胺)3uL，25°C下分別反應80min后清洗干燥，再點樣0.lmg/L的鏈霉親和素(SA)溶液3uL，4°C下反應1.5h，清洗干燥后點樣pH為5.0的lmg/mL的50萬分子量CS-b1tin 3uL，4°C下分別反應2h后清洗干燥，然后點樣含有氧化劑的單體溶液3uL(溶液組成:2mol/L的丙烯酰胺，0.025mol/L的PEGDA，0.01mol/L的硝酸鈰銨)，37°C下分別反應2h后清洗干燥。
[0040]所述捕獲探針序列為(5，-3，):CCGGTT CAT GCC GCC CAT-SH ；
[0041]所述目標探針序列為:(5’ -3’ ):
[0042](I)完全互補序列:ATG GGC GGC ATG AAC CGG AGG CCC ATC CTC ;(該序列為 p53基因特征DNA序列片段)；
[0043](2)不互補序列(對照實驗):AAT GTA TGA TGT GGT TAG ACC GTT AAG ATT ；
[0044]所述信標探針序列為(5，-3’):B1tin-GAG GAT GGG TCT ；
[0045]所述雜交液中SSC溶液的配制，常常配制為20xSSC(pH = 7.6)的母液，使用時進行稀釋。20xSSC(pH = 7.6)的配制:稱取17.53g氯化鈉及8.82g檸檬酸鈉溶于80mL去離子水，調節(jié)溶液pH至7.6后，定容至10mL后，高溫高壓滅菌，冷卻至室溫保存。
[0046]a、為本發(fā)明的放大效果:金表面+捕獲探針+互補序列+鏈霉親和素(SA) +生物素修飾殼聚糖(CS-b1tin)+聚合點樣液；見圖1，說明本發(fā)明方法可以用于DNA的檢測。
[0047]b、對比情況1:金表面+捕獲探針+非互補序列+鏈霉親和素(SA) +生物素修飾殼聚糖(CS-b1tin) +聚合點樣液；見附圖1，說明本方法檢測特異性好，可以很靈敏的檢測出目標分子，而不能檢測出非目標分子。
[0048]C、對比情況2:金表面+捕獲探針+互補序列+生物素修飾殼聚糖(CS-b1tin) +聚合點樣液；本對照缺少鏈霉親和素(SA)，即未能將分子識別