BRCA2基因g.32912799T＞C突變及其在乳腺癌輔助診斷中的應(yīng)用
【專利說明】BRCA2基因g.32912799T>C突變及其在乳腺癌輔助診斷 中的應(yīng)用 發(fā)明領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程及腫瘤醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，設(shè)及BRCA2基因g. 32912799T乂突變及其 在乳腺癌輔助診斷中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 乳腺癌是女性最為常見的惡性腫瘤。據(jù)世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究中屯、統(tǒng)計， 2012年全球女性乳腺癌新發(fā)病例達(dá)167萬，占全部女性惡性腫瘤發(fā)病的25%。同時乳腺癌 是全球第五位常見的惡性腫瘤死亡原因，居女性惡性腫瘤死亡原因之首，全球共52萬人因 乳腺癌死亡，占所有女性惡性腫瘤死亡的14. 7%。
[0003] 中國的女性乳腺癌的發(fā)病率也日趨上升，對婦女的健康造成了很大的威脅。
[0004] 乳腺癌是具有很強遺傳背景的惡性腫瘤，5-10%的乳腺癌是因為攜帶高外顯率的 乳腺癌易感基因突變所致。BRCA1，BRCA2,TP53,PALB2,PTEN，C肥K2,ATM，RAD50等被認(rèn)定 為乳腺癌易感基因，攜帶該些基因胚系突變的乳腺癌被稱為遺傳性乳腺癌。
[0005] 突變位點的存在被認(rèn)為賦予了個體不同的表型性狀，W及對于環(huán)境暴露、藥物治 療等因素的不同反應(yīng)性，因此突變位點可能是導(dǎo)致個體對常見疾病發(fā)病易感性差異的重要 遺傳基礎(chǔ)。將疾病的突變位點譜用于疾病的輔助診斷，具有廣闊的應(yīng)用前景。近年來，利用 突變位點對疾病進行輔助診斷已經(jīng)成為臨床和科研工作者的研究熱點，在腫瘤、先天性疾 病和屯、腦血管疾病等常見重大疾病上的應(yīng)用價值已初見端倪。
[0006] 攜帶BRCA2功能性突變的個體極有可能發(fā)展為乳腺癌患者，尤其是乳腺癌家族史 攜帶者。針對突變攜帶者采取一系列的預(yù)防措施，例如較早的進入乳腺癌篩查，并提高篩 查頻率，W及預(yù)防性手術(shù)的實施將早期發(fā)現(xiàn)乳腺癌而取得較好的干預(yù)和治療效果。中國的 BRCA2基因檢測起步較晚，盡管有幾項相關(guān)的研究，但是尚未發(fā)現(xiàn)足夠量的突變"熱點"，尤 其是中國人群特異的乳腺癌相關(guān)突變。并且由于種族差異，歐美國家的突變譜也不完全適 用于中國人群，若能篩選出乳腺癌發(fā)病相關(guān)的突變位點作為生物標(biāo)志物，并研制相應(yīng)的診 斷試劑盒，對我國乳腺癌篩查和早期診斷必將是一次有力的推動。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是提供一種具有新的突變位點的BRCA2突變基因。
[000引本發(fā)明另一個目的是提供檢測上述突變位點的特異性引物。
[0009] 本發(fā)明第=個目的是提供上述BRCA2突變基因及特異性引物在制備乳腺癌輔助 診斷試劑盒中的應(yīng)用。
[0010] 本發(fā)明第四個目的是提供一種乳腺癌輔助診斷試劑盒。
[001U發(fā)明人通過分離和研究乳腺癌患者及與其年齡匹配的健康對照外周血DM中的 突變，尋找與乳腺癌相關(guān)的高特異性的突變位點，并研制出可臨床或人群應(yīng)用的乳腺癌輔 助診斷試劑盒，為乳腺癌的篩查和診斷提供支持。
[0012] 本發(fā)明的目的是通過下列技術(shù)方案實現(xiàn)的：
[0013] 一種用于乳腺癌輔助診斷的BRCA2突變基因，該突變基因與BRCA2正常基因序列 相比具有g(shù). 32912799T乂位點突變。
[0014] 用于檢測上述BRCA2基因的突變位點的特異性測序引物，其上游引物的序列如為 SEQIDNO. 3所示，下游引物的序列如SEQIDNO. 4所示。
[0015] 用于檢測上述BRCA2基因的檢測方法，該方法采用Sanger測序方法，使用PCR擴 增引物，對BRCA2基因進行突變檢測；其中PCR擴增引物的上游引物的序列如為SEQID NO. 3所示，下游引物的序列如SEQIDNO. 4所示。
[0016] 上述的BRCA2突變基因在制備乳腺癌輔助診斷試劑盒中的應(yīng)用。
[0017] 上述的引物在制備乳腺癌輔助診斷試劑盒中的應(yīng)用。
[001引一種乳腺癌輔助診斷試劑盒，該試劑盒用于檢測BRCA2基因是否具有g(shù). 32912799TX：位點突變。
[0019] 所述的試劑盒，該試劑盒含有上述引物（上游引物的序列如為SEQIDNO. 3所示， 下游引物的序列如SEQIDNO. 4所示），該試劑盒還可化含有PCR技術(shù)所需的常用試劑。
[0020] 具體地說
