和藥物多柔比星的組合增加生長抑制Raji建立 的腫瘤的水平。每周治療帶有建立的SCBurkitt氏淋巴瘤腫瘤的小鼠。對照組接收媒質(zhì) (NaCl0.9%)，而處理的組接收以下之一：chR005-lFc24MAb100mg/kg，多柔比星2mg/ kg，chR005-lFc24MAb+ 多柔比星。 【實(shí)施例】
[0321]【材料與方法】
[0322] 細(xì)胞：為研究目的自ATCC(美國典型培養(yǎng)物保藏中心，USA)獲得CH0dhfr/細(xì)胞 系。從ECACC(歐洲動物細(xì)胞保藏中心，UK)得到作為T淋巴瘤Cem細(xì)胞的Burkitt氏淋巴瘤 Raji或Daudi細(xì)胞系。人PBMNC使用Ficoll-Histopaque密度梯度（Sigma,SaintQuentin Fallavier,法國）純化自隱名的健康自愿者供體的白細(xì)胞去除術(shù)（BloodCenter,Lyon 法國）。在此研究中募集的全部B-CLL患者已在免疫表型上定義為在1996年National CancerInstituteWorkingGroup發(fā)布的標(biāo)準(zhǔn)（Hallek等人，2008)。在根據(jù)Declaration ofHelsinki書面知情同意之后從患者得到血。
[0323] 試劑和抗體：在iDD生物技術(shù)（Dardilly，法國）生產(chǎn)IgGl嵌合陰性對照。鼠親 本MAbmR005-l或mR005-2從iDD生物技術(shù)雜交瘤庫分離。由iDD生物技術(shù)（Dardilly, 法國）產(chǎn)生及產(chǎn)生野生型chR005-lFc0(也被稱為天然IgGl)和全部修飾的抗體。FITC 標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白-V和碘化丙錠（PI)分別購自BDBiosciences(PontofClaix,法 國）和Sigma(SaintQuentinFallavier,法國）。山羊Fab' 2 抗-人RPEIgG抗體 和山羊抗-小鼠FITCIg抗體分別購自Sigma(SaintQuentinFallavier,法國）和 MPBiomedical(Illkirch,法國）。利妥昔單抗由Genentech產(chǎn)生及商業(yè)上購買。其他 MAb抗-CD19 4G7 (IgGl)，Bul2 (IgGl)，HD37 (IgGl)，B4 (IgGl)分別購自SantaCruz生 物技術(shù)（California,USA)，AbdSerotec(DUsselldorf,德國），SantaCruz生物技術(shù) (California,USA)，Biogenex(SanRamon,USA)。為凋亡測定作為陽性對照使用的喜樹堿購 自Sigma(SaintQuentinFallavier,法國）。
[0324] 鼠抗體產(chǎn)生：將Balb/c小鼠用⑶19表達(dá)細(xì)胞諸如人慢性淋巴樣白血病細(xì)胞免 疫。鼠MAb通過使用標(biāo)準(zhǔn)雜交瘤技術(shù)產(chǎn)生（Zola等人，1987)及就它們由流式細(xì)胞術(shù)僅結(jié) 合CD19陽性細(xì)胞系的能力起初篩選。純化的MAb通過腹水純化產(chǎn)生，然后通過使用蛋白-A 瓊脂糖純化（Pharmacia,Uppsala,Sweden) 〇
