characterizationofStreptococcuspneumoniaetype 4, 6B, 8,and18Ccapsularpolysaccharidegeneclusters.InfectImmun2001, 69(3):1244-1255)。
[0112] 為了在大腸桿菌中重構(gòu)CPS4修飾的途徑，本發(fā)明人首先將CPS4基因簇口 也X及之間的基因)克隆至在大腸桿菌中表達(dá)的質(zhì)粒，產(chǎn)生PGVXN803。在第二個(gè)設(shè)置中，本發(fā) 明人只包括了轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因下游的基因（產(chǎn)生了PGVXN753)，S卩以明確地分析 rze的效果，以及rci/缺失的效果。Weil是根據(jù)生物信息學(xué)分析的磷酸 糖轉(zhuǎn)移酶同源物。相似活性在大腸桿菌中存在，特別是在腸道細(xì)菌共同抗原（ECA)簇中編 碼的red基因。在pGVXN753中，本發(fā)明人包括了多克隆位點(diǎn)上游的人工啟動(dòng)子序列，以確 認(rèn)插入基因的轉(zhuǎn)錄。
[0113] 為分析上文提及的質(zhì)粒在大腸桿菌中表達(dá)時(shí)的效果，本發(fā)明人使用PGVXN753 和PGVXN803轉(zhuǎn)化W3110AraaZ細(xì)胞。W3110AraaZ編碼WecA蛋白質(zhì)，其負(fù)責(zé) Und-PP-D-GlcNAc的合成但是不能制造Und-PP-D-GalNAc。后一脂質(zhì)連接的單糖是 CPS4簇的酶的期望的底物，所述CPS4簇應(yīng)當(dāng)完成CPS4RU。因此，除了CPS4簇質(zhì)粒以 外，本發(fā)明人提供了兩種不同的D-GlcNAc至D-GalNAc的差向異構(gòu)酶，Z3206(Rush JS,AlaimoC,RobbianiR,ffackerM,ffaechterCJ:Anovelepimerasethat convertsGlcNAc-P-P-undecaprenyltoGalNAc-P-P-undecaprenylinEscherichia coli0157.JBiolChem2010，285 (3) : 1671-1680)和GalE(LintonD,DorrellN, HitchenPG,AmberS,KarlyshevAV,MorrisHR,DellA,ValvanoMA,AebiM, WrenBff:FunctionalanalysisoftheCampylobacterjejuniN-linkedprotein glycosylationpathway.MolMicrobiol2005，55 (6): 1695-1703)。兩種基因編碼 允許體內(nèi)合成D-GalNAc的蛋白質(zhì)，前者通過脂質(zhì)連接的D-GlcNAc的差向異構(gòu)化作用 (Und-PP-D-GlcNAc〈->Und-PP-D-GalNAc)，和后者通過使用核苷酸活化的糖作為底物 (UDP-D-GlcNAc〈->UDP-D-GalNAc)。
[0114] 圖12顯示了分析的結(jié)果。細(xì)胞生長(zhǎng)并且誘導(dǎo)差向異構(gòu)酶表達(dá)，并且通過SDS-PAGE 將蛋白酶抗性生物量分離，并且在將糖脂轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜后通過免疫檢測(cè)分析。結(jié)果 顯示每當(dāng)PGVXN803存在于細(xì)胞中時(shí)，可通過抗CPS4抗血清檢測(cè)到梯狀信號(hào)。pGVXN753也 誘導(dǎo)了信號(hào)，盡管比含有轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因和rci/的構(gòu)建體更弱。差向異構(gòu)酶的誘導(dǎo)和性質(zhì) 輕微地影響了信號(hào)強(qiáng)度。最強(qiáng)反應(yīng)性用PGVXN803和對(duì)核苷酸活化的糖特異性的差向異構(gòu) 酶獲得，表明Weil是D-GalNAc-磷酸轉(zhuǎn)移酶。