-比為1:2. 5的端基異構(gòu)混合物獲得。除去27中的 保護(hù)基會(huì)生成可通過標(biāo)準(zhǔn)色譜法分離的游離核苷28和29。通過標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)一步將(6-核 苷29三苯甲基化以提供化合物30,最后亞磷酸化以得到亞磷酰胺結(jié)構(gòu)單元31，備用于寡核 苷酸合成。
[0148]方案 3:
[0149]
[0150] 實(shí)施例5
[0151] 化合物36的制備（方案4)
[0152] 由糖23起始合成亞磷酰胺36,顯示了核糖構(gòu)型中的氟取代基。制備用于核苷化的 化合物23,經(jīng)乙?；a(chǎn)生乙酸酯32。隨后32經(jīng)由Vorbrilggen步驟核苷化后得到高選擇性 的核苷33 (a，1:12)。核苷33然后脫保護(hù)（一34)并通過標(biāo)準(zhǔn)三苯甲基化（一35)和 亞磷酸化轉(zhuǎn)化為亞磷酰胺結(jié)構(gòu)單元31。
[0153]方案 4:
[0154]
[0155] 實(shí)施例6
[0156] 寡聚化合物的制備
[0157] 以下合成步驟是本領(lǐng)域公知的，其中一些在本文中示出，使用實(shí)施例中示出的一 種或多種亞磷酰胺化合物如DMT亞磷酰胺（參見化合物11、化合物18、化合物31或化合物 36)制備具有至少一個(gè)三環(huán)核苷的寡聚化合物。
[0158] 實(shí)施例7
[0159] 用于Tm研究的寡聚化合物的制備（表1)
[0160] 遵循標(biāo)準(zhǔn)自動(dòng)化DNA合成方案，制備包含一個(gè)或多個(gè)三環(huán)核苷的寡聚化合物用于 Tm研究。在從固體支持物裂解后，將寡聚化合物通過離子交換HPLC進(jìn)行純化并使用標(biāo)準(zhǔn)程 序通過LCMS分析。當(dāng)對(duì)DNA或RNA二倍化時(shí)，將修飾的IOmer寡聚化合物的Tm與未修飾的 IOmerDNA寡核苷酸進(jìn)行比較。使用Cary100分光光度計(jì)測(cè)定Tm，同時(shí)使用CaryWinUV 熱方案測(cè)定相對(duì)于溫度的吸光度。對(duì)于Tni實(shí)驗(yàn)，在pH7下150mMNaClUOmM磷酸鹽、0.ImM H)TA的緩沖液中制備濃度為I. 2yM的寡聚化合物。在將選定寡聚化合物和互補(bǔ)的RNA或 DNA等體積混合后，85°C下測(cè)定的濃度為I. 2yM。通過將雙鏈體加熱到90°C5分鐘，然后 冷卻至室溫，使得寡聚化合物與互補(bǔ)RNA或DNA雜交。當(dāng)將雙鏈體溶液在小槽中從15°C開 始以0. 5°C/分鐘的速率加熱直到溫度為85°C時(shí)，使用分光光度計(jì)進(jìn)行Tni測(cè)量。使用采用 非自互補(bǔ)序列的萬特-霍夫（VantHoff)計(jì)算（A260相對(duì)于溫度曲線）來確定Tjl，其中 將與雙鏈體有關(guān)的最小吸光度和與非雙鏈體單鏈有關(guān)的最大吸光度手動(dòng)整合到程序中。
[0161]表 1
[0162]
[0163] 未修飾的寡聚化合物AOl與DNA或RNA成雙鏈體的Tm分別為43. 5°C和45. 1°C。 完全修飾的化合物A05當(dāng)與DNA或RNA成雙鏈體時(shí)，Tm分別為55. (TC和66. 2°C。未修飾 的寡核苷酸A15當(dāng)與DNA或RNA成雙鏈體時(shí)，Tm分別為45. 6°C和42. 2°C。完全修飾的雙 鏈體A05-A08是5' -磷酸化的。含A05-A08的雙鏈體的ATm/修飾參照A05。A02-A04和 A09-A14的ATm/修飾參照A01。每個(gè)核苷間連接基團(tuán)是磷酸二酯。后面沒有下標(biāo)的每個(gè) 核苷為0 -D-2' -脫氧核糖核苷，后面有下標(biāo)"a"或"b"或"c"或"d"的每個(gè)核苷定義如 下。從ATm數(shù)據(jù)清楚可知，6'-氟化核苷（亞型b)和2'-氟代核糖核苷（亞型c)以每一 修飾為+1. 6至+3. 1°C的ATm用互補(bǔ)DNA并且以每一修飾為+0. 4至+3. 4°C的ATm用互補(bǔ) RNA穩(wěn)定雙鏈體的形成。在三環(huán)-DNA骨架（A05-A08)內(nèi)，在C6'的氟原子與在同一位置的 氫原子相比，可以通過每一修飾高達(dá)+0. 7°C用互補(bǔ)RNA穩(wěn)定雙鏈體（A07相對(duì)于A06)。這 種穩(wěn)定是序列依賴性的。用DNA作為補(bǔ)充，C6'處氟的作用是稍微不穩(wěn)定的。單個(gè)阿拉伯 糖氟代核苷殘基（下標(biāo)d)以每一修飾為-2. 7至-4. 5 °C的ATm用互補(bǔ)DNA并且以每一修 飾為-2. 5至-4. 7°C的ATm用互補(bǔ)RNA使雙鏈體不穩(wěn)定。然而，含有5個(gè)連續(xù)阿拉伯糖氟 代殘基（A16)的序列通過以+0. 6的ATm/修飾用互補(bǔ)RNA穩(wěn)定雙鏈體。