[0325] 鼠MAb轉(zhuǎn)變?yōu)樘烊磺逗螹Ab:對應(yīng)于雜交瘤的可變區(qū)的cDNA通過使用2種方法獲 得，第1方法由變質(zhì)N-術(shù)語氨基酸相關(guān)的引物組產(chǎn)生的PCR中利用組成，由于N-末端測序； 及第2方法由由IMGT?引物數(shù)據(jù)庫產(chǎn)生的變質(zhì)引物組的PCR中利用和之前描述的特異 性引物組成（Essono等人，2003 ;Wang等人，2000)。N-端可變區(qū)的序列通過Edman降解測 定。總RNA提取使用Tri試劑試劑盒根據(jù)由提供商Sigma描述的流程實(shí)施。擴(kuò)增的VL和VH 片段克隆進(jìn)TOPO-TA克隆載體（Invitrogen)用于通過雙脫氧終止方法來序列分析（Sanger等人，1977)。然后由PCR擴(kuò)增抗體變體構(gòu)建體及克隆進(jìn)載體pcDNA3. 3。
[0326] 抗體變體的構(gòu)建：通過使用定點(diǎn)誘變的〃巨引物〃方法導(dǎo)入在Fc結(jié)構(gòu)域中的取 代（Sarkar等人，1990)。位置編號根據(jù)Kabat?.指標(biāo)（不同特異性的抗體中序列的相 同V區(qū)氨基酸序列和段）。分析為抗體-組合位點(diǎn)的結(jié)合的VH和VL基因，小基因和互補(bǔ) 性-測定區(qū)的相對貢獻(xiàn)（Kabat等人，1991)。重和輕鏈構(gòu)建體共轉(zhuǎn)染進(jìn)適合MAb篩選的CH0 DG44(ATCC)?？贵w通過使用蛋白A親和層析（GEHealthcare)純化。
[0327] ⑶19MAbELISA競爭：對于競爭結(jié)合ELISA實(shí)驗(yàn)，將細(xì)胞裂解物通過測試分別作 為示蹤物（生物素化的MAb)或作為捕集器MAb(純化的MAb)使用的不同組合MAb來用作 CD19抗原源。
[0328] 結(jié)合到人⑶19的MAb的FACS分析：結(jié)合到本研究中產(chǎn)生的全部MAb的人⑶19 用FACScan(BDBiosciences，PontofClaix,法國）通過使用自Sigma的山羊抗-小鼠 FITCIg(SaintQuentinFallavier,法國）測量而用于鼠MAb的檢測，及用自Sigma的山 羊抗-人PEIg(SaintQuentinFallavier,法國）測量而用于嵌合MAb的檢測。對于競 爭結(jié)合實(shí)驗(yàn)，將細(xì)胞與用過量的親本MAb或小鼠IgGl同種型對照抗體預(yù)溫育。
[0329] 通過使用生物素化的抗體的激光掃描共聚焦顯微鏡檢：細(xì)胞熒光已通過使用倒置 的ZeissAxiovert100MLSM510Meta共聚焦顯微鏡，通過用生物素化的MAb細(xì)胞標(biāo)記來 可視化。
[0330] 糖基化分析：N-聚糖&過甲基化的釋放根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)過程實(shí)施（Ciucanu等人，1984)。 蛋白糖基化的分析通過質(zhì)量光譜法測定（Morelle等人，2007)。
[0331] 抗體親和性：如之前描述通過使用由流式細(xì)胞術(shù)分析的結(jié)合測定來實(shí)施抗體KD 值的確定（Benedict等人，1997)以檢測結(jié)合細(xì)胞的抗體。
[0332] 由流式細(xì)胞術(shù)的凋亡評定：通過使用膜聯(lián)蛋白V/PI染色之后是FACS分析來測量 在與抗體溫育之后細(xì)胞的凋亡。在顯示對于膜聯(lián)蛋白V的陽性染色和對于碘化丙錠的陰性 染色的選通中測定凋亡細(xì)胞。
[0333] 抗體依賴性細(xì)胞細(xì)胞毒性測定（ADCC):原代B-CLL細(xì)胞或B-細(xì)胞系（Raji)(靶細(xì) 胞）裝載12. 5yM鈣黃綠素-AM染料（Sigma，法國）。將5 000靶細(xì)胞/孔與不同濃度的 感興趣的MAb和對照于+4°C預(yù)溫育20min。效應(yīng)細(xì)胞然后以等于50:1的比E/T添加到靶細(xì) 胞。特定ADCC裂解通過使用以上式計(jì)算：（實(shí)驗(yàn)釋放-(自發(fā)釋放靶+效應(yīng)子））八最大釋 放-自發(fā)釋放革￡)*1〇〇,其中無抗體的祀和效應(yīng)細(xì)胞表示自發(fā)釋放。通過用TritonX-100 處理靶細(xì)胞來獲得最大釋放值。
