A，3 μ I ddH20, PCR 擴(kuò)增反應(yīng)條件，分三 段：94°C lmin;94°C 30sec，60°C 30sec，72°C lmin，共 30cycle;72°C lOmin。使反應(yīng)后的 樣品迅速冷卻，點(diǎn)入I %瓊脂糖電泳膠，60V約25分鐘后凝膠掃描拍照，如圖2所示。
[0058] 4.免疫沉淀
[0059] 1)、免疫沉淀之前，預(yù)留出步驟2中得到的片段化的RNAlO μ g作為免疫沉淀對照 組（Input)。
[0060] 2)、洗滌免疫磁珠 （CaptivA PriMab 蛋白 A，CPA):取 200 μ I CPA 磁珠于 Iml 的 IP 緩沖液（IX)中，洗滌兩次。洗滌方法為4°c搖勻2h，5000g離心lmin，棄上清；再加入1ml 0. 5mg/ml BSA后于4°C搖勾2h，5000g離心lmin，棄上清；最后加入1ml的IP緩沖液（I X)， 4 °C儲存?zhèn)溆谩?br>[0061] IP 緩沖液（5 X) :0.5mL IM Tris-HCl(pH = 7.4)，1.5mL 5M NaCl，0.5ml (10 % vol/vol)的 Igepal CA-630 (Sigma-Aldrich, cat. no. 18896)，DEPC 水定容到 10mL。
[0062] 備注說明：使用前將IP緩沖液（5X)加入4體積倍的DEPC水稀釋，得IP緩沖液 (1Χ)〇
[0063] 3)、RNA與抗體共孵育：按以下反應(yīng)體系進(jìn)行操作（試驗(yàn)組所用抗體為m6A特異性 抗體（Anti-N 6-methyladenosine)購自 Synaptic Systems ;陰性對照組抗體為 Polyclonal rabbit antibody (PRA)，購自Santa Cruz)，混合后搖床上4°C搖勾過夜；
[0064] 免疫沉淀反應(yīng)體系
[0066] 備注說明：RNA 酶抑制劑為 RNasin Plus RNase inhibitor (Promega, cat-no. N2611) ， RVC 為 Ribonucleoside vanadyl complexes(RVC ；200Mm ；Sigma-Aldrich, cat. no. R3380)〇
[0067] 4)、磁珠與RNA-抗體共孵育：加入100 μ I洗滌過的磁珠（上述步驟2)所得）， 4°C搖勻2h，離心收集磁珠，用Iml RNase-free的IP緩沖液（I X)洗滌磁珠三次，每次搖勻 5min，1000 g離心Imin富集磁珠。
[0068] 5)、洗脫：將上述步驟4)中富集的磁珠，加入300 μ 1洗脫緩沖液及4. 2 μ 1蛋白酶 k(20mg/ml，Sigma)。50°C水浴I. 5h，5000g離心lmin，將上清轉(zhuǎn)移至新管，操作中不得觸動 磁珠。加入300 μ 1體積比為25:24:1的酚：氯仿：異戊醇，700 μ 1的無水乙醇和5 μ 1質(zhì)量 濃度為2%的糖原，在-80°C冰箱中沉淀過夜，15, OOOg離心15min收集RNA沉淀，75%乙醇 洗滌兩遍，在吸水紙上晾干，溶解在20 μ 1的DEPC水中。
[0069] 備注：洗脫緩沖液：1M Tris-HCKpH= 7. 4)500 μ 1、0· 5Μ EDTA(pH = 8. 0)200 μ 1、 0. 05g 的 SDS，用 DEPC 水定容至 100mL。
[0070] 5、m6A Blot
[0071 ] 1)分別取步驟1中提取的總RNA、步驟2中經(jīng)95°C *3min片段化的RNA、步驟4中 經(jīng)m6A抗體沉淀洗脫回收的RNA及PRA抗體沉淀洗脫回收的RNA各200ng，稀釋至4 μ 1體 積，95°C加熱3min變性，迅速置于冰上冷卻，各取2 μ 1點(diǎn)樣于硝酸纖維素膜上。
[0072] 2)用UV紫外交聯(lián)儀（1500*100J/Cm2)將mRNA固定到膜上，用I X TBST緩沖液搖 床上洗膜5min。
[0073] 3)以5% (質(zhì)量％ )的脫脂奶粉的TBST溶液作為封閉液，用上述封閉液封閉 1-1. 5h。然后將膜放于HI6A抗體（2. 5 μ g溶于5ml的封閉液）中室溫孵育lh，再在TBST緩 沖液中洗膜3次*5min ;
[0074] 4)放入羊抗兔二抗（1 μ 1溶于5ml的封閉液）中室溫孵育I. 5h，TBST緩沖液洗 膜3次*5min，使用ECL化學(xué)發(fā)光檢測試劑孵育，成像儀曝光拍照。
[0075] 結(jié)果如圖3所不，經(jīng)m A抗體免疫丨幾丨疋的RNA (m A-IP)點(diǎn)的顏色最深，未經(jīng)免疫》幾 淀的片段化RNA (Input)與總RNA的點(diǎn)顏色相近，而免疫沉淀的陰性對照（PRA-IP)幾乎檢 測不到m6A特異結(jié)合。
[0076] 6、實(shí)時熒光相對定量PCR
[0077] 將免疫沉淀對照組（Input)和免疫沉淀試驗(yàn)組（m6A-IP)的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，按 常規(guī)熒光定量PCR步驟操作。以Hi 6A-IP和Input的靶基因 Ct差值作為參照，結(jié)果分析采用 2 μ" 的方法，其中 ΔΔ α 的計算公式如 ^ :ΔΔ α =肋· ip_Ctinput)x「(Ctm6A ip_ctin_) X2
[0078] Xl和X2表示待比較的任意兩個樣本，通過上述公式計算出Xl相對于X2的靶基因 甲基化相對水平。
