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      檢測肝糖原累積癥Ⅰa型GP6C基因突變的試劑盒及其應(yīng)用

      文檔序號:8539231閱讀:1163來源:國知局
      檢測肝糖原累積癥Ⅰa型GP6C基因突變的試劑盒及其應(yīng)用
      【技術(shù)領(lǐng)域】
      [0001] 本發(fā)明涉及一種檢測肝糖原累積癥I a型GP6C基因突變的試劑盒,以及利用該試 劑盒檢測肝糖原累積癥I a型GP6C基因突變的方法。 (二)
      【背景技術(shù)】
      [0002] 糖原累積癥I型又稱VonGierke病,簡稱GSD I,是遺傳性肝內(nèi)葡萄糖-6-磷酸酶 (G6Pase)先天性缺乏而導(dǎo)致糖原分解或合成障礙的常染色體隱性遺傳性疾病。G6Pase體 系主要由4個組分組成:葡萄糖-6-磷酸酶-a (G6PC)、葡萄糖-6-磷酸轉(zhuǎn)運(yùn)體(G6PT1)、無 機(jī)磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體(Τ2)、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體(Τ3),分別行使葡萄糖-6-磷酸的水解,G6p的轉(zhuǎn)位, 磷酸的運(yùn)輸和葡萄糖運(yùn)輸?shù)墓δ?。根?jù)缺陷的酶的不同將GSD I分為4個亞型:G6PC缺陷 引起GSD I a ;G6PTI缺陷引起GSD I b;磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體缺陷引起GSD I c和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體 缺陷引起GSD I d。
      [0003] 研宄表明,其中GSD I型約占整個糖原累積癥的25%,而I型中I a型約占80%, 故GSD I a型是一種相對較為常見的糖原代謝障礙疾病,其活產(chǎn)兒發(fā)病率約為十萬分之 一。臨床表現(xiàn)主要為低血糖、肝臟腫大、高脂血癥、高尿酸血癥、高乳酸血癥等,主要累及肝 臟、腎臟和小腸,在臨床上主要問題表現(xiàn)為診斷率低和診斷手段有限。控制GSD I a型的基 因為G6PC,該基因定位于G6Pase基因位于人類的17號染色體長臂2區(qū)1帶,全長12. 5kb, 包含5個外顯子。G6PC蛋白為細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜蛋白,包含357個氨基酸,為高度疏水性蛋白, 有9個跨膜單位,其N端位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi),C端位于質(zhì)膜上。目前國內(nèi)外學(xué)者對GSD I a 型的基因型研宄已確定了多種突變,包括錯義突變、剪接突變、移碼突變、缺失、基因與假基 因融合與基因轉(zhuǎn)化等,具有種族差異性,常見的突變位點為R83C、Q347、R83H、R83C、V338F、 D38V、G68R、IVS3-58T>A、IVS4+10G>A。中國人GP6C基因突變等位基因中以R83H及R83C為 最常見。
      [0004] 基因測序是指分析特定DNA片段的堿基序列,也就是腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、胞 喃啶(C)與鳥嗓呤的(G)排列方式。目前常用的Sanger測序法是Frederick Sanger于 1975年發(fā)明的,測序過程需要先做一個聚合酶連鎖反應(yīng)(PCR)。PCR過程中,雙脫氧核糖核 苷酸可能隨機(jī)的被加入到正在合成中的DNA片段里。由于雙脫氧核糖核苷酸又少了一個氧 原子,一旦它被加入到DNA鏈上,這個DNA鏈就不能繼續(xù)增加長度。最終的結(jié)果是獲得所有 可能獲得的、不同長度的DNA片段。作為一種新型基因檢測技術(shù),基因測序能夠從血液或唾 液中分析測定目的基因序列,助力相關(guān)遺傳病診斷,可以對那些即使沒有臨床癥狀的患者, 也可以得到盡早的診斷和治療,為臨床診治提供科學(xué)依據(jù)。與患者擁有相同基因型的家族 成員,盡管沒有臨床癥狀也應(yīng)該盡早治療,而臨床癥狀或生化檢查都模棱兩可的家族成員, 有可能是雜合子攜帯者需加以關(guān)注,具有高度特異且精確,低成本,操作簡便,快速,高通量 等優(yōu)點,是國際上公認(rèn)的檢測基因突變的"金標(biāo)準(zhǔn)"。