[0334]補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性測定（CDC):將靶細(xì)胞（50 000細(xì)胞/孔），即原代B-CLL細(xì) 胞或B-細(xì)胞系（Ramos，Raji和Daudi細(xì)胞系）與各種MAb濃度溫育。然后，人正常血清 添加到培養(yǎng)物，然后細(xì)胞于+37°C在振搖條件下溫育4小時(shí)。在溫育結(jié)束時(shí)，用LDH檢定試 劑盒（Promega，法國）測量存在于上清液中的乳酸脫氫酶。在590nm處激發(fā)波長記錄熒 光。特定CDC裂解通過使用以上式計(jì)算：（實(shí)驗(yàn)釋放-靶自發(fā)釋放）八最大釋放-靶自發(fā) 釋放）*1〇〇,其中無抗體的祀和效應(yīng)細(xì)胞表示自發(fā)釋放。通過用TritonX-100處理祀細(xì)胞 來獲得最大釋放值。
[0335] 補(bǔ)體結(jié)合測定：由ELISA結(jié)合測定評定人Clq與MAb的結(jié)合。96-孔板（Nunc)于 4°C用改變Mb濃度包被過夜。在洗滌之后，板用PBS-5%BSA阻斷l(xiāng)h，及與0. 2yg/ml的重 組人Clq(AbdSerotec)或2. 5yl的天然的人補(bǔ)體（Sigma)溫育lh。然后，添加lOOyl 的1/500稀釋的綴合了綿羊抗-人Clq過氧化物酶的Ab(AbdSerotec)及溫育lh。板用 lOOlil/孔的TMB底物（UptimaInterchim)顯影。在 112304添加之后，在 450nm/630nm處 使用MRXII酶標(biāo)儀測量0D。
[0336] 由流式細(xì)胞術(shù)檢測VV或FF多態(tài)性：如述，F(xiàn)cyRIIIA-158V/F多態(tài)性基于 MEM-154/3G8熒光比（Bdttcher等人，2005)。人血樣品（50y1)在暗處，于室溫， 與 10μg/ml的未綴合的 3G8(BectonDickinson,USA)，MEM-154 (Abeam,USA)或與同 種型對照MAb溫育15min。在5min期間添加2ml的1/10稀釋的紅血裂解緩沖劑（BD bioscience，USA)。在洗滌之后，添加來自Sigma(SaintQuentinFallavier,法國）的山 羊抗-小鼠FITCIg(稀釋到1/800的100y1)。細(xì)胞還于室溫溫育30min，然后洗滌兩次， 及通過使用FACScan(BDBiosciences，PontofClaix,法國）檢定。
[0337]【結(jié)果】
[0338] 1. CD 19表位標(biāo)位。
[0339] 由ELISA競爭，我們通過使用MAb組抗-⑶19測定了⑶19表位標(biāo)位，包括MAb mR005-l，mR005-2,4G7,B4,Bul2,HD37。如顯示于圖1，通過作為示蹤物/捕集器MAb使用 組合4G7/mR005-l和HD37/mR005-l觀察強(qiáng)競爭而揭示，這些抗體識別的相同的表位或相鄰 表位。相反，用mR005_2或BU12MAb未觀察到顯著競爭。
[0340] 2.親本鼠MAbmR005-l在Burkitt氏淋巴瘤細(xì)胞中系或在原發(fā)性B-CLL細(xì)胞中引 發(fā)凋亡。
[0341] 相比鼠MAbmR005-2,鼠MAbmR005-l在Burkitt氏淋巴瘤Raji細(xì)胞系中誘導(dǎo)PCD 中高度有效（圖2)。其在提示，mR005-lMAb的更優(yōu)凋亡效應(yīng)可涉及這些分子的精細(xì)特異 性。我們的結(jié)果也展示，mR005-lMAb對于引發(fā)PCD相比利妥昔單抗更有效。