因此，關(guān)于CPS1令人驚訝地，轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因 對(duì)在大腸桿菌中CPS4修飾的LPS的有效生產(chǎn)是重要的。為仔細(xì)分析轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因相比于 rci/的影響，可以進(jìn)行在pGVX753存在下rci/的共表達(dá)。最可能地，單獨(dú)的rci/不能將 CPS4表達(dá)提高至存在轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因時(shí)觀察到的水平（S卩，在含有pGVX803的W3110AraaZ 中)。
[0115] 為進(jìn)一步表征在大腸桿菌中生產(chǎn)的CPS4,本發(fā)明人在大腸桿菌SCM6中表達(dá) pGVXN803(SchwarzF,Huangff,LiC，SchulzBL，LizakC，PalumboA，NumaoS，Neri D，AebiM，WangLX:Acombinedmethodforproducinghomogeneousglycoproteins witheukaryoticN-glycosylation.NatChemBiol2010;SCM6isdeletedinwecA, ECA，啦M)并且通過2-AB標(biāo)記和MS/MS分析進(jìn)行分析糖脂。2-AB標(biāo)記是開發(fā)以分離、水 解、修飾多糖和單糖并且通過HPLC和MS/MS對(duì)它們分析的方法。將細(xì)胞生長(zhǎng)過夜并且根據(jù) 已建立的程序制備和處理（US2011/0274720)。
[0116] 簡(jiǎn)而言之，通過有機(jī)溶劑(氯仿：甲醇：水10:10:3)將糖脂從生物量中提取，并且 經(jīng)過C18盒（cartridge)純化；使用TFA在水/異丙醇中處理洗脫物以水解焦磷酸鍵并且從 Und-PP-聚糖釋放聚糖部分。將產(chǎn)生的溶液經(jīng)過另一個(gè)C18盒以移除脂質(zhì)。將流通物（flow through)干燥并且使用2氨基苯甲酰胺在還原端標(biāo)記聚糖。通過HPLC使用gylcosepN正 相柱將產(chǎn)生的標(biāo)記的聚糖分離并且通過熒光檢測(cè)（US2011/0274720A1)。
[0117] 產(chǎn)生的色譜圖在圖13 (小圖A)中顯示。從含有或缺乏pGVXN803的SCM6細(xì)胞獲 得的色譜圖的比較顯示前者中存在而后者中缺乏的數(shù)個(gè)峰。它們中的一些通過MS/MS分 析，以鑒定聚糖同一性和序列。對(duì)于數(shù)個(gè)峰，可以鑒定與預(yù)期的CPS4RU和聚合物結(jié)構(gòu)一致 的MS/MS模式(通過箭頭指示)。圖13的小圖B顯示了在53. 8分鐘洗脫的峰的MALDI-MS/ MS譜。碎片離子系列與在非還原己糖處用丙酮酸修飾的CPS4RU-致。
[0118] 本發(fā)明人觀察到由于丙酮酸的非化學(xué)計(jì)量的存在的異質(zhì)性，指示了具有丙酮酸的 CPS4重復(fù)單元的非定量修飾或在樣品制備期間的水解。本發(fā)明人從數(shù)據(jù)總結(jié)本發(fā)明人能夠 產(chǎn)生在Und-PP上生產(chǎn)CPS4聚糖的修飾的LPS生物合成途徑。
[0119] 為進(jìn)一步分析CPS4糖脂，本發(fā)明人從大腸桿菌SCM3菌株提取糖脂（Faridmoayer A,FentabilMA,MillsDC,KlassenJS,FeldmanMF:Functionalcharacterization ofbacterialoligosacchary1transferasesinvolvedin〇-linkedprotein glycosylation.JOURNALOFBACTERIOLOGY2007，189(22) :8088-8098)，所述菌株表達(dá) CPS4,并且如上文描述的分析它們（圖14)，或直接地使用糖脂用于體外糖基化。