[0165] 實(shí)施例8
[0166] 用于mdx小鼠的原代mdx細(xì)胞中外顯子23跳讀的寡聚化合物的制備和功能性分 析
[0167]表2:
[0168]
[0169] 后面有下標(biāo)"a"或"b"的每個(gè)核苷如實(shí)施例7中定義。所有的寡核苷酸A20-A23 在5'端攜帶有磷酸酯單元（p)。A20和A22都具有磷酸酯（PO)核苷間連接，而寡核苷酸 A21和A23都具有硫代磷酸酯（PS)核苷間連接。在寡核苷酸A20和A21中，C指堿基胞嘧 啶，而在寡核苷酸A22和A23中，￡指堿基5' -甲基胞嘧啶。
[0170]mdx小鼠代表人類遺傳病杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良的模型。它在小鼠肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白基因 的外顯子23中包含突變，這導(dǎo)致早熟的終止密碼子。其結(jié)果是沒有產(chǎn)生功能性肌營(yíng)養(yǎng)不良 蛋白mRNA和肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白。本領(lǐng)域（Lu等，ProcNatlAcadSciUSA2005,102,198-203) 已知施用設(shè)計(jì)為結(jié)合至外顯子23的外顯子/內(nèi)含子接合點(diǎn)的反義寡核苷酸，導(dǎo)致mRNA剪 接期間外顯子23的跳讀，由此導(dǎo)致小鼠肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白的功能性變體。
[0171] 為了測(cè)試A20-A23的外顯子跳讀潛力，用50yg(約9nmol)各寡核苷酸A20-A23 轉(zhuǎn)染mdx原代細(xì)胞（mdx小鼠）而未用轉(zhuǎn)染試劑（剝裸（gymnosis))。轉(zhuǎn)染后4天收獲細(xì)胞 并提取RNA。外顯子23周圍進(jìn)行RT-PCR和巢式PCR(EX20F/Ex26R)，并通過凝膠電泳分析 產(chǎn)物（圖1)。寡核苷酸A21和A23顯示大量的外顯子跳讀。用氟代寡核苷酸A23的跳讀 定性上略優(yōu)于不含氟取代基的A21。
[0172] 圖1顯示巢式PCR后代表mdx肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白R(shí)NA的外顯子20-26的區(qū)域的PCR 片段的瓊脂糖凝膠。移動(dòng)較慢的帶對(duì)應(yīng)于未跳讀的RNA(包括外顯子20)，而移動(dòng)較快的帶 對(duì)應(yīng)于跳讀（排除外顯子20)的RNA。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種通式I描述的三環(huán)核苷： 其中：-Bx是雜環(huán)堿基部分； -T1和T2之一是羥基（-0H)或被保護(hù)的羥基，且T1和T2的另一個(gè)是磷酸酯或反應(yīng)性磷 基團(tuán)； _Qi、q〗、*1?、如、屯、z矛口ztefr _其它的q2、q3、q4、q5、z1和z2獨(dú)立地選自H、F、Cl， -z1 和z2之一是H或F，且z1和z2的另一個(gè)是H、-OH、Cl、OCH3、0CF3、0CH2CH3、0CH2CF3、 0CH2-CH=ch2、o(ch2)2-och3、o(ch2)2-o(ch2)2-n(ch3)2、0CH2C( = 0)-N(H)CH3、0CH2C(= 〇)_N(H) - (CH2)2-N(CH3) 2或OCH2-N(H)-c( =NH)NH2。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的三環(huán)核苷，其中Bx是尿嘧啶、胸腺嘧啶、胞嘧啶、5-甲基胞嘧 啶、腺嘌呤或鳥嘌呤。3. 根據(jù)前述任一權(quán)利要求所述的三環(huán)核苷，其中T1是羥基或被保護(hù)的羥基，且其中T2 是選自H-膦酸酯或亞磷酰胺的反應(yīng)性磷基團(tuán)。4. 根據(jù)前述任一權(quán)利要求所述的三環(huán)核苷，其中T1是4, 4' -二甲氧基三苯甲基，且T2 是二異丙基氰基乙氧基亞磷酰胺或受控孔玻璃表面。5. 根據(jù)前述任一權(quán)利要求所述的三環(huán)核苷，其中q3、q4、q5、z1和z2的一個(gè)或兩個(gè)是F， 且其它的q3、q4、q5、z1和z2是H。