一種魚(yú)鰭微量基因組dna提取方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種魚(yú)罐微量基因組DNA提取方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 運(yùn)用分子生物學(xué)技術(shù)從核酸水平研究魚(yú)類的種類和生物學(xué)特征是現(xiàn)代魚(yú)類分子 系統(tǒng)學(xué)和魚(yú)類遺傳學(xué)的研究熱點(diǎn)之一。在魚(yú)類分子生物學(xué)研究中不論是利用DNA分子標(biāo)記 進(jìn)行遺傳作圖，還是WPCR技術(shù)為核屯、的分子標(biāo)記，都必須提取一定數(shù)量和高質(zhì)量的DNA作 為實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，尤其在魚(yú)類育種學(xué)研究中，除了要求獲得DNA的數(shù)量適當(dāng)和質(zhì)量高W外，更 要保證參與選擇的魚(yú)類親本的存活性，大多數(shù)的魚(yú)類DNA提取方法選取肌肉、腎臟、血液等 組織作為提取材料，破壞魚(yú)類組織嚴(yán)重，會(huì)影響魚(yú)類的后期存活，尤其對(duì)于魚(yú)類育種工作性 狀優(yōu)良的親本DNA分析后，存活尤為重要。
[0003] 常規(guī)方法中用液氮或勻漿器進(jìn)行研磨的過(guò)程，易造成交叉污染，又會(huì)出現(xiàn)樣品的 損失。
[0004] 常規(guī)方法對(duì)酒精浸泡時(shí)間過(guò)長(zhǎng)的樣本提取后DNA易出現(xiàn)斷裂或降解，影響后續(xù)的 實(shí)驗(yàn)工作。 陽(yáng)0化]常規(guī)DNA提取實(shí)驗(yàn)多強(qiáng)調(diào)低溫操作，如液氮研磨、冷凍離屯、等，對(duì)提取設(shè)備要求較 局，成本局。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種魚(yú)罐微量基因組DNA提取方法。 陽(yáng)007] 本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下：
[0008] 一種魚(yú)罐微量基因組DNA提取方法，包括如下步驟：
[0009] (1)用剪刀剪下SmmXSmm范圍內(nèi)的新鮮魚(yú)罐，用蒸饋水沖洗干凈，放入離屯、管中， 或用剪刀剪下5mmX5mm范圍內(nèi)的經(jīng)過(guò)無(wú)水乙醇浸泡過(guò)的魚(yú)罐，用TE緩沖液浸泡2~4小 時(shí)，放入離屯、管中；
[0010] (2)向步驟（1)的得到的離屯、管中加入經(jīng)水浴鍋中加熱至無(wú)絮狀沉淀的裂解液 TENS-Urea700~800yL;加入10~20yL濃度為10yg/yL蛋白酶K，混勻，放入37°C恒 溫水浴鍋放置1化~20h，在放置期間每2~化滿旋一次；加入700~800yL第一種混合 溶液，混勻，靜置5~lOmin，在轉(zhuǎn)速為9000~10000轉(zhuǎn)/分條件下，離屯、10~15min;
[0011] (3)取上清液，加入與所取上清液等量的第一種混合溶液，混勻，在轉(zhuǎn)速為9000~ 10000轉(zhuǎn)/分條件下，離屯、10~15min; 陽(yáng)01引 （4)取上清液，加入與所取上清液等量的第二種混合溶液，混勻，在轉(zhuǎn)速為9000~ 10000轉(zhuǎn)/分條件下，離屯、10~15min;
[0013] (5)取上清液，加入所取上清液體積2~2. 5倍的-20~-10°C無(wú)水乙醇，搖勻， 在-20~-10°C靜置2~4h;在轉(zhuǎn)速為9000~10000轉(zhuǎn)/分條件下，離屯、10~15min;
[0014] (6)去除上清液，向沉淀中加入800~1000yL體積濃度為70%的乙醇水溶液，把 沉淀?yè)u起來(lái)進(jìn)行清洗，在離屯、機(jī)轉(zhuǎn)速為12000~14000轉(zhuǎn)/分條件下，離屯、15~20min;
[0015] (7)去除上清液，倒置離屯、管至沉淀透明，或?qū)㈦x屯、管放入37°C烘箱中烘干至沉 淀透明；
[0016] 做加入50-100yLTE緩沖液，得到基因組DNA，于4°C保存；
[0017] 所述第一種混合溶液由體積比為25 :24 :1的苯酪、氯仿和異戊醇組成；所述第二 種混合溶液由體積比為24 :1的氯仿和異戊醇組成；所述裂解液TENS-Urea的組成：10mM Tris-肥1pH7. 5 ;0. 125MNaCl;0. 5M邸TANaz;質(zhì)量濃度為0. 5%十二烷基硫酸鋼；4M尿素， 余量為蒸饋水。
[001引本方法具有W下優(yōu)點(diǎn)：
[0019] ①本發(fā)明僅選取微量的魚(yú)罐，對(duì)魚(yú)類的損傷降低接近為0,完全不影響其今后的存 活。運(yùn)對(duì)于某些珍惜或小型的魚(yú)類，更顯得重要。