在該實(shí) 驗(yàn)中，將糖脂、含有N糖基化共有序列的受體肽和寡糖基轉(zhuǎn)移酶PglB的純化制備物混合 (JervisAJ,ButlerJA,LawsonAJ,LangdonR,WrenBff,LintonD:Characterization ofthestructurallydiverseN-linkedglycansofCampylobacterspecies.JOURNAL OFBACTERIOLOGY2012, 194(9) :2355-2362)。形成糖肽，其可以通過HILIC色譜（圖 15,小 圖A和B)隨后通過ESI-MS/MS用于聚糖測(cè)序來分析。當(dāng)分析來自這樣的實(shí)驗(yàn)的產(chǎn)物時(shí)，鑒 定到連接至肽的唯一的丙酮酸化聚糖（圖15,小圖C和D)。因此，在圖13和14中觀察到的 非化學(xué)計(jì)量的丙酮酸化最可能來源于在樣品制備期間從聚糖的丙酮酸水解而不是CPS4RU 的非定量修飾（non-quantitativedecoration)。因此，本發(fā)明人斷言通過修飾的LPS生物 合成途徑，其可能在允許有活性的并且可能相比化學(xué)綴合更好的綴合物合成的天然環(huán)境下 生產(chǎn)CPS。
[0120] 為測(cè)試該假設(shè)，本發(fā)明人以在臨床前測(cè)定中測(cè)試糖綴合物為目標(biāo)。在第一個(gè)步 驟中，本發(fā)明人使用微生物發(fā)酵以生產(chǎn)綴合至一般載體蛋白（銅綠假單胞菌的遺傳脫毒 的外毒素4化?4，1^2011/0274720 41))的0?34。使用口6￥乂陽(yáng)39(表達(dá)編碼21^糖基化 共有序列的EPA載體蛋白（US2011/0274720A1 和dyx)，在pACT3 (GenBank:U51556.1) 中克隆，其中cA說盒由卡那霉素抗性盒（々aa?)替換）；pGVXN114 (可誘導(dǎo)表達(dá)PglB， US2011/0274720Al)、pGVXN207 (可誘導(dǎo)表達(dá)GalE，（RushJS,AlaimoC,RobbianiR， ffackerM,ffaechterCJ:AnovelepimerasethatconvertsGlcNAc-P-P-undecaprenyl toGalNAc-P-P-undecaprenylinEscherichiacoli0157.JBiolChem2010, 285(3):1671-1680))和口6￥乂呢03(編碼0?34簇）轉(zhuǎn)化大腸桿菌13110八 (^以。細(xì)胞在丁8 培養(yǎng)基中生長(zhǎng)并且在合適的〇D誘導(dǎo)并且過夜進(jìn)行生產(chǎn)。從通過使用溶菌酶隨后IMAC的周 質(zhì)提取制備的周質(zhì)提取物中純化His標(biāo)簽化的EPA。洗脫級(jí)分的分析測(cè)定在圖16中顯示。 SDS-PAGE和考馬斯亮藍(lán)染色顯示在70和大于70kDa處的非糖基化的和糖基化的EPA，后者 以指示由RU構(gòu)成的(修飾的)0抗原聚糖的梯狀圖案存在（圖16,小圖A)。在相同級(jí)分電轉(zhuǎn) 移至硝酸纖維素膜后通過抗His(圖16,小圖B)和抗CPS4 (圖16,小圖C)的免疫檢測(cè)確認(rèn) 了材料中CPS4和EPA的存在。
[0121] 糖綴合物通過用于分離非糖基化和糖基化的EPA的陰離子交換色譜進(jìn)一步純化； 糖蛋白隨后通過尺寸排阻色譜進(jìn)一步純化。分析產(chǎn)生的糖蛋白制備物的單糖組成，其使用 通過1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮的衍生化作用（PMP，LvL，YangX，ZhaoY，RuanY， YangY,WangZ:Separationandquantificationofcomponentmonosaccharidesof theteapolysaccharidesfromGynostemmapentaphyllumbyHPLCwithindirectUV detection. 2009，112:742 - 746)，其證明重組糖綴合物的聚糖組成與 從肺炎鏈球菌分離的CPS4是相同的（圖17)。
