由于這樣的特性，蛛絲作為新型原料受到關(guān)注，利用基因重 組技術(shù)進(jìn)行了使作為蛛絲原料的蛛絲蛋白在大腸桿菌等宿主細(xì)胞中的表達(dá)、回收。例如專 利文獻(xiàn)1中公開了通過重組DNA技術(shù)制造絡(luò)新婦蛛（Nephila clavipes)大吐絲管（major ampullate)拖絲蛋白、絡(luò)新婦蛛小吐絲管（minor ampullate)拖絲蛋白等蜘蛛拖絲蛋白。
[0003] 現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)
[0004] 專利文獻(xiàn)
[0005] 專利文獻(xiàn)1 :日本特開平6-98771號公報

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 發(fā)明所要解決的課題
[0007] 專利文獻(xiàn)1中，在使細(xì)胞溶解而將細(xì)胞內(nèi)存在的重組蜘蛛拖絲蛋白釋放、回收時， 通過用細(xì)胞殘渣溶解而蜘蛛拖絲蛋白不溶解的溶劑進(jìn)行重復(fù)處理來使蜘蛛拖絲蛋白沉淀。 但是，在重組蜘蛛拖絲蛋白為水不溶性蛋白時是有效的，當(dāng)重組蛋白為親水性重組蛋白時， 并不是有效的手段且期望工序的簡便化。
[0008] 本發(fā)明為了解決上述以往的問題，提供一種能夠從表達(dá)親水性指數(shù)為0以下的重 組蛛絲蛋白等親水性重組蛋白的宿主中簡便且高效地將親水性重組蛋白部分精制的親水 性重組蛋白的部分精制方法。
[0009] 用于解決課題的手段
[0010] 本發(fā)明涉及一種親水性重組蛋白的部分精制方法，其為從表達(dá)親水性重組蛋白的 宿主中將親水性重組蛋白部分精制的方法，其特征在于，其包含在上述表達(dá)親水性重組蛋 白的宿主中添加溶解用溶劑，使宿主細(xì)胞溶解，將不溶物分離來得到溶解液的溶解液獲取 工序，其中，上述親水性重組蛋白的親水性指數(shù)為0以下，上述溶解用溶劑為非質(zhì)子性極性 溶劑。
[0011] 本發(fā)明的親水性重組蛋白的部分精制方法中，上述溶解用溶劑優(yōu)選偶極矩為 3. OD以上，更優(yōu)選為選自二甲基亞砜、N，N-二甲基甲酰胺、N，N-二甲基乙酰胺、1，3-二甲 基-2-咪唑啉酮和N-甲基-2-吡咯烷酮中的一種以上非質(zhì)子性極性溶劑。上述溶解用溶 劑優(yōu)選為在上述非質(zhì)子性極性溶劑中添加無機(jī)鹽而成的溶劑。上述不溶物的分離可以通過 利用過濾的分離和/或離心分離來進(jìn)行。上述溶解用溶劑相對于上述宿主的質(zhì)量以體積 (mL)/質(zhì)量（g)比計優(yōu)選添加0.5倍以上。優(yōu)選將上述溶解液用水系溶劑進(jìn)行溶劑替換。 經(jīng)溶劑替換的溶解液更優(yōu)選進(jìn)一步采用選自柱、過濾和離心分離中的一種以上方法處理。 上述親水性重組蛋白優(yōu)選為選自重組蛛絲蛋白、重組節(jié)肢彈性蛋白和重組膠原中的一種蛋 白。
[0012] 發(fā)明效果
[0013] 根據(jù)本發(fā)明，通過使用非質(zhì)子性極性溶劑作為溶解用溶劑，用溶解用溶劑使表達(dá) 親水性指數(shù)為0以下的親水性重組蛋白的宿主溶解，將不溶物分離、回收溶解液，能夠簡便 且高效地從宿主中將親水性指數(shù)為0以下的親水性重組蛋白部分精制。
[0014] 另外，根據(jù)本發(fā)明，通過使用在非質(zhì)子性極性溶劑中添加無機(jī)鹽而成的溶劑作為 溶解用溶劑，能夠以更高的精制率將親水性指數(shù)為0以下的重組蛛絲蛋白、重組節(jié)肢彈性 蛋白、重組膠原等親水性重組蛋白部分精制。
【附圖說明】
[0015] 圖1為表示實施例1和比較例1中得到的蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳 (SDS-PAGE)的結(jié)果的照片。