      [0005] 在G6PC基因克隆之前,GSD I a的診斷主要靠臨床表現(xiàn)和生化檢查,確診則需要 肝穿刺檢測肝標(biāo)本中G6Pase的活性,對攜帶者無法進(jìn)行檢查,產(chǎn)前診斷如果對胎兒肝臟進(jìn) 行活檢會給胎兒帶來危險。G6PC基因突變檢測使得以DNA為基礎(chǔ)的基因診斷成為可能,該 方法不僅顯著提高了不典型GSD I a型病例的診斷率,也是通過產(chǎn)前診斷從而有效降低該 病發(fā)病率的重要手段。同時對患者的同胞進(jìn)行基因檢測將有可能將診斷提前至無癥狀的臨 床前期,因而對于GSD I a型的基因測序檢測,具有更準(zhǔn)確、更經(jīng)濟(jì)、更簡便,利于開展,避免 了以往該病的診斷有賴于肝穿刺及活檢的診斷方法,更易于被患者接受。 (三)
      【發(fā)明內(nèi)容】

      [0006] 本發(fā)明目的是提供一種檢測肝糖原累積癥I a型GP6C基因突變的試劑盒及方法, 用于檢測G6PC基因突變位點,特異性好,靈敏度高。
      [0007] 本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:
      [0008] 檢測肝糖原累積癥I a型GP6C基因突變的試劑盒,主要包括特異性引物和PCR反 應(yīng)試劑;
      [0009] 所述特異性引物序列如下:
      [0010] 外顯子Exonl擴(kuò)增引物:
      [0011] 上游引物:5 ' -AGCAATCACCACCAAGC-3 '
      [0012] 下游引物:5' -TCCAAAGTCAGAGAGAGGG-3' ;
      [0013] 外顯子Exon2擴(kuò)增引物:
      [0014] 上游引物:5' -TTCTCAGGCTACACTCTTC-3'
      [0015] 下游引物:5' -CGTGCCTCTCTGGAC-3' ;
      [0016] 外顯子Exon3擴(kuò)增引物:
      [0017] 上游引物:5' -GTGGCTGGGTAGATGATGC-3'
      [0018] 下游引物:5' -ACATTCCCTGACTCTGAGGTTTA-3' ;
      [0019] 外顯子Exon4擴(kuò)增引物:
      [0020] 上游引物:5 ' -CCTGTGTTCTGTTATGGTT-3 '
      [0021] 下游引物:5' -AGGATGTGGCTGGAA-3' ;
      [0022] 外顯子Exon5擴(kuò)增引物:
      [0023] 上游引物:5 ' -CCATCTGCCATCTGTG-3 '
      [0024] 下游引物:5 ' -AATAGTAGTCCTCCTCAATCC-3 '。
      [0025] 所述PCR反應(yīng)試劑為本領(lǐng)域常規(guī)試劑,主要包括:dNTP、10*PCR緩沖液、雙蒸水、 Tag酶等。
      [0026] 所述試劑盒還可包括GP6C基因外顯子序列標(biāo)準(zhǔn)品,所述標(biāo)準(zhǔn)品序列如下:
      [0027] 外顯子 Exonl:
      [0028] 5 ' -ATGGAGGAAGGAATGAATGTTCTCCATGACTTTGGGATCCAGTCAACACATTACCTCCAGGTGAAT TACCAAGACTCCCAGGACTGGTTCATCTTGGTGTCCGTGATCGCAGACCTCAGGAATGCCTTCTACGTCCTCTTCCC CATCTGGTTCCATCTTCAGGAAGCTGTGGGCATTAAACTCCTTTGGGTAGCTGTGATTGGAGACTGGCTCAACCTCG TCTTTAAGTG-3 ,;
