-Ile-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-Cys 當C末端為羧基是，選擇王樹脂進行多肽的化學固相合成。合成結(jié)束后，將得到的側(cè)鏈 保護基的多肽樹脂進行裂解，GLP-2C的C末端從樹脂上斷裂下來形成羧基。當多肽C末端 為酰胺時，選擇Fmoc-PAL-PEG-PS樹脂進行多肽的化學固相合成。合成結(jié)束后，將得到的側(cè) 鏈保護基的多肽樹脂進行裂解，GLP-2C的C末端從樹脂上斷裂下來形成酰胺。
[0032] 以上固相合成是在ABI公司的多肽合成儀上進行。首先將C末端的半胱氨酸連接 樹脂，然后一個一個的氨基酸從C末端向N段進行。待合成結(jié)束后，脫保護基和從樹脂上斷 裂后，用反相HPLC層析（Waters，C18制備柱）對GLP-2類似物進行純化。純化條件為A相 含0. 5% (V/V)乙酸的水溶液，B相為含80%乙腈和0. 5% (V/V)乙酸的水溶液，0-100%B液 梯度洗脫。收集目的多肽，經(jīng)凍干形成干粉。
[0033] 實例2、GLP-2C在大腸桿菌中的重組制備 根據(jù)實例1中GLP-2C的氨基酸序列，采用大腸桿菌偏愛密碼子設計其cDNA序列，由 大連寶生生物公司全基因人工合成。將合成的cDNA片段(插入pMB-19T質(zhì)粒中），用BamH2 和HindIII雙酶切后回收，將重組融合表達pMAL-c2X質(zhì)粒同樣雙酶切后回收大片段。在 T4連接酶作用下，將GLP-2C基因片段和pMAL-c2X連接后轉(zhuǎn)化DH5a菌。經(jīng)平板篩選出含 插入GLP-2C基因的重組質(zhì)粒命名為pMAL-c2X-(GLP-2C)。再用CaCl2法轉(zhuǎn)化表達宿主菌 BL21(DE3)中，獲及重組表達菌株，經(jīng)ImMol/LIPTG誘導表達產(chǎn)生MBP-NPC的融合蛋白。該融 合蛋白經(jīng)Ni-Sepharose層析純化后，用腸激酶酶切除去MPB(堿性髓鞘蛋白），再用C18反 相柱純化GLP-2C多肽，凍干成干粉。
[0034]SEQIDNO: 3(GLP-2C的cDNA序列）： catggcgatggcagctttagcgatcagatgattaccattctggataatctggcggcgcgt60gattttattaattggctgattcagaccaaaattaccgattgc 102 實例 3、（GLP-2C) -PEG35k- (GLP-2C)的制備 將MAL-PEG-MAL(北京健凱公司)按20.Omg/ml溶于lOOmMol/L磷酸鈉緩沖中（pH6. 5)， 室溫或4°C攪拌條件下，逐漸加入GLP-2C至兩者的摩爾濃度達到PEG :GLP-2C為1:2~4。用RP-HPLC檢測PEG偶聯(lián)二聚體達到70%以上。加入1%的TFA終止反應，用C18柱純化分離除去未修飾的GLP-2C、游離的PEG35K和PEG單修飾的 PEG35K-GLP-2C，純化后的二聚體（GLP-2C)-PEG35K-(GLP-2C)于-20°C保存。
[0035] 實例4、PEG40K-GLP-2C單體偶聯(lián)物制備 將PEG40K-MAL(北京健凱公司）按20. 0mg/ml溶于lOOmMol/L磷酸鈉緩沖中（pH6. 5)， 室溫或4°C攪拌條件下，逐漸加入GLP-2C至兩者的摩爾濃度達到PEG :GLP-2C為1:1~2。用RP-HPLC檢測PEG單體偶聯(lián)物達到90%以上。加入1%的TFA終 止反應，用C18柱純化分離除去未修飾的GLP-2C、游離的PEG40K，純化后的PEG40K-GLP-2C 于-20°C保存。
[0036]實例5、GLP-2,GLP-2C,PEG40K-GLP-2C和（GLP-2C) -PEG35K- (GLP-2C)體外細胞 活性測定 根據(jù)ChemiSCREEN?HumanRecombinantGLP-2GlucagonFamilyReceptor Calcium-OptimizedStableCellLine(Millipore,CatalogueNumber:HTS164C), 提供的細胞株及培養(yǎng)的方法，使用FLIPR測定實時鈣流通量的變化，計算GLP-2， GLP-2C,PEG40K-GLP-2C和（GLP-2C) -PEG35K- (GLP-2C)的EC50值，推算其體外細胞活性。
[0037] 從實驗數(shù)據(jù)可知，GLP-2和GLP-2C的EC50均為3. 3nM左右，活性一致； PEG40K-GLP-2C的EC50為67nM，活性保留了單體的5%左右；（GLP-2C)-PEG35K- (GLP-2C) 的EC50為10. 8nM，其活性保留了30%左右。
