一種多孔磁性微球及其固定化酶載體的制備和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種多孔磁性微球固定化酶載體的制備方法，屬于多孔磁性微球及固定化酶的制備技術(shù)。
【背景技術(shù)】
[0002]近年來，由于酶在精細化工合成、生物傳感器、藥物和生物燃料電池等領(lǐng)域的應(yīng)用，固定化酶引起了廣泛的重視。相對于游離酶而言，固定化酶具有操作穩(wěn)定性好，易于回收和再利用等優(yōu)點。目前，固定化酶載體主要分為納米材料(納米顆粒、納米管等)，微米材料(微球、微囊等)和凝膠。其中，多孔磁性微球用于固定化酶載體具有明顯的優(yōu)勢:發(fā)達的孔結(jié)構(gòu)有利于降低傳質(zhì)阻力，提高酶催化活性；獨特的磁響應(yīng)特性有利于簡化分離過程，促進酶的回收利用。
[0003]多孔磁性微球的制備方法主要分為懸浮聚合法、種子溶脹法、原位法等。其中懸浮聚合法和種子溶脹法需有機溶劑作為致孔劑或溶脹劑，且制備過程較為繁瑣。原位法多為高溫高pH條件下在多孔微球表面及孔結(jié)構(gòu)中原位合成磁性納米粒子或在微球中合成磁性納米粒子后采用致孔方法(例如煅燒)獲得孔結(jié)構(gòu)。這些制備過程均較繁瑣，且制備條件較為苛刻。因此，亟需開發(fā)一種溫和的、綠色的、通用的多孔磁性微球的制備方法。
[0004]多孔CaCO3微球不僅易于合成，具有良好的生物相容性，粒徑相對均勻，而且可在溫和條件下，通過與Η)ΤΑ的螯合作用或弱酸條件而去除。此外，CaCO3微球可包埋各種客體分子及其發(fā)達的孔結(jié)構(gòu)可為容納客體分子提供較大的比表面積和更多的吸附位點。試想將其作為反向復(fù)制的模板，將多孔微球的制備提供一種綠色、溫和、高效的方法。研究表明，以CaCO3為模板，可成功通過反向復(fù)制法構(gòu)建3D多孔微球。但基于CaCO 3微球反向復(fù)制技術(shù)，同時實現(xiàn)功能性和磁性的多孔微球暫時還沒有報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]針對現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明提供一種多孔磁性微球及其固定化酶載體的制備，該方法制備過程簡便，制備條件溫和綠色，所得磁性微球具有多孔特性，應(yīng)用于固定化酶獲得高的酶負載量(343.3mg酶/g載體)，高的相對酶活力(43.4% )及高NADH轉(zhuǎn)化率(95.5%),通過改變微球制備過程中多巴胺濃度和攪拌速度可實現(xiàn)多孔微球形貌的調(diào)控。
[0006]本發(fā)明提出的一種多孔磁性微球的制備方法，其特征在于，包括以下步驟:
[0007]步驟一、向濃度為0.2?0.5M的氯化鈣溶液中加入Fe3O4納米顆粒配成溶液A ;配制和氯化鈣溶液等摩爾濃度的碳酸鈉溶液，在2000?3000r/min的轉(zhuǎn)速下將碳酸鈉溶液迅速倒入等體積的溶液A中，反應(yīng)20?30秒，去離子水和Tris-HCl緩沖液洗滌，在外加磁場條件下分離，得到Fe3O4納米顆粒摻雜的多孔CaCO 3微球；
[0008]步驟二、配制多巴胺質(zhì)量濃度為2?8mg/ml的溶液B，其中所用的緩沖液為pH8.5，濃度為50mM的Tris-HCl緩沖液；按照體積質(zhì)量比為1:6將多巴胺溶液與步驟一制得的Fe3O4納米顆粒摻雜的多孔CaCO 3微球均勾混合，攪拌5?8h，通過外部磁場分離、水洗至上清液為無色，得到多巴胺-Fe3O4納米顆粒摻雜的多孔CaCO3微球；
[0009]步驟三、配制濃度為50mM的乙二胺四乙酸溶液，記為溶液C，將溶液C與步驟二制得的多巴胺-Fe3O4納米顆粒摻雜的多孔CaCO 3微球均勻混合，去除碳酸鈣，外部磁場分離，去離子水洗滌至上清液中不含乙二胺四乙酸，得到多孔Fe3O4-多巴胺微球。
