一種產(chǎn)人胰島素原的畢赤酵母發(fā)酵培養(yǎng)基及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域，具體而言，本發(fā)明設(shè)及一種產(chǎn)人膜島素原的畢 赤酵母發(fā)酵培養(yǎng)基W及利用該培養(yǎng)基生產(chǎn)人膜島素原的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 膜島素是最為有效的糖尿病治療藥物，生產(chǎn)人膜島素的方法分為化學(xué)合成法和基 因重組法，基因重組法先生產(chǎn)人膜島素原，再進(jìn)行后續(xù)工藝轉(zhuǎn)變?yōu)槿四u素或人膜島素類 似物?；蛑亟M法主要使用兩種方法生產(chǎn)人膜島素原，一種方法使用原核生物大腸桿菌，另 一種方法使用真核生物釀酒酵母。
[0003]畢赤酵母既具有類似原核生物大腸桿菌的繁殖快、易培養(yǎng)、便于遺傳操作的特 性，又具有真核生物釀酒酵母的蛋白可翻譯后修飾、蛋白正確折疊的特性，應(yīng)用十分廣泛， 畢赤酵母已成為多種蛋白的理想表達(dá)體系化inCere曲inoGP,LinCere曲inoJ,Ilgen C,CreggJM(2002)Productionofrecombinantproteinsinfermenterculturesofthe yeastPichiapastoris.CurrOpinBiotechnol13:329 - 332)。
[0004] 在畢赤酵母表達(dá)外源蛋白需要利用培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分，培養(yǎng)基除了必須含有菌 體生長代謝所必需的物質(zhì)和元素外，還必須含有構(gòu)成外源蛋白所需要的物質(zhì)和元素，如，碳 源、氮源、無機(jī)鹽等；碳源對酵母生長代謝的作用主要是提供細(xì)胞及產(chǎn)物的碳骨架，提供細(xì) 胞生命活動所需的能量，碳源可W分為無機(jī)碳源物質(zhì)和有機(jī)碳源物質(zhì)，包括葡萄糖、果糖、 薦糖、淀粉、纖維素等糖類，還包括有機(jī)酸，氨基酸，醇類，醒，酪等含碳化合物；畢赤酵母常 利用的碳源一般為甘油、葡萄糖、甲醇等。氮源為酵母細(xì)胞提供構(gòu)成蛋白質(zhì)、核酸及其他氮 元素化合物的材料，氮源可W分為無機(jī)氮源和有機(jī)氮源，無機(jī)氮源包括錠鹽、硝酸鹽等，有 機(jī)氮源包括牛肉膏、蛋白腺、酵母膏、魚粉、血粉、贈蛹粉、豆（餅）粉、花生（餅）粉等。
[0005] 畢赤酵母發(fā)酵產(chǎn)人膜島素原可W采用多種培養(yǎng)基，一般為BSM培養(yǎng)基及BSM基 礎(chǔ)上改進(jìn)的培養(yǎng)基。BSM(基礎(chǔ)鹽）培養(yǎng)基是Invitrogen公司提供的畢赤酵母發(fā)酵常規(guī) 使用的培養(yǎng)基，其配方為：85 %憐酸26. 7ml/l，二水硫酸巧0. 93g/l，硫酸鐘18. 2g/l，屯 水硫酸儀14. 9g/l，氨氧化鐘4. 13g/l，甘油40.Og/L;董鵬等使用BSM培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵罐 培養(yǎng)產(chǎn)人膜島素原，誘導(dǎo)溫度30°C，誘導(dǎo)抑為5. 5~6. 0,誘導(dǎo)96h，表達(dá)量256mg/L(董 鵬等，表達(dá)膜島素的畢赤酵母生長動力學(xué)及誘導(dǎo)策略。北京化工大學(xué)學(xué)報(bào)，2006, 33(3): 37~41) ;Pais-化an化au等在BSM培養(yǎng)基中分別添加酪蛋白水解物、酵母提取物、蛋白腺 及硫酸錠用于表達(dá)膜島素原，誘導(dǎo)溫度22°C，誘導(dǎo)抑6. 3,誘導(dǎo)12化后表達(dá)量達(dá)到0. 3g/ L(P3ls-Ch3nfr3UJM,et曰I.Improvingtheexpressionofmini-proinsulininPichi曰 pastoris.Biotechno]_Lett. , 2004, 26 (16) : 1269-1272)!Gurramkonda等將BSM培養(yǎng)基中的 二水硫酸巧0. 93g/L換為二水合氯化巧0. 28g/l，將憐酸和氨氧化鐘換為憐酸二氨鐘9. 4g/ 以甘油含量增為95. 2旨/1，并添加了 15. 7g/L的硫酸錠，利用此培養(yǎng)基進(jìn)行人膜島素前體的 發(fā)酵，誘導(dǎo)溫度30°C，誘導(dǎo)抑為5. 5,誘導(dǎo)表達(dá)12化，表達(dá)量達(dá)到3-4g/L(Gu;rramkondaet al.Applicationofsimplefed-batchtechniquetohigh-levelsecretoryproduction ofinsulinprecursorusingPichiapastoriswithsubsequentpurificationand conversiontohumaninsulin.MicrobialCellFactories2010,9:31 ~41)。
