與大白菜cca1基因編碼區(qū)突變相關(guān)的功能性標(biāo)記及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于蔬菜育種及分子遺傳學(xué)領(lǐng)域，具體涉及兩個(gè)與大白菜光周期調(diào)控關(guān)鍵 基因 CCAl編碼區(qū)突變的功能性分子標(biāo)記及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 大白菜（Brassica rapa L. ssp pekinensis)是十字花科重要的蔬菜作物，原產(chǎn)于 中國(guó)，在世界各地尤其是東南亞廣泛種植。目前，已經(jīng)育成了適合春、夏、秋不同季節(jié)栽培的 大白菜新品種，使得大白菜實(shí)現(xiàn)了周年供應(yīng)，這對(duì)保證蔬菜市場(chǎng)供應(yīng)、穩(wěn)定物價(jià)起到了積極 的作用。
[0003] 在不同季節(jié)栽培的大白菜品種中，春白菜對(duì)品種耐抽苔性的要求最高，主要是因 為春白菜栽培季節(jié)面臨前期環(huán)境低溫和后期環(huán)境日照較長(zhǎng)的影響。如果春白菜品種的耐 抽苔能力不強(qiáng)，則前期低溫極易使幼苗通過春化，導(dǎo)致后期葉球內(nèi)短縮莖較長(zhǎng)、甚或已經(jīng)抽 薹，從而影響產(chǎn)品的商品價(jià)值和品質(zhì)。所以，春白菜育種的關(guān)鍵是擁有極耐抽薹的育種材料 以及獲得與耐抽苔特性緊密連鎖的分子標(biāo)記，以提高春白菜的育種效率。
[0004] 目前，與大白菜抽薹開花相關(guān)的分子標(biāo)記報(bào)道主要有：【卓祖闖.大白菜耐抽薹性 狀遺傳規(guī)律分析及其分子標(biāo)記的篩選.西北農(nóng)林科技大學(xué)碩士學(xué)位論文；郁有健.大白菜 抽薹開花相關(guān)基因 SNP分析與晚抽苔開花性狀QTL定位.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文；高 穎，羅雙霞，王彥華，顧愛俠，趙建軍，陳雪平，申書興.大白菜抽薹開花時(shí)間與SSR和InDel 標(biāo)記的關(guān)聯(lián)分析.園藝學(xué)報(bào).2012, 39(6) : 1081-1089】，但上述研宄所得到的標(biāo)記要么是數(shù) 量性狀位點(diǎn)，要么連鎖程度不夠緊密，很難用于育種輔助選擇。因此，有必要尋找基于抽薹 開花途徑關(guān)鍵基因突變的位點(diǎn)特異性分子標(biāo)記，以提高選擇的精準(zhǔn)度。
[0005] 大白菜與模式植物擬南芥親緣關(guān)系較近，同屬于蕓薹屬，因此擬南芥抽薹開花機(jī) 制研宄的有關(guān)結(jié)果可以為大白菜相關(guān)研宄提供借鑒。對(duì)模式植物擬南芥的研宄結(jié)果表 明：植物開花受四條途徑控制，即自主途徑、赤霉素途徑、春花途徑和光周期途徑。四條途 徑并非彼此相互獨(dú)立，而是通過一些整合基因形成一個(gè)復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，協(xié)同控制擬南芥 的開花【徐雷，賈飛飛，王利琳.擬南芥開花誘導(dǎo)途徑分子機(jī)制研宄進(jìn)展.西北植物學(xué) 報(bào).2011，31 (5) : 1057-1065】。在光周期控制的開花途徑中，起關(guān)鍵作用的是光受體及其 介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)，擬南芥基因組中的光受體有3類，即光敏色素、隱花色素和向光色素，其 中光敏色素和隱花色素參與光周期調(diào)節(jié)的植物開花【趙淑清，羅志鵬，李昱.擬南芥光 周期調(diào)控開花的研宄進(jìn)展.山西大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版）.2009, 32 (2) :308-314】，其中 的光周期調(diào)節(jié)涉及相互連鎖的反饋環(huán)（Pruneda-Paz and Kay, An expanding universe of circadian networks in higher plants. Trends Plant Sci. 2010,15 :259-265)，起 關(guān)鍵作用的是光周期調(diào)控因子CCA1、LHY和T0C1。已有研宄表明，CCAl是一個(gè)MYB類 轉(zhuǎn)錄因子，其突變后直接影響擬南芥感受光周期的響應(yīng)能力，減少擬南芥的晝夜節(jié)律振 幅、縮短了光周期。所以，研宄CCAl基因?qū)α私夤庵芷谝蕾嚨闹参镩_花途徑有重大意 義。對(duì)CCAl的結(jié)構(gòu)分析表明：N端第11-82位氨基酸殘基是MYB結(jié)構(gòu)域，與DNA結(jié)合有關(guān) (Zhi-Yong Wang, David Kenigsbuch, Lin Sun,Eitan HareI, May S.Ong, Elaine M. Tobin, A Myb-Related Transcription Factor Is Involved in the Phytochrome Regulation of an Arabidopsis Lhcb Gene, The Plant Cell, 1997, 9, 491-507) ;N 端第 136-316 位氛 基酸殘基與蛋白二聚化有關(guān)；C端是磷酸化調(diào)節(jié)區(qū)（Xavier Daniel, Shoji Sugano, Elaine M. Tobin, CK2phosphorylation of CCAlis necessary for its circadian oscillator function in Arabidopsis，PNAS，2004, 101:3292 - 3297).因此關(guān)鍵區(qū)域氨基酸突變都有 可能影響上述功能區(qū)，從而影響其介導(dǎo)的光周期開花響應(yīng)。