[0010]本發(fā)明提出的一種多孔磁性微球固定化酶的制備方法，是:配制I?4mg/ml醇脫氫酶溶液，記為溶液D，將溶液D與上述多孔磁性微球的制備方法制備的多孔Fe3O4-多巴胺微球均勻混合，混合比例為體積質(zhì)量比1: 2，攪拌2?3h得到固定化醇脫氫酶的多孔Fe3O4-多巴胺微球，即為多孔磁性微球固定化酶。
[0011]本發(fā)明一種多孔磁性微球固定化酶的應(yīng)用，其過程是，將還原型輔酶I (NADH)溶解于Tris-HCl緩沖液配成NADH摩爾濃度為50?150 μ M的溶液Ε，按照摩爾比10?20:1，將溶液E與甲醛溶液混合均勻制得酶催化反應(yīng)液F。將本發(fā)明中制備得到的多孔磁性微球固定化酶載體加入反應(yīng)液F反應(yīng)3?5min，檢測反應(yīng)液中NADH吸光值的變化，其酶負載量為130?350mg酶/g載體，相對酶活力為26.1?43.4%，NADH轉(zhuǎn)化率為57.1?95.5%，通過改變微球制備過程中多巴胺濃度和攪拌速度實現(xiàn)多孔微球形貌的調(diào)控。
[0012]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提出的一種多孔磁性微球制備及其固定化酶的方法，過程簡便，條件溫和，避免有機溶劑和高溫高PH的制備條件；所得磁性微球具有多孔特性，應(yīng)用于固定化酶獲得高的酶負載量(343.3mg酶/g載體)，高的相對酶活力(43.4% )及高NADH轉(zhuǎn)化率(95.5% )，通過改變微球制備過程中多巴胺濃度和攪拌速度可實現(xiàn)多孔微球形貌的調(diào)控。
【附圖說明】
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[0013]圖1為實施例3制備的多孔Fe3O4-多巴胺微球掃描電鏡(SEM)照片。
[0014]圖2為實施例3制備的多孔Fe3O4-多巴胺微球透射電鏡(TEM)照片。
[0015]圖3為實施例3制備的多孔Fe3O4-多巴胺微球氮氣吸附-脫附及孔徑分布(BET)曲線；
[0016]圖4為實施例1制備的多孔Fe3O4-多巴胺微球掃描電鏡(SEM)照片；
[0017]圖5為對比例I制備的巴胺涂覆Fe3O4的納米粒子掃描電鏡(SEM)照片；
[0018]圖6為實施例3和對比例I制備的固定化酶載體的NADH轉(zhuǎn)化率曲線。
【具體實施方式】
[0019]下面結(jié)合附圖和具體實施例對本發(fā)明技術(shù)方案作進一步詳細描述，所描述的具體實施例僅對本發(fā)明進行解釋說明，并不用以限制本發(fā)明。
[0020]實施例1
[0021]步驟一、向濃度為0.33M的氯化鈣溶液中加入Fe3O4納米顆粒配成溶液A ;配制和氯化鈣等摩爾濃度的碳酸鈉溶液，在2000r/min的轉(zhuǎn)速下將碳酸鈉溶液迅速倒入等體積的溶液A中，反應(yīng)30秒，去離子水和Tris-HCl緩沖液洗滌，在外加磁場條件下分離，得到Fe3O4納米顆粒摻雜的多孔CaCO3微球；
[0022]步驟二、配制多巴胺質(zhì)量濃度為2mg/ml的溶液B，其中，Tris-HCl緩沖液，pH8.5，50mM。將10ml多巴胺溶液與步驟一制得的Fe3O4納米顆粒摻雜的多孔CaCO 3微球均勻混合，攪拌5h，通過外部磁場分離水洗至上清液為無色，得到多巴胺-Fe3O4納米顆粒摻雜的多孔CaCO3微球；
[0023]步驟三、配制50mM乙二胺四乙酸(EDTA)溶液，記為溶液C，將溶液C與步驟二制得的多巴胺-Fe3O4納米顆粒摻雜的多孔CaCO 3微球微球均勻混合去除碳酸鈣，外部磁場分離，去離子水洗滌至上清液中不含Η)ΤΑ，得到多孔Fe3O4-多巴胺微球，其多孔Fe3O4-多巴胺微球的粒徑為4.5 μπι，比