[0006] 上述培養(yǎng)基或者表達(dá)量不高，或者誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)間過長，導(dǎo)致生產(chǎn)效率不高，并 且，有研究表明BSM培養(yǎng)基鹽濃度高，使得培養(yǎng)基滲透壓過高，導(dǎo)致菌體死亡率增加，不 僅影響表達(dá)量的提高，釋放出脂類物質(zhì)還增加了下游純化工藝的難度度radyCP，Shimp RL,MilesAR,etal.High-levelproductionandpurificationofP30P2MSP1(19),an importantvaccineantigenform曰I曰ri曰，expressedinthemethylotropicyeast Pichiapastoris.ProtExpresPurif. 2001,23, 468 - 475)，因此，有必要對培養(yǎng)基進(jìn)行改 進(jìn)，提供一種既能縮短培養(yǎng)時(shí)間，又能得到高表達(dá)量的人膜島素原的培養(yǎng)基，W提高工業(yè)化 生產(chǎn)的效率。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明為解決利用畢赤酵母發(fā)酵常規(guī)使用的BSM培養(yǎng)基發(fā)酵產(chǎn)人膜島素原表達(dá) 量不高、誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)間過長等導(dǎo)致生產(chǎn)效率不高的問題，提供了一種適于畢赤酵母發(fā)酵產(chǎn) 人膜島素原的培養(yǎng)基，并在此基礎(chǔ)上，本發(fā)明還提供了一種進(jìn)行畢赤酵母發(fā)酵產(chǎn)人膜島素 原的方法。
[0008] 本發(fā)明的目的通過W下方案實(shí)現(xiàn)：
[0009] -種產(chǎn)人膜島素原的畢赤酵母發(fā)酵培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基配方為：蛋白腺1~20g/l， 黃豆粉1~l〇g/l，85%憐酸13~碳酸巧0. 3~0. 4g/L，屯水硫酸儀7. 0~8.Og/ L硫酸錠6~lOg/l，氨氧化鐘1. 5~2. 5g/l，甘油40.Og/l，PTMl溶液4. 35ml/l，抑為5~ 6。
[0010] 優(yōu)選地，培養(yǎng)基配方為：蛋白腺lOg/L黃豆粉5g/L，85%憐酸13mlA，碳酸巧 0. 33g/L，，屯水硫酸儀7. 4g/l，硫酸錠8g/L，氨氧化鐘2g/l，甘油40.Og/l，PTMl溶液 4. 35ml/L，抑為 5. 5。
[0011] 優(yōu)選地，培養(yǎng)基配方為：蛋白腺20g/L，黃豆粉10g/L，85%憐酸14ml/L，碳酸巧 0. 4g/l，屯水硫酸儀7g/l，硫酸錠6g/L，氨氧化鐘2. 5g/l，甘油40.Og/l，PTMl溶液4. 35ml/ L，抑為5. 5。
[0012] 所述蛋白腺為微生物來源或者酵母蛋白腺。本發(fā)明按照Invitrogenlife technologies公司《Pichiafermentationprocessguidelines》中的調(diào)控方法進(jìn)行畢赤 酵母的發(fā)酵培養(yǎng)。所述的畢赤酵母指W己斯德畢赤酵母（Pichiapastoris)GSllS作為表達(dá) 宿主的基因重組菌，所述的發(fā)酵為在發(fā)酵罐中利用畢赤酵母進(jìn)行甲醇誘導(dǎo)表達(dá)外源蛋白人 膜島素原。
[0013] 一種基于本發(fā)明所述培養(yǎng)基進(jìn)行畢赤酵母發(fā)酵產(chǎn)人膜島素原的方法，具體包含W 下步驟：
[0014] (1)種子液的制備：將保存的畢赤酵母甘油菌種接于含100mLYPD培養(yǎng)基的500ml 搖瓶，30°C，250巧m搖床培養(yǎng)19~20h，作為種子液；
[0015] (2)分批培養(yǎng)發(fā)酵：IL種子液接入含1化發(fā)酵培養(yǎng)基的5化發(fā)酵罐中，起始培養(yǎng)條 件為30°C，pH5. 0,轉(zhuǎn)速30化pm，通氣量0.Sm3A。隨著培養(yǎng)的進(jìn)行，相應(yīng)增大轉(zhuǎn)速和通氣 量，控制溶氧20~30%，培養(yǎng)19~2Ih;
[0016] (3)分批甘油補(bǔ)料培養(yǎng)：分批培養(yǎng)結(jié)束后，WlOmlA/L的速率流加含12ml/LPTMl 溶液的50%甘油5~化，培養(yǎng)過程中調(diào)整轉(zhuǎn)速和通氣量控制溶氧20~30%;
[0017] (4)甲醇誘導(dǎo)培養(yǎng)：分批甘油補(bǔ)料結(jié)束后，控制溫度為25~28°C，抑為3.O~5. 0， W3. 6ml/h/L的速率流加含12ml/LPTMl溶液的甲醇5~化后，增大甲醇補(bǔ)料速率為IOml/ h/l，直至發(fā)酵結(jié)束。誘導(dǎo)過程中調(diào)整轉(zhuǎn)速和通氣量控制溶氧20~30%;
[001引 妨取樣及發(fā)酵結(jié)束：甲醇誘導(dǎo)培養(yǎng)開始后，每3~12小時(shí)取發(fā)酵液樣品一次， 3000~1200化pm離屯、5~lOmin，測定上清液中人膜島素原表達(dá)量，待表達(dá)量增加緩慢或 減少時(shí)，結(jié)束發(fā)酵。
[0019] 步驟（1)的YTO培養(yǎng)基由W下方法制備：酵母粉10邑/1，膜蛋白腺20g/l，葡萄糖 20g/L，12rC滅菌 20min。
[0020] 步驟（4)的溫度優(yōu)