[0342] 3.引發(fā)凋亡的鼠MAb生物學(xué)活性與⑶19上的表位關(guān)聯(lián)。
[0343] 測試一組針對人CD19的鼠MAb，以評價(jià)各克隆的凋亡潛力。我們使用了膜聯(lián)蛋 白-V/PI法來測定在溫育后24小時(shí)由這些抗體誘導(dǎo)的凋亡的水平。我們發(fā)現(xiàn)，mR005-l是 作為自患者分離的B-CLL細(xì)胞中的凋亡過程的誘導(dǎo)物的最佳MAb之一（圖3)。通過使用 Burkitt氏淋巴瘤細(xì)胞系觀察到類似數(shù)據(jù)（數(shù)據(jù)未顯示）。本文呈現(xiàn)的我們的觀察提示，用 與mR005-lMAb相關(guān)的衍生的嵌合MAb處理B-CLL腫瘤細(xì)胞，其能誘導(dǎo)凋亡性信號，可貢獻(xiàn) 于它們的直接殺傷及消除。
[0344] 4?鼠MAbR005-1 及鼠MAbR005-2 的嵌合。
[0345] 相比IMGT?^據(jù)庫，VLmR005-l的序列和VHmR005-l的序列被確認(rèn)分別識別 至少96%和至少92% (圖4)。也確認(rèn)了VLmR005-2和VHmR005-2的序列（99%和98%， 分別）。也由靶小鼠單克隆抗體的N-端氨基酸測序確認(rèn)由cDNA克隆獲得的VH和VL序列的 真實(shí)性。在由聚丙烯酰胺凝膠電泳在還原性條件下氨基酸測序之前分離重和輕鏈，由Edman 降解測序頭20個(gè)氨基酸。然后在輕鏈表達(dá)載體（VLmR005-l或VLmR005-2)中及在重MAb 表達(dá)載體（VHmR005-2或VHmR005-2)中克隆序列，其也編碼命名為FcO的天然Fc區(qū)。實(shí) 施對CH0dhfr/細(xì)胞通過脂轉(zhuǎn)染的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。
[0346] 5. VH和VL chR005_l鏈的真實(shí)性和選擇由流式細(xì)胞術(shù)分析確認(rèn)。
[0347] 將自VH1和VL1序列構(gòu)建的天然嵌合MAbchR005-lFcO與親本鼠MAbmR005-l 就染色及特異性直接比較。如顯示于圖5,在外周血淋巴細(xì)胞觀察到可比較的染色。鼠親 本mR005-l和天然chR005-lFcO之間的細(xì)胞結(jié)合競爭也顯示于圖6。chR005-lFcO完全 阻斷鼠親本mR005-lMAb結(jié)合。
[0348] 6.MAb結(jié)合后⑶19內(nèi)化的誘導(dǎo)不是一般效應(yīng)，且可涉及使用的不同MAb抗-⑶19。
[0349] 由在流式細(xì)胞術(shù)中間接染色，測定于4°C或于37°C溫育后在B-CLL細(xì)胞表面裸露 的抗體的存在與否（圖7)。與利妥昔單抗于37°C經(jīng)超過3或24小時(shí)的延長的時(shí)期觀察到 幾何平均熒光強(qiáng)度的顯著移位。用親本鼠MAbmR005-l注意到類似效應(yīng)，盡管用野生型嵌 合MAbchR005-lFcO觀察到幾何平均熒光強(qiáng)度的更低調(diào)節(jié)。
[0350] 7?天然chR005_lFcO細(xì)胞毒性活性的表征。