      [0029] 外顯子 Exon2:
      [0030] 5 ' -GATTCTCTTTGGACAGCGTCCATACTGGTGGGTTTTGGATACTGACTACTACAGCAACACTTCCGT GCCCCTGATAAAGCAGTTCCCTGTAACCTGTGAGACTGGACCAG-3 ' ;
      [0031] 外顯子 Exon3:
      [0032] 5,-GGAGCCCCTCTGGCCATGCCATGGGCACAGCAGGTGTATACTACGTGATGGTCACATCTACTCTTT CCATCTTTCAGGGAAAGATAAAGCCGACCTACAGATTTCG-3 ' ;
      [0033] 外顯子 Exon4:
      [0034] 5? -GTGCTTGAATGTCATTTTGTGGTTGGGATTCTGGGCTGTGCAGCTGAATGTCTGTCTGTCACGAAT CTACCTTGCTGCTCATTTTCCTCATCAAGTTGTTGCTGGAGTCCTGTCAG-3 ' ;
      [0035] 外顯子 Exon5:
      [0036] 5 ' -GCATTGCTGTTGCAGAAACTTTCAGCCACATCCACAGCATCTATAATGCCAGCCTCAAGAAATATT TTCTCATTACCTTCTTCCTGTTCAGCTTCGCCATCGGATTTTATCTGCTGCTCAAGGGACTGGGTGTAGACCTCCTG TGGACTCTGGAGAAAGCCCAGAGGTGGTGCGAGCAGCCAGAATGGGTCCACATTGACACCACACCCTTTGCCAGCCT CCTCAAGAACCTGGGCACGCTCTTTGGCCTGGGGCTGGCTCTCAACTCCAGCATGTACAGGGAGAGCTGCAAGGGGA AACTCAGCAAGTGGCTCCCATTCCGCCTCAGCTCTATTGTAGCCTCCCTCGTCCTCCTGCACGTCTTTGACTCCTTG AAACCCCCATCCCAAGTCGAGCTGGTCTTCTACGTCTTGTCCTTCTGCAAGAGTGCGGTAGTGCCCCTGGCATCCGT CAGTGTCATCCCCTACTGCCTCGCCCAGGTCCTGGGCCAGCCGCACAAGAAGTCGTTGTAA-3'。
      [0037] PCR及測序所需野生型標(biāo)準(zhǔn)品的制備以Genebank中發(fā)布G6PC的基因序列為標(biāo)準(zhǔn), 以健康體檢人的外周血基因組為模板,用上述5對引物擴(kuò)增出5個特異性的PCR片段,合成 與表1引物一致的野生型質(zhì)粒,并與G6PC的標(biāo)準(zhǔn)基因序列比對,確認(rèn)質(zhì)粒的正確性,作為檢 測分析中的標(biāo)準(zhǔn)品。
      [0038] 所述的試劑盒在檢測肝糖原累積癥I a型GP6C基因突變中的應(yīng)用。
      [0039] 具體的,所述應(yīng)用方法如下:
      [0040] (1)采集待測血液樣本,提取DNA ;
      [0041] ⑵以樣品DNA為模板,加入所述特異性引物和PCR反應(yīng)試劑,組成PCR反應(yīng)體系, 進(jìn)行PCR擴(kuò)增;
      [0042] (3)步驟(2)得到的PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行進(jìn)一步的測序,依據(jù)單基因遺傳病基因突變 數(shù)據(jù)庫或者對照標(biāo)準(zhǔn)品序列進(jìn)行分析,確定是否肝糖原累積癥I a型致病突變
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