6. -種三環(huán)核苷，選自：CN105121452A _權(quán)利要求書_ _3/5頁其中Bx選自尿嘧啶、胸腺嘧啶、胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、腺嘌呤和鳥嘌呤。7. 包含至少一個(gè)具有式II的三環(huán)核苷的寡聚化合物：其中獨(dú)立地，對(duì)于式II的每個(gè)三環(huán)核苷： -Bx是雜環(huán)堿基部分； -T3和T4之一是將式II的三環(huán)核苷連接至寡聚化合物的核苷間連接基團(tuán)，且T3和T4 的另一個(gè)是羥基、被保護(hù)的羥基、5'或3'端基或者將三環(huán)核苷連接至寡聚化合物的核苷間 連接基團(tuán)； _Qi、q〗、*1?、如、屯、z矛口ztefr _其它的q2、q3、q4、q5、z1和z2獨(dú)立地選自H、F、Cl; -z1和z2之一是H或F且z1和z2的另一個(gè)是H、-OH、Cl、OCH3、0CF3、0CH2CH3、0CH2CF3、 0CH2-CH=ch2、o(ch2)2-och3、o(ch2)2-o(ch2)2-n(ch3)2、0CH2C( = 0)-N(H)CH3、0CH2C(= 〇)_N(H) - (CH2)2-N(CH3) 2或OCH2-N(H)-c( =NH)NH2; 且其中所述寡聚化合物包含8-40個(gè)單體亞單元。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的寡聚化合物，其中Bx各自獨(dú)立地為尿嘧啶、胸腺嘧啶、胞嘧 啶、5-甲基胞嘧啶、腺嘌呤或鳥嘌呤。9. 根據(jù)權(quán)利要求7-8任一項(xiàng)所述的寡聚化合物，其中每個(gè)核苷間連接基團(tuán)獨(dú)立地為磷 酸二酯核苷間連接基團(tuán)或硫代磷酸酯核苷間連接基團(tuán)。10. 根據(jù)權(quán)利要求7-9任一項(xiàng)所述的寡聚化合物，其中基本上每個(gè)核苷間連接基團(tuán)是 硫代磷酸酯核苷間連接基團(tuán)。11. 根據(jù)權(quán)利要求7-10任一項(xiàng)所述的寡聚化合物，其包含具有至少兩個(gè)連續(xù)的具有式 II的三環(huán)核苷的第一區(qū)域。12. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的寡聚化合物，其包含具有至少兩個(gè)連續(xù)的單體亞單元的第 二區(qū)域，其中所述第二區(qū)域中的每個(gè)單體亞單元是不同于所述第一區(qū)域的式II的三環(huán)核 苷的經(jīng)修飾的核苷。13. 根據(jù)權(quán)利要求12所述的寡聚化合物，其還包含位于所述第一區(qū)域和所述第二區(qū)域 之間的第三區(qū)域，其中所述第三區(qū)域中的每個(gè)單體亞單元獨(dú)立地為不同于所述第一區(qū)域的 式II的各三環(huán)核苷和所述第二區(qū)域的各單體亞單元的核苷或經(jīng)修飾的核苷。14. 根據(jù)權(quán)利要求7-13任一項(xiàng)所述的寡聚化合物，其包含具有6至14個(gè)連續(xù)單體亞單 元的內(nèi)部區(qū)域的間隙寡聚化合物，所述內(nèi)部區(qū)域每側(cè)連接有1至5個(gè)連續(xù)單體亞單元的外 部區(qū)域，其中每個(gè)外部區(qū)域中的每個(gè)單體亞單元是式II的三環(huán)核苷，且所述內(nèi)部區(qū)域中的 各單體亞單元獨(dú)立地為核苷或經(jīng)修飾的核苷。15. 根據(jù)權(quán)利要求7-14任一項(xiàng)所述的寡聚化合物，其包含選自下組的一個(gè)或幾個(gè)核苷 酸結(jié)構(gòu)單元：其中T3和T4具有如上所概括的含義。16. -種用于固相合成寡核苷酸的方法，包括使用根據(jù)權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)所述的三 環(huán)核苷。
【專利摘要】本發(fā)明提供了式(I)的氟取代的三環(huán)核苷，其中取代基如權(quán)利要求所限定。本發(fā)明還提供了由其制備的寡聚化合物。將一個(gè)或多個(gè)三環(huán)核苷引入寡聚化合物中增強(qiáng)寡聚化合物的一種或多種性質(zhì)。這種寡聚化合物也可以包括在雙鏈組合物中，
【IPC分類】C07H19/06, C07H21/00
【公開號(hào)】CN105121452
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201480016220
【發(fā)明人】C·勒曼
【申請(qǐng)人】伯爾尼大學(xué)
【公開日】2015年12月2日
【申請(qǐng)日】2014年3月14日
【公告號(hào)】CA2902260A1, WO2014140348A1