[0351] 在許多應(yīng)用中，相比親本鼠單克隆抗體，嵌合抗體在補(bǔ)體-介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞 裂解中及在抗體-依賴性細(xì)胞毒性測定中展示了改善的效應(yīng)子功能（Liu等人，1987; Nishimura等人，1987;Hamada等人，1990)。天然嵌合MAbchR005_lFcO針對Burkitt氏淋 巴瘤細(xì)胞系（圖8)或針對自患者的離體B-CLL細(xì)胞（圖9)誘導(dǎo)不大的ADCC。在標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞 毒性測定中，補(bǔ)體依賴性，僅作為陽性對照使用的利妥昔單抗殺Raji細(xì)胞，然而chR005-l FcO在引發(fā)細(xì)胞細(xì)胞毒性中失效（圖10)。
[0352] 8?人IgGl CH2結(jié)構(gòu)域的變體的產(chǎn)生。
[0353] 如本文所用，術(shù)語〃重鏈〃用于限定IgG抗體的重鏈。在完整的，天然的IgG中， 重鏈包含免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域VH，CH1，鉸鏈，CH2和CH3。貫穿本說明書，IgG重鏈中殘基的 編號是EU指標(biāo)（Kabatetal, 1991)，明白地通過引用并入本文。〃Kabat中的EU指標(biāo)〃指 稱人IgGlEU抗體的編號。
[0354] 我們構(gòu)建了幾種變體，包括單，雙，3,4或5取代變體，以增強(qiáng)介導(dǎo)效應(yīng)子功能的能 力（圖11)。
[0355]Fc34LPLLALF243L/R292P/Y300L/V305L/K326A/P396L
[0356]Fc24LPLLAALF243L/R292P/Y300L/V305L/K326A/E333A/P396L
[0357] 9.Fc24 或Fc34 變體chR005_l有效引發(fā)ADCC。
[0358] 通過首先在基于全血的測定中使用Raji靶細(xì)胞來測量介導(dǎo)自MAb變體組的ADCC 的MAb活性（圖12)。chR005-lFc24或Fc34MAb的效力和功效相比親本chR005-lFcO 顯著地更高。
[0359] 也通過使用來自患者的離體B-CLL細(xì)胞評定chR005_l Fc24的活性（圖13)。類似 于用在Raji細(xì)胞系上的ADCC的觀察，chR005-l Fc20MAb的效力和功效相比親本chR005-l FcO顯著地更高。
[0360] 10.調(diào)查使用B細(xì)胞淋巴瘤的至⑶C的MAb變體組。
[0361] 如顯示于圖14,自野生型chR005-l FcO產(chǎn)生的6個(gè)突變Fc34(F243L/R292P/ Y300L/V305L/K326A/P396L)或 7 個(gè)突變Fc24 (F243L/R292P/Y300L/V305L/K326A/E333A/ P396L)使用Raji細(xì)胞系誘導(dǎo)CDC。
[0362] 如顯示于圖15,自野生型chR005-2 FcO產(chǎn)生的5個(gè)突變Fc24(F243L/R292P/ Y300L/V305L/K326A/E333A/P396L)也使用Raji細(xì)胞系誘導(dǎo)CDC。
[0363] 自野生型chR005-l FcO產(chǎn)生的6個(gè)突變Fc34 (F243L/R292P/Y300L/V305L/K326A/ P396L)或5個(gè)突變Fc24(F243L/R292P/Y300L/V305L/K326A/E333A/P396L)也在靶向離體B-CLL時(shí)誘導(dǎo)CDC(圖16)。
[0364] 11.變體chR005_lFc24或Fc34以對chR005_lFc34更高有效性結(jié)合補(bǔ)體。
[0365] 存在于血清中的人或天然的補(bǔ)體（圖17)結(jié)合變體chR005_lFc24或chR005_l Fc34,揭示用chR005-lFc34變體的更高功效。
[0366] 12. MAb變體引發(fā)了類似水平的細(xì)胞凋亡。