[0020] ②本發(fā)明通過(guò)裂解液TENS-Urea和蛋白酶K在37°C恒溫水浴中裂解，避免了研磨 過(guò)程中的交叉污染，又減少了樣品的損失。該方法也可適用于其它水生動(dòng)物堅(jiān)硬組織的DNA 提取。
[002U ③本發(fā)明用于長(zhǎng)期酒精浸泡標(biāo)本的基因組DNA提取，提取的DNA質(zhì)量良好，可用于 后續(xù)的PCR的擴(kuò)增。
[0022] ④本發(fā)明在提取過(guò)程中均在室溫下完成（除37°C恒溫水?。舆m用于生產(chǎn)單 位試劑設(shè)備簡(jiǎn)單的實(shí)驗(yàn)室操作。
【附圖說(shuō)明】 陽(yáng)02引 圖1為經(jīng)魚(yú)20尾個(gè)體的基因組DNA電泳圖。
[0024]圖2為隨機(jī)引物S76對(duì)經(jīng)魚(yú)的20尾個(gè)體的PCR擴(kuò)增結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[00巧]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明。 陽(yáng)0%] 實(shí)施例1
[0027]一種魚(yú)罐微量基因組DNA提取方法，包括如下步驟： 陽(yáng)02引 （1)選取20尾經(jīng)過(guò)無(wú)水乙醇浸泡6個(gè)月的經(jīng)魚(yú)似prinusCa巧io)魚(yú)罐，用剪刀 剪下SmmX5mm范圍的小塊，編號(hào)1-20,分別用TE緩沖液浸泡4小時(shí)，分別放入離屯、管中；
[0029] 似向步驟（1)的得到的各離屯、管中分別加入經(jīng)水浴鍋中加熱至無(wú)絮狀沉淀的裂 解液TENS-Urea750yL;加入15yL濃度為10yg/yL蛋白酶K，混勻，放入37°C恒溫水浴 鍋放置20h，在放置期間每化滿旋一次；加入750yL第一種混合溶液，混勻，靜置8min，在 轉(zhuǎn)速為10000轉(zhuǎn)/分條件下，離屯、13min;
[0030] (3)取上清液，加入與所取上清液等量的第一種混合溶液，混勻，在轉(zhuǎn)速為10000 轉(zhuǎn)/分條件下，離屯、13min;
[0031] (4)取上清液，加入與所取上清液等量的第二種混合溶液，混勻，在轉(zhuǎn)速為10000 轉(zhuǎn)/分條件下，離屯、13min; W巧 妨取上清液，加入所取上清液體積2. 3倍的-20~-10°C無(wú)水乙醇，搖勻， 在-20~-10°C靜置化；在轉(zhuǎn)速為10000轉(zhuǎn)/分條件下，離屯、13min;
[0033] (6)去除上清液，向沉淀中加入900yL體積濃度為70 %的乙醇水溶液，把沉淀?yè)u 起來(lái)進(jìn)行清洗，在離屯、機(jī)轉(zhuǎn)速為13000轉(zhuǎn)/分條件下，離屯、ISmin;
[0034] (7)去除上清液，倒置離屯、管至沉淀透明； 陽(yáng)03引 做加入80yLTE緩沖液，得到20個(gè)基因組DNA，于4°C保存；
[0036] 所述第一種混合溶液由體積比為25 :24 :1的苯酪、氯仿和異戊醇組成；所述第二 種混合溶液由體積比為24 :1的氯仿和異戊醇組成；所述裂解液TENS-Urea的組成：10mM Tris-肥1pH7. 5 ;0. 125MNaCl;0. 5M邸TANaz;質(zhì)量濃度為0. 5%十二烷基硫酸鋼；4M尿素， 余量為蒸饋水。
[0037] 20尾經(jīng)魚(yú)DNA樣品的OD值及濃度（微量紫外分光光度計(jì)）見(jiàn)表1。 W38] 表1 20尾經(jīng)魚(yú)DNA樣品的OD值及濃度
[0039]
W40] 表1的結(jié)果表明，微量紫外分光光度計(jì)的檢測(cè)結(jié)果表明，DNA樣品的OD值 (260/280)普遍在1. 7-1. 9之間，說(shuō)明提取的DNA較為純凈。
[0041] 對(duì)20個(gè)樣本的基因組DNA經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖1，其中（M為 入DNA化ndIII/EcoRI標(biāo)準(zhǔn)分子量（鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司）。從圖1中可W看出，本方 法提取的魚(yú)類標(biāo)本的基因組DNA電泳譜帶整齊，無(wú)明顯拖尾，說(shuō)明提取的DNA較為完整。
[0042] 將20個(gè)基因組DNA經(jīng)隨機(jī)引物S76(購(gòu)于鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司）PCR擴(kuò)增，電泳 結(jié)果見(jiàn)圖2。從圖2中可W看出：隨機(jī)引物S76擴(kuò)增的電泳譜帶，條帶清晰，差異明顯，由此 說(shuō)明本發(fā)明的方法