[0006] 大白菜全基因測(cè)序工作已經(jīng)完成【W(wǎng)ang et al.，2011，the genome of the mesopolyploid crop species Brassica rapa. Nature Genetics. 43(10):1035-103)】， 通過與擬南芥全基因比較，其相關(guān)功能基因的預(yù)測(cè)和注釋也已完成并制作成BRAD數(shù)據(jù)庫 【Cheng F, Liu S, Wu J, Fang L, Sun S, Liu B, Li P, Hua ff, Wang X. BRAD, the genetics and genomics database for Brassica plants. BMC Plant Biol. 2011, 11:136】，其中對(duì)開花基 因的注釋有專門的檢索菜單。在大白菜基因組中有一個(gè)拷貝的CCAl編碼基因，位于第五 染色體。我國(guó)有適合不同季節(jié)栽培的大白菜種質(zhì)資源，其抽薹開花性狀差異較大，其中不 乏長(zhǎng)、短日照條件下開花時(shí)間存在顯著差異的材料，但至今未見有關(guān)光周期響應(yīng)調(diào)節(jié)因子 CCAl突變與開花時(shí)間的有關(guān)報(bào)道。
[0007] 插入/缺失多態(tài)性（Insertion/Deletion，InDel)標(biāo)記是由于同一位點(diǎn)處的DNA 序列在不同個(gè)體間發(fā)生了核苷酸片段的插入/缺失，根據(jù)目標(biāo)位點(diǎn)兩側(cè)的序列設(shè)計(jì)特異引 物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度多態(tài)性即是InDel標(biāo)記。由于這種標(biāo)記直接位于功能基 因內(nèi)部，有可能導(dǎo)致所編碼蛋白的結(jié)構(gòu)變異和功能差異，因此又稱為功能性標(biāo)記。InDel標(biāo) 記的檢測(cè)手段因插入片段大小而定，插入片段較大的（大于50bp) -般采用操作簡(jiǎn)單的瓊 脂糖凝膠頂用分離、而插入片段較小的（小于30bp) -般采用聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)，前 者操作簡(jiǎn)單、后者操作繁瑣。然而高分辨率瓊脂糖可以實(shí)現(xiàn)4-6bp差異片段的檢測(cè)。
[0008] 鑒于在模式植物擬南芥中發(fā)現(xiàn)的CCAl突變對(duì)抽薹開花時(shí)間影響的相關(guān)結(jié)果，推 測(cè)在大白菜中也存在類似突變控制的晚開花突變體資源，因此，有必要對(duì)我國(guó)豐富的大白 菜資源在CCAl位點(diǎn)進(jìn)行篩查，以發(fā)現(xiàn)各位點(diǎn)可能存在的突變類型；同時(shí)針對(duì)突變位點(diǎn)與野 生型的序列差異，開發(fā)與突變體檢測(cè)有關(guān)的位點(diǎn)特異性分子標(biāo)記。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 針對(duì)目前大白菜在CCAl基因位點(diǎn)突變體鑒定方面的空白，本發(fā)明的目的是提供 一種與大白菜CCAl基因編碼區(qū)突變相關(guān)的功能性標(biāo)記，以及用于鑒別上述功能性標(biāo)記的 引物。
[0010] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用下述技術(shù)方案：
[0011] 本發(fā)明首先對(duì)兩份開花時(shí)間存在顯著差異的大白菜自交系材料Hel02(長(zhǎng)、短日 照下開花早）和06-247(長(zhǎng)、短日照下開花晚）進(jìn)行全基因組重測(cè)序，從測(cè)序結(jié)果中分析發(fā) 現(xiàn)二者光周期響應(yīng)因子CCAl編碼區(qū)存在差異，即易抽薹大白菜資源Hel02中獲得的CCAl 基因編碼區(qū)存在小片段插入突變，與BRAD數(shù)據(jù)庫中Chiifu401大白菜的CCAl相比，其在編 碼區(qū)330bp和1416bp之后分別插入6個(gè)堿基。因此，可以開發(fā)成用于大白菜CCAl基因編 碼區(qū)突變檢測(cè)的功能性標(biāo)記。
[0012] 與大白菜CCAl基因編碼區(qū)突變相關(guān)的功能性標(biāo)記，包括：與區(qū)分5'端6bp插 入相關(guān)的功能性標(biāo)記，分別命名為5-InDel-W150(野生型）和5-InDel-ml56(突變體）， 5-InDel-W150(野生型）的片段大小為 150bp，如 SEQ ID No.l 所示，5-InDel-ml56(突變 體）的片段大小為156bp，如SEQ ID No. 2所示；
[0013] 與區(qū)分3'端6bp插入相關(guān)的功能性標(biāo)記，分別命名為3-InDel-W133(野生型）和 3-InDel-ml39(突變體），3-InDel-W133(野生型）的片段大小為133bp，如SEQIDNo·3所 示，3-InDel-ml39(突變體）的片段大小為139bp，如SEQ ID No. 4所示。
[0014] 用于鑒別5'端6bp插入相關(guān)的功能性標(biāo)記的引物為：
[0015] 正向引物 PF5 :5' -CTAAAGGTGTACCAGTGGCTCAA-3' ；（如 SEQ ID No. 5 所示）。
[0016] 反向引物 PR5 :5' -CAAGGGACTCTTTTCCATCATTC-3' ；（如 SEQ ID No. 6 所示）。
[0017] 用于鑒別3'端6bp插入相關(guān)的功能性標(biāo)記的引物為：
[0018] 正向引物 PF3 :5' -TTTACATATAAGAGAGAGGAGGGTCA-3' ；（如 SEQ ID No. 7