[0367] 在RajiCD19陽性細(xì)胞系（圖18)或在離體B-CLL(圖19)上測試對chR005_l Fc24或chR005-lFc34MAb的程序性細(xì)胞死亡的生物學(xué)活性。FcMAb加工未影響⑶19引 發(fā)的凋亡。
[0368] 13.單克隆抗體可用于組合。
[0369] 通過使用Daudi靶細(xì)胞比較單獨(dú)或組合介導(dǎo)P⑶的MAb活性。鼠親本mR005-l的 存在下（圖20)或用變體Fc24或Fc34chR005-lMAb(圖21)觀察到更高水平的凋亡細(xì)胞， 與利妥昔單抗組合展示Mb組合的可行性和益處。
[0370] 通過使用離體B-CLL比較單獨(dú)或組合介導(dǎo)P⑶的MAb活性。在鼠親本mR005-l的 存在下（圖22)或用變體Fc24或Fc34chR005-lMAb(圖23)觀察到更高水平的凋亡細(xì)胞， 與利妥昔單抗組合展示Mb組合的可行性和益處。
[0371] 14.針對⑶19的MAb可用于患利妥昔單抗復(fù)發(fā)的和難治性疾病的患者。
[0372] 用鼠親本mR005-l(圖 24)或用MAbchR005-lFc24 或chR005-lFc34 (圖 25)體 外處理來自患利妥昔單抗治療后復(fù)發(fā)的和難治性疾病的患者的離體B-CLL樣品。用針對 CD19的MAb相比用利妥昔單抗觀察的更高水平的凋亡展示使用針對CD20之外的另一抗原 的MAb的可行性和功效。
[0373] 15.無Fc多態(tài)性的影響。
[0374] 無論任何Fc y RIIIA同種異型F/F或V/V均觀察到類似水平的ADCC。用MAb未綴 合的3G8或MEM-154實(shí)施淋巴細(xì)胞染色（圖26)。
[0375] 16.MAb表達(dá)。
[0376] 將空CHOdhfr-/-細(xì)胞（由ATCCcollection購買的）用pcDNA3. 3輕鏈用表達(dá) 載體及用pcDNA3. 3重鏈用表達(dá)載體通過在我們的實(shí)驗(yàn)室中建立的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染過程共轉(zhuǎn)染。 此MAb表達(dá)載體的一般特征顯示于圖27。將空CH0細(xì)胞用pcDNA3. 3-輕鏈用表達(dá)載體 (Invitrogen)及用pcDNA3. 3重鏈用表達(dá)載體（Invitrogen)通過在我們的實(shí)驗(yàn)室中建立的 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染過程共轉(zhuǎn)染。此研究MAb表達(dá)載體的一般特征顯示于圖27。通過使用pcDNA3. 3 載體，由全長人CMV立即早期啟動子/增強(qiáng)子控制這些嵌合抗體鏈在哺乳動物細(xì)胞中的表 達(dá)。由相應(yīng)人IgH前導(dǎo)序列致使H和L鏈的分泌。且在3'區(qū)中，單純皰疹病毒胸苷激酶多 聚A尾允許mRNA的有效誘導(dǎo)和穩(wěn)定。將MAb抗-CD19的輕和重鏈的編碼區(qū)在T0P0克隆位 點(diǎn)中導(dǎo)入表達(dá)載體pcDNA3. 3-T0P0。分析轉(zhuǎn)化體的正確取向和閱讀框，可將表達(dá)載體轉(zhuǎn)染進(jìn) CH0細(xì)胞系。
[0377] 17.低巖藻糖基化的抗-⑶19MAbchR005_l的產(chǎn)生。