[0016] 圖2為表示實施例2~6中得到的蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE) 的結(jié)果的照片。
[0017] 圖3為表示比較例2中得到的蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE)的結(jié) 果的照片。
[0018] 圖4為表示實施例8中得到的蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE)的結(jié) 果的照片。
【具體實施方式】
[0019] 本發(fā)明中，蛋白的親水性指數(shù)（hydropathy index)是如下算出的數(shù)值。首先，求 出蛋白中存在的氨基酸的親水性指數(shù)的總和。接著，用該總和除以蛋白中的氨基酸殘基數(shù) 求出平均值，將算出的平均值作為蛋白的親水性指數(shù)。其中，關(guān)于氨基酸的親水性指數(shù)，使 用公知的指標(biāo)（Hydropathy index :Kyte，J. &Doolittle，R.F. (1982)A simple method for displaying the hydropathic character of a protein. J. Mol. Biol. 157,105-132. )〇 具 體而言，各氨基酸的親水性指數(shù)（下文也記為HI)如下表1所示。
[0020] 表 1
[0021]

[0022] 本發(fā)明者們發(fā)現(xiàn)在表達(dá)親水性指數(shù)為0以下的親水性重組蛋白的宿主中添加非 質(zhì)子性極性溶劑、使細(xì)胞溶解、將不溶物分離，能夠?qū)⑸鲜鲇H水性指數(shù)為0以下的親水性重 組蛋白通過上清液回收而得到部分精制，從而完成了本發(fā)明。即發(fā)現(xiàn)了，通過用非質(zhì)子性 極性溶劑使宿主細(xì)胞溶解，親水性指數(shù)為〇以下的親水性重組蛋白溶解于非質(zhì)子性極性溶 劑，從而完成了本發(fā)明。下文中，在沒有特別說明的情況下，親水性蛋白是指親水性指數(shù)為〇 以下的親水性蛋白。另外，下文中，在沒有特別說明的情況下，重組蛋白是指親水性指數(shù)為 〇以下的親水性重組蛋白。
[0023] 上述非質(zhì)子性極性溶劑沒有特別限定，從降低夾雜物的觀點(diǎn)出發(fā)，優(yōu)選純度為 90%以上、更優(yōu)選為95%以上。上述非質(zhì)子性極性溶劑的偶極矩優(yōu)選為3. OD以上。偶極矩 被用作表示分子的極性強(qiáng)度的指標(biāo)，偶極矩越大則極性強(qiáng)度也越大。通常，偶極矩為3. OD 以上的分子的極性強(qiáng)，當(dāng)溶解蛋白等具有極性的化合物時，極性大的溶劑是有效的。下表2 中記載了基于講談社Scientific公司出版的溶劑手冊（2007年）的各種有機(jī)化合物（有 機(jī)溶劑）的偶極矩。作為偶極矩為3. OD以上的非質(zhì)子性極性溶劑，可列舉出二甲基亞砜 (DMSO)、N，N-二甲基甲酰胺（DMF)、N，N-二甲基乙酰胺（DMA)、1，3-二甲基-2-咪唑啉酮 (DMI)、N-甲基-2-吡咯烷酮（NMP)、乙腈等。
[0024] 表 2
[0025]
[0026] 當(dāng)上述溶解用溶劑為在非質(zhì)子性極性溶劑中添加無機(jī)鹽而成的溶劑時，沒有特別 限定，從提高重組蛋白的純度（精制度）的觀點(diǎn)出發(fā)，無機(jī)鹽的濃度優(yōu)選為〇. IM以上、更優(yōu) 選為0. 25M以上、進(jìn)一步優(yōu)選為0. 5M以上。另外，上述溶解用溶劑中，無機(jī)鹽的濃度的上限 沒有特別限定，優(yōu)選為飽和狀態(tài)以下，例如可以為2. 5M以下。