[0122] 為測(cè)試糖綴合物的疫苗活性，進(jìn)行了免疫研究和調(diào)理吞噬測(cè)定（OPA)。0PA是公認(rèn) 的針對(duì)用于消除肺炎鏈球菌細(xì)胞的抗體的功能性的測(cè)定并且是用于保護(hù)的替代品。本發(fā) 明人使用不同劑量的EPA-CPS4綴合物免疫兔。作為對(duì)照，本發(fā)明人使用Prevenar13,其 是廣泛用于小兒肺炎球菌疾病預(yù)防的許可的和銷售的產(chǎn)品。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方案通過用于免疫原 性的斑點(diǎn)印跡（圖18)和用于功能性的0PA將產(chǎn)生的抗血清進(jìn)行分析（Romero-SteinerS, FraschCE,Car1oneG,FleckRA,GoldblattD,NahmMH:Useofopsonophagocytosis forserologicalevaluationofpneumococcalvaccines.ClinVaccineImmunol 2006，13 (2):165-169)。
[0123] 表1顯示了獲得的相關(guān)調(diào)理素滴度。結(jié)果顯示在調(diào)理吞噬測(cè)定中提升抗血清活性 的能力方面，在大腸桿菌中重組制備的糖綴合物同樣好并且在一些情況下甚至優(yōu)于許可的 疫苗比較物。
[0124] 實(shí)施例3 :在大腸桿菌中CPS14綴合物的合成 為進(jìn)一步顯示大腸桿菌可以用于CPS綴合物的生產(chǎn)，本發(fā)明人以生產(chǎn)CPS14綴合物為 目標(biāo)。CPS14多糖由如CPS1和CPS4相似的結(jié)構(gòu)的CPS14簇（圖19)編碼。CPS14由聚合 的RU和以下結(jié)構(gòu)（圖 20)組成：-1，6-(b-D-Gal-l, 4)-b-D-GlcNAc-l, 3-b-D-Gal-l, 4-b-D-G lC-o
[0125] CPS14的生物合成從通過WchA活性將磷酸-D-Glc添加至十一異戊烯磷酸 (Und-P)開始。WchA生物化學(xué)上顯示為磷酸-葡萄糖轉(zhuǎn)移酶，具有如由莢膜異多糖酸簇中 基因編碼的大腸桿菌WcaJ蛋白同樣的活性。D-Glc進(jìn)一步的延長(zhǎng)通過在簇中存在的其他 糖基轉(zhuǎn)移酶的酶促作用實(shí)現(xiàn)（KolkmanMA,vanderZeijstBA,NuijtenPJ:Functional analysisofglycosyltransferasesencodedbythecapsularpolysaccharide biosynthesislocusofStreptococcuspneumoniaeserotype14.JBiolChem 1997，272 (31) : 19502-19508)。將CPS14 簇中不同 0RF的詳細(xì)功能預(yù)測(cè)為wzg、wzh、wzd、 wze(調(diào)節(jié)子和3個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因）、WchJK(D-Gal轉(zhuǎn)移酶）、WchL(D-GlcNAc轉(zhuǎn)移酶）、 WchM(D-Gal轉(zhuǎn)移酶）、Wzy(聚合酶）、Wzx(翻轉(zhuǎn)酶hWciY對(duì)CPS14形成是非必要 的，而『cAA缺失負(fù)面影響了CPS14 產(chǎn)量（KolkmanMA，WakarchukW，NuijtenPJ，van derZeijstBA:CapsularpolysaccharidesynthesisinStreptococcuspneumoniae serotype14:molecularanalysisofthecompletecpslocusandidentification ofgenesencodingglycosyltransferasesrequiredforthebiosynthesisofthe tetrasaccharidesubunit. 1997，26(1): 197-208)。CPS14 族在這一意 義上是特別的：存在比CPS14生物合成最少所需更多的編碼的功能。最有可能地，一些具有 未分配功能的蛋白質(zhì)是支持莢膜生物合成的輔助酶。
[0126] 為測(cè)試在大腸桿菌中CPS14多糖的生產(chǎn)，將由至rci戒]一段序列組成 的CPS14 基因簇克隆至pDOC供體質(zhì)粒（LeeDJ,BingleLE,HeurlierK,PallenMJ， PennCff,BusbySJ,HobmanJL:Genedoctoring:amethodforrecombineeringin laboratoryandpathogenicEscherichiacolistrains.BMCMicrobiol2009, 9:252) (所述質(zhì)粒指定將CPS14整合至016抗原簇（pGVXN615))中，并且轉(zhuǎn)化至大腸桿菌菌株 GVXN1128 (W3110AraaZ)。經(jīng)蛋白酶K消化的攜帶pGVXN615的大腸桿菌細(xì)胞的免疫印跡 分析顯示了梯狀圖案，其使用用于臨床CPS14分離物的莢膜血清分型的CPS14抗血清檢測(cè) (圖21插圖，小圖A)。此外，為積累單一的重復(fù)單元，通過轉(zhuǎn)座子突變將在pGVXN615中的 CPS14簇的聚合酶r幻缺失，產(chǎn)生pGVXN643。將糖脂從使用pGVXN643轉(zhuǎn)化的大腸桿菌細(xì)胞 中提取，并且在如上文描述的水解和熒光標(biāo)記后通過NP-HPLC分析。特異的峰從glycosepN 柱在57. 4分鐘洗脫（圖21，小圖A)。對(duì)該峰的MS和MS/MS分析與CPS14的單一重復(fù)單元的 預(yù)期質(zhì)量和碎裂圖形相匹配（圖21，小圖B)。這確認(rèn)了在0抗原啟動(dòng)子的控制下部分CPS14 基因簇的表達(dá)可以導(dǎo)致在共同的大腸桿菌宿主細(xì)胞中的重組LPS生物合成的CPS14寡糖生 產(chǎn)。
[0127] 為了改善和穩(wěn)定CPS14多糖在大腸桿菌中的生物合成，將含有從至rci/ 的一段序列的部分CPS14簇克隆至pD0C-C替換質(zhì)粒中（LeeDJ,BingleLE,Heurlier K,PallenMJ,PennCff,BusbySJ,HobmanJL:Genedoctoring:amethodfor recombineeringinlaboratoryandpathogenicEscherichiacolistrains. BMCMicrobiol2009，9:252)，其被指定將CPS14整合入大腸桿菌莢膜異多糖酸簇 (PGVXN710)。CPS14的整合在數(shù)個(gè)大腸桿菌菌株中完成，其包括如上文描述的GVXN1052 (W3110)、GVXN1128 (W3110AWaaL)和GVXN1716 (W3110AWaaLAwecA_wzzE)。已經(jīng)顯 示在正常條件下莢膜異多糖酸基因不在大腸桿菌中表達(dá)，并且它們的表達(dá)通過調(diào)節(jié)子的 復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)控制。鑒定了莢膜異多糖酸的轉(zhuǎn)錄需要正調(diào)節(jié)子RcsA(EbelW,TrempyJE. J Bacteriol. 1999;181(2):577-84)。經(jīng)蛋白酶K消化的攜帶用于RcsA表達(dá)的質(zhì)粒 (PGVX688)的大腸桿菌菌株的免疫印跡分析顯示了由CPS14抗血清(其用于臨床CPS14分離 物的血清分型）檢測(cè)的梯狀圖案，在所述大腸桿菌菌株中由CPS14簇替換莢膜異多糖酸簇； 該圖案在不存在RcsA下是不可檢測(cè)的(參見圖22)。該結(jié)果證明莢膜異多糖酸是整合多糖 生物合成途徑的合適靶位置，并且異源多糖的表達(dá)通過大腸桿菌RcsA蛋白質(zhì)嚴(yán)格控制。
[0128] 為了進(jìn)一步表征在大腸桿菌中產(chǎn)生的CPS14,將GVX6129 (W3110AwaaL CA: :CPS14)與pGVXN688 (rcsA) -同轉(zhuǎn)化至大腸桿菌。通過如上文描述的2-AB標(biāo)記和MS/ MS分析對(duì)糖脂進(jìn)行分析。MS/MS分析鑒定了CPS14的2個(gè)和3個(gè)亞基，分別在95. 9分鐘和 115. 3分鐘洗脫(參見圖24)。
[0129] 為測(cè)試在大腸桿菌中轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的表達(dá)對(duì)生產(chǎn)CPS14多糖的效果，將含有轉(zhuǎn)運(yùn) 蛋白基因的肺炎鏈