[0038]實例 6、GLP-2C和（GLP-2C) -PEG35K- (GLP-2C)小鼠體內(nèi)的藥代測定 取雌性C57BL/6小鼠，體重為20-25克，每個時間點3只小鼠，給藥前前取空白血漿作 為0 小時。GLP-2C組按0? 455mg/Kg皮下注射后，于lhr、2hr、6hr、12hr、24hr、48hr、72hr、 96hr取血；GLP-2C-PEG35K-GLP-2C組按I. 82mg/Kg皮下注射后，于lhr、2hr、6hr、12hr、 24hr、48hr、72hr、96hr取血。用wako公司的人GLP-2標準ELISAKit測定各時間點的血藥 濃度，并計算各組的半衰期。
[0039]
從實驗數(shù)據(jù)可知：各組在給藥2小時后血藥濃度明顯增加，GLP-2C組在給藥6小時后 血藥濃度達到基線水平；（GLP-2C) -PEG35K- (GLP-2C)組給藥72小時后血藥濃度回到基 線。
[0040] 實例7、GLP-2C和（GLP-2C) -PEG35K- (GLP-2C)促進大鼠小腸增重和小腸絨毛增 深的體內(nèi)作用 取雄性Wistar大鼠，體重為200-250克，每組10只，分成6組。對照組為生理鹽水組和吲哚美辛模型組，實驗組為GLP-2C組、（GLP-2C) -PEG35K- (GLP-2C)組。生理鹽水組每天 給生理鹽水1次，不給吲哚美辛；剛哚美辛模型組于第3天和第4天連續(xù)皮下給新配制的吲 哚美辛7mg/Kg，24小時后形成過敏性腸炎，于第7天給藥后，靜脈給1%依文思藍（Evan's Bluedye)lml/只，30分鐘后殺掉大鼠，用生理鹽水洗凈小腸，稱重并觀察小腸絨毛增深情 況和潰瘍情況；GLP-2C組按0. 315mg/Kg，每天給藥一次，連續(xù)給藥7天；于第3天和第4天 連續(xù)皮下給新配制的吲哚美辛7mg/Kg，24小時后形成過敏性腸炎，于第7天給藥后，靜脈給 1%依文思藍（Evan'sBluedye)Iml每只，30分鐘后殺掉大鼠，用生理鹽水洗凈小腸，稱重 并觀察小腸絨毛增深情況和潰瘍情況。（GLP-2C)-PEG35K- (GLP-2C)組按L26mg/Kg，每3 天給藥一次，給藥3次；于第3天和第4天連續(xù)皮下給新配制的吲哚美辛7mg/Kg，24小時后 形成過敏性腸炎，于末次給藥后，靜脈給1%依文思藍（Evan'sBluedye)Iml每只，30分鐘 后殺掉大鼠，用生理鹽水洗凈小腸，稱重并觀察小腸絨毛增深情況和潰瘍情況。
[0041] 結(jié)果表明吲哚美辛模型組與生理鹽水組相比，小腸明顯變短，腸重量減輕，絨毛 淺，形成大面積的潰瘍；GLP-2C組與吲哚美辛模型組對比，小腸重量略微增加，絨毛深度稍 增深，潰瘍情況有些許改善；（GLP-2C)-PEG35K- (GLP-2C)組的大鼠小腸重量與GLP-2C組 相比，明顯增重，絨毛深度顯著增深，潰瘍明顯減少。
【主權(quán)項】
1.人胰高血糖素類似肽2 (GLP-2C)聚乙二醇化同源二聚體其特征是，通過羧基為半胱 氨酸的GLP-2C與不含單甲氧基或羥基的聚乙二醇分子的兩端活化基團共價而成的同源二 聚體，其中GLP-2C的序列特征為 SEQ NO ：1 His-Gly-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-Ile-Leu-Asp-Asn-Leu-Ala-A Ia-Arg-Asp-Phe-Ile-Asn-Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-Cys- COOH02. 權(quán)利要求1中雙活性聚乙二醇特征為不含單甲氧基的聚乙二醇分子的兩端羥基均 被可與巰基化學反應的基團取代。3.權(quán)利要求2中雙活化聚乙二醇分子的兩端取代基團包括馬來酰亞胺活化的聚乙二 醇、乙烯基砜活化的聚乙二醇、碘乙酰胺活化的聚乙二醇、吡啶二硫醚活化的聚乙二醇，優(yōu) 選馬來酰亞胺活化的聚乙二醇。4.權(quán)利要求1，2, 3中所述的聚乙二醇分子量包括5000-40000道爾頓。5.權(quán)利要求1中所述的人胰高血糖素類似肽2(GLP-2C)聚乙二醇同源二聚體，具有促 進小腸上皮細胞和絨毛增生的體內(nèi)生物作用。6.權(quán)利要求1所述的人胰高血糖素類似肽2(GLP-2C)聚乙二醇化同源二聚體，可作為 治療短腸綜合癥及炎癥性腸炎的長效藥物。
【專利摘要】本發(fā)明涉及人胰高血糖素類似肽(GLP-2C)同源二聚體的制備方法和用途。通過C末端為半胱氨酸的游離巰基（-SH）的GLP-2多肽與具有雙活性的聚乙二醇兩端分別化學偶聯(lián)而成的同源二聚體，具有顯著延長體內(nèi)半衰期，促進腸道上皮細胞增殖和吸收的功能，可作為一種治療短腸綜合癥或過敏性腸炎的長效藥物。
【IPC分類】A61P1/00, C07K14/605, A61K38/26
【公開號】CN105085661
【申請?zhí)枴緾N201410181520
【發(fā)明人】范開, 刁志超, 陳清
【申請人】重慶派金生物科技有限公司
【公開日】2015年11月25日
【申請日】2014年5月4日