[0027] 上述溶解用溶劑的添加量只要是能夠溶解上述宿主的量即可，沒有特別限定，從 提高溶解性的觀點(diǎn)出發(fā)，相對于上述宿主（細(xì)胞）的質(zhì)量以體積（mL)/質(zhì)量（g)比計優(yōu)選 為0. 5倍以上、更優(yōu)選為0. 75倍以上、進(jìn)一步優(yōu)選為1倍以上。另外，從操作的簡便性出發(fā)， 上述溶解用溶劑的添加量相對于上述宿主的質(zhì)量以體積（mL)/質(zhì)量（g)比計優(yōu)選為10倍 以下、更優(yōu)選為6倍以下、進(jìn)一步優(yōu)選為4倍以下。上述宿主（細(xì)胞）可以為干燥的狀態(tài)、 也可以為濕的狀態(tài)。
[0028] 將上述溶解用溶劑添加到宿主中、將宿主細(xì)胞溶解的工序沒有特別限定，從重組 蛋白的溶解性的觀點(diǎn)出發(fā)，優(yōu)選在20°C以上的條件下進(jìn)行、更優(yōu)選在45°C以上的條件下進(jìn) 行、進(jìn)一步優(yōu)選在50°C以上的條件下進(jìn)行。另外，從抑制重組蛋白分解的觀點(diǎn)出發(fā)，上述溶 解物獲取工序優(yōu)選在l〇〇°C以下的條件下進(jìn)行、更優(yōu)選在95°C以下的條件下進(jìn)行。另外，上 述溶解物獲取工序沒有特別限定，例如優(yōu)選進(jìn)行10~300分鐘、更優(yōu)選進(jìn)行30~180分鐘。
[0029] 本發(fā)明中，不溶物的分離只要能夠?qū)⒊两滴锓蛛x則沒有特別限定。從操作的簡便 性出發(fā)，優(yōu)選通過利用過濾的分離和/或離心分離來進(jìn)行。利用過濾的分離可以使用例 如濾紙、過濾膜等來進(jìn)行。離心分離的條件沒有特別限定。例如可以在室溫（20±5°C)、 8000Xg~15000Xg下進(jìn)行5~20分鐘。上述不溶物的分離可以進(jìn)行2次以上。
[0030] 上述重組蛋白只要是親水性指數(shù)為0以下的親水性重組蛋白即可，沒有特別限 定。從提高提取效率的觀點(diǎn)出發(fā)，親水性指數(shù)優(yōu)選為一 0. 1以下、更優(yōu)選為一 0. 3以下。
[0031] 作為上述重組蛋白，沒有特別限定，例如優(yōu)選為選自重組蛛絲蛋白、重組節(jié)肢彈性 蛋白和重組膠原等中的一種蛋白。
[0032] 上述重組蛛絲蛋白只要是天然型蛛絲蛋白來源的重組蛛絲蛋白即可，沒有特別限 定。包括例如天然型蛛絲蛋白的變異體、類似物或衍生物等。上述重組蛛絲蛋白從韌性優(yōu)異 的觀點(diǎn)出發(fā)，優(yōu)選為由蜘蛛的大壺狀腺產(chǎn)生的大吐絲管拖絲蛋白來源的重組蛛絲蛋白。作 為上述大吐絲管拖絲蛋白，可列舉出絡(luò)新婦蛛（Nephila clavipes)來源的大壺狀腺絲蛋白 (spidroin)MaSpl、MaSp2、十字園蛛（Araneus diadematus)來源的 ADF3、ADF4 等。另外，上 述重組蛛絲蛋白也可以是從蜘蛛的小壺狀腺產(chǎn)生的小吐絲管拖絲蛋白來源的重組蛛絲蛋 白。作為上述小吐絲管拖絲蛋白，可列舉出絡(luò)新婦蛛來源的小壺狀腺絲蛋白MiSpl、MiSp2。 另外，上述重組蛛絲蛋白還可以是由蜘蛛的鞭狀腺（flagelliform gland)產(chǎn)生的橫絲蛋 白來源的重組蛛絲蛋白。作為上述橫絲蛋白，可列舉出例如絡(luò)新婦蛛來源的鞭毛狀絲蛋白 (flagelliform silk protein)等。
[0033] 作為上述大吐絲管拖絲蛋白來源的重組蛛絲蛋白，可列舉出含有2個以上、優(yōu)選4 個以上、更優(yōu)選6個以上的由式I :REP1-REP2所示的氨基酸序列單元的多肽。其中，在上述 大吐絲管拖絲蛋白來源的重組蛛絲蛋白中，式I :REP1-REP2所示的氨基酸序列單元可以相 同也可以不同。
[0034] 上述式1中，REPl表示聚丙氨酸。上述REPl中，連續(xù)排列的丙氨酸優(yōu)選為2個殘 基以上、更優(yōu)選為3個殘基以上、進(jìn)一步優(yōu)選為4個殘基以上、特別優(yōu)選為5個殘基以上。另 外，上述REPl中，連續(xù)排列的丙氨酸還優(yōu)選為20個殘基以下、更優(yōu)選為16個殘基以下、進(jìn) 一步優(yōu)選為14個殘