[0021] 采用Sanger測序技術(shù)在70例具有乳腺癌家族史的中國漢族女性乳腺癌患者中， 我們發(fā)現(xiàn)有1例患者存在BRCA2基因組第13號染色體的32912799位置發(fā)生T堿基到C堿 基的突變；隨后進行無家族史乳腺癌樣本驗證，在3000例無家族史中國漢族乳腺癌女性乳 腺癌患者中，存在8例患者攜帶該突變；在3000例無腫瘤家族史，年齡匹配的正常女性對照 人群中，未發(fā)現(xiàn)突變個體。因此，該突變對乳腺癌的陽性預(yù)測值為100%，人群家族性乳腺癌 患者中發(fā)生率為1. 43%，散發(fā)性乳腺癌中發(fā)生率為0. 27%。為進一步提高該突變致乳腺癌 的可靠性，我們在2004年建立的正常人群隊列（排除任何腫瘤患者，排除乳腺癌家族史患 者）中女性7120名（36歲-70歲）檢測該突變，發(fā)現(xiàn)突變陽性1例（基線時為47歲），隨 訪至2013年，共發(fā)生25例新發(fā)乳腺癌患者，其中包含該突變陽性者。該突變位點為本研究 首次在中國漢族女性乳腺癌患者中發(fā)現(xiàn)，且在正常人群中不存在該突變，通過納入前瞻性 隊列研究，證明了攜帶該突變的患者最終發(fā)展成了乳腺癌，證明了該位點是乳腺癌的致病 因素。
[0022] W上研究所發(fā)現(xiàn)的與乳腺癌輔助診斷相關(guān)的突變位點為 g. 32912799T〉C(NC_000013. 10)，該突變發(fā)生于第13號染色體的32912799位置 (NCBI參考序列GRCh37.pl3)，該基因在NCBI參考數(shù)據(jù)庫GRCh37.pl3中的編號為 NC_000013. 10 (32889617-32973809)，該里列出在該數(shù)據(jù)庫中本突變位點前后l(K)bp的堿 基序列供參考，如56910^:1所示，8賄42基因突變序列對應(yīng)的序列如56910^:2所示， 其中突變位點為在SEQIDNO: 1序列的第101位由堿基T突變?yōu)镃堿基。
[002引 沈QIDN0:1
[0024] ACTTCAAATAAAGAACAGTTAACTGCTACTAAAACGGAGCAAAATATAAAAGATTTTGAGACTTCTGAT ACATTTTTTCAGACTGCAAGTGGGAAAAATAITAGTGTCGCCAAAGAGTCATTTAATAAAATTGTAAATTTCTTTGA TCAGAAACCAGAAGAATTGCATAACTTTTCCTTAAATTCTGAATTACATTCTGAC [002引 沈Q ID NO:2
[0026] ACTTCAAATAAAGAACAGTTAACTGCTACTAAAACGGAGCAAAATATAAAAGATTTTGAGACTTCTGAT ACATTTTTTCAGACTGCAAGTGGGAAAAATACTAGTGTCGCCAAAGAGTCATTTAATAAAATTGTAAATTTCTTTGA TCAGAAACCAGAAGAATTGCATAACTTTTCCTTAAATTCTGAATTACATTCTGAC
[0027] 本發(fā)明解決問題的技術(shù)方案包括；（1)篩選出人群中BRCA2與乳腺癌發(fā)生相關(guān)的 新突變，提供位點的突變后堿基序列（2)建立統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)的標(biāo)本庫和數(shù)據(jù)庫；W標(biāo)準(zhǔn)操作程 序（SCP)采集符合標(biāo)準(zhǔn)的血液樣本，系統(tǒng)收集完整的人口學(xué)資料和臨床資料。（3)突變篩選 和驗證其作用：采用Sanger測序技術(shù)在70例具有乳腺癌家族史的中國漢族女性乳腺癌患 者中，我們發(fā)現(xiàn)有1例患者存在BRCA2基因的基因組序列中32912799位置T堿基突變?yōu)镃; 隨后進行無家族史乳腺癌樣本驗證，在3000例無家族史中國漢族女性乳腺癌患者中，存在 8例患者攜帶該突變；在3000例無腫瘤家族史，年齡匹配的中國漢族正常女性對照人群中， 未發(fā)現(xiàn)突變個體。我們在2004年建立的中國漢族正常人群隊列（排除任何腫瘤患者，排除 乳腺癌家族史患者）中女性7120名（36歲-70歲）檢測該突變，發(fā)現(xiàn)突變陽性1例（基線 時為47歲），隨訪至2013年，共發(fā)生25例新發(fā)乳腺癌患者，其中包含該突變陽性者。（3) 對篩選出的突變位點，需要滿足在正常人群中無頻率。（4)乳腺癌輔助診斷試劑盒的研制： 根據(jù)乳腺癌病例所獨有的突變位點開發(fā)突變位點輔助診斷試劑盒。
[002引本發(fā)明人W標(biāo)準(zhǔn)操作程序（SCP)采集符合標(biāo)準(zhǔn)的血液樣本，系統(tǒng)收集完整的人口 學(xué)資料、臨床資料等，并采用了Sanger測序?qū)RCA2基因的外顯子編碼區(qū)域進行掃描。
[0029] 具體來說研究的實驗方法主要包括W下幾個部分：
[0030] 1.研究樣本的選擇（均為中國漢族）
[0031] (1)經(jīng)病理學(xué)明