[0378]IgG的Fc區(qū)中發(fā)現(xiàn)的糖核心是雙-觸角復(fù)合物[Asn297-GN-GN_M- (M-GN) 2]，其中 GN是N-乙酰葡萄糖胺，及M是甘露糖。寡糖可含有0(G0)，1(G1)或2(G2)個(gè)半乳糖（G)。 IgG糖基化模式的變異可包括核心巖藻糖基化（F)。如顯示于圖28和31，chR005-l FcO樣品 中的 3 個(gè)主要峰對應(yīng)于用（GlcNAc) 2 (Fuc) 1+ (Man) 3 (GlcNAc) 2 (m/z1836)，（Gal) 1(GlcNAc)2(Fuc)1+(Man)3(GlcNAc)2(m/z2040)和（Gal)2(GlcNAc)2(Fuc)1+(Man)3(GlcNAc)2(m/ z2245)的巖藻糖基化的寡糖的質(zhì)量。相反，如顯示于圖29~30,相比天然chR005-lFcO， 2個(gè)峰6(^和61?在吐1?005-1 ?〇24或(*1?005-1 ?〇34抗體（分別7.2%或5.2%和16.8% 或16. 1% )中以更低得多水平存在，（分別28%或38, 3% )。未觀察到對峰G2F的顯著沖 擊。觀察到（Man)5(GlcNAc)2(m/z1579)，（Man)6(GlcNAc)2(m/z1784) (Man)7(GlcNAc)2(m/ z1988)，（Man)8(GlcNAc)2(m/z2192)和（Man)9(GlcNAc)2(m/z2396)之間的更高水平的 寡甘露糖（29. 9%或27. 9%對比0% )，也觀察到更高水平的唾液酸化的糖型（1.6% %或 2.4% 對比 0.8%)。將（GaDUGlcNAdjFudjNeuAch+OMarOdGlcNAch。（m/z2401)， (Gal) 2 (GlcNAc) 2 (Fuc)jNeuAc)，(Man) 3 (GlcNAc) 2〇 (m/z2605)和（Gal) 3 (GlcNAc) 2 (Fuc) jNeuAc)^ (Man) 3 (GlcNAc) 2。（m/z2966)包括在chR005-lFc24 或chR005-lFc34 抗體中 與天然chR005-lFcO相比。
[0379] 如顯示于圖32,數(shù)據(jù)展示，代替天然嵌合chR005_lFcO抗體中的巖藻糖基化的結(jié) 構(gòu)，來自MAbchR005-lFc24或chR005-lFc34的優(yōu)化的抗體中非-巖藻糖基化的蓄積。
[0380] 18?結(jié)合MAb親和性的確定。
[0381] 由流式細(xì)胞術(shù)分析及對⑶19陽性Raji細(xì)胞系的結(jié)合平衡研究檢查MAbmR005-l， chR005-lFc0，chR005-lFc24和chR005-lFc34的結(jié)合性質(zhì)。因此嵌合或MAb優(yōu)化均不 導(dǎo)致MAb親和性的顯著變化：
[0382]
[0383] 19.根據(jù)Fc變體的不同聚糖特征
[0384] 圖33顯示相比天然chR005_lFcO,Fc變體對聚糖諸如巖藻糖基化的寡糖（m/ z1836, 2040, 2245)，寡甘露糖（m/z1579, 1784, 1988, 2192, 2396)和 / 或唾液酸化的糖型 (2401，2605, 2966)的影響。
[0385] 20.根據(jù)Fc變體的差異MAb活性。
[0386] 圖34顯示不同F(xiàn)c變體抗-⑶19抗體和它們的用分離的PBMNC引發(fā)⑶C及/或 ADCC的能力。本發(fā)明提供，僅chR005-lFc24或chR005-lFc34變體引發(fā)ADCC和CDCMAb 活性。
[0387] 21.圖35顯示不同F(xiàn)c變體抗-CD19抗體（Fcl4,chR005_l,Fc34)和它們的在全血 存在下引發(fā)CDC及/或ADCC的能力。僅chR005-lFc34在天然的循環(huán)免疫球蛋白的存在 下引發(fā)ADCC。
[0388] 22.圖36顯示不同F(xiàn)c變體抗-CD19抗體（chR005_lFc24 ;Fc39)和它們的在全 血存在下，以根據(jù)優(yōu)化的Fc的不同水平引發(fā)ADCC的能力。
[0389] 23.本發(fā)明包括，用chR005_l Fc34的改善的ADCC