[0079] 結(jié)果如圖4所示，得到兩個豬肝樣本C/EBP α基因 m6A相對水平。
[0080] 本實(shí)例選用21日齡（樣品1)和180日齡（樣品2)的豬肝組織RNA做為樣品進(jìn) 行檢測，樣品2與樣品1的C/ΕΒΡα基因的甲基化相對水平是1. 16。
[0081] 驗(yàn)證試驗(yàn)1、以實(shí)施例1中的豬肝樣品，按照目前mRNA甲基化水平的測定法一二 代測序方法進(jìn)行檢測，將正常片段化的RNA樣品（MeRIP)和等量經(jīng)免疫共沉淀后的RNA樣 品分別進(jìn)行二代測序，利用生物信息學(xué)軟件比對兩種測序結(jié)果在同一參考基因區(qū)域內(nèi)的 reads數(shù)，分析m6A峰分布在基因組上的位置，并對其進(jìn)行基因注釋，找到C/EBP α基因； 對參與比較的兩個樣品m6A峰區(qū)域內(nèi)reads標(biāo)準(zhǔn)化處理，比較兩個樣本在C/ΕΒΡα基因 的m6A峰個數(shù)及對應(yīng)讀數(shù)，得到樣品2與樣品1的豬的C/EBPa基因的甲基化相對水平為 I. 1-1. 3,與本發(fā)明相符，證明本發(fā)明的正確性。
[0082] 驗(yàn)證試驗(yàn)2、不以本實(shí)驗(yàn)引物設(shè)計方法設(shè)計，而是以常規(guī)引物設(shè)計方法設(shè)計引物序 列如下：C/EBPa -F :GGITTCGGGTCGCTGGATCTCTAG
[0083] C/EBP a -R ：ACGGCCTGACTCCCTCATCTTAGAC
[0084] 以實(shí)施例1中的豬肝樣品，其他步驟均同前，結(jié)果顯示無法在免疫沉淀后的樣品 中得到有效擴(kuò)增，無法得到豬的C/EBPa基因的靶基因甲基化相對水平的結(jié)果。
[0085] 最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的若干個具體實(shí)施例。顯然，本發(fā) 明不限于以上實(shí)施例，還可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開的內(nèi)容 直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【主權(quán)項】
1. 單個基因mRNA甲基化水平檢測方法中所用的引物，其特征是： 靶基因?yàn)镃/EBPa基因， 引物為： C/EBP a -P2F gacacggtgcgtctaagatgag C/EBPa-P2R tcggagcggtgagtttgc。2. 單個基因mRNA甲基化水平檢測方法，其特征是：包括以下步驟： 1) 、設(shè)計靶基因甲基化區(qū)域的熒光定量引物：根據(jù)NCBI上提供的靶基因mRNA全長序 列，在涵蓋⑶S區(qū)結(jié)束段及3' UTR區(qū)甲基化高度保守的RRACH序列區(qū)域設(shè)計熒光定量PCR 引物； 2) 、提取總RNA，用化學(xué)斷裂法將總RNA片段化為RNA片段； 3) 、將步驟2)得到的片段化的RNA通過特異性識別m6A的抗體將帶有m6A位點(diǎn)的所有 mRNA片段沉淀下來，并用瓊脂糖磁珠進(jìn)行收集富集； 4) 、將步驟3)中抗體富集得到的mRNA片段反轉(zhuǎn)錄，用步驟1)的熒光定量PCR引物進(jìn) 行實(shí)時熒光定量PCR，即可得到含甲基化的靶基因相對表達(dá)量，相對表達(dá)量的高低就代表了 單個基因mRNA甲基化水平高低。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的單個基因mRNA甲基化水平檢測方法，其特征是： 靶基因?yàn)镃/EBPa基因， 引物序列如下： C/EBP a -P2F gacacggtgcgtctaagatgag C/EBPa-P2R tcggagcggtgagtttgc。4. 根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的單個基因mRNA甲基化水平檢測方法，其特征是： 所述步驟2)的化學(xué)斷裂法中， RNA片段化體系為： RNA(1 yg/yl) 180 yl， 片段化緩沖液（IOX)20y I ; 孵育溫度和時間為以下任意一種： TOtCdminJOcCjmindScCdmin 和 95 cC、5min。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種單個基因mRNA甲基化水平檢測方法，包括以下步驟：1)、設(shè)計靶基因甲基化區(qū)域的熒光定量引物；2)、提取總RNA，用化學(xué)斷裂法將總RNA片段化為RNA片段；3)、將步驟2)得到的片段化的RNA通過特異性識別m6A的抗體將帶有m6A位點(diǎn)的所有mRNA片段沉淀下來，并用瓊脂糖磁珠進(jìn)行收集富集；4)、將步驟3)中抗體富集得到的mRNA片段反轉(zhuǎn)錄，用步驟1)的熒光定量PCR引物進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR，即可得到含甲基化的靶基因相對表達(dá)量，相對表達(dá)量的高低就代表了單個基因mRNA甲基化水平高低。
【IPC分類】C12Q1/68, C12N15/11
【公開號】CN105018617
【申請?zhí)枴緾N201510429231
【發(fā)明人】汪以真, 王新霞, 江芹, 蔡旻
【申請人】浙江大學(xué)
【公開日】2015年11月4日
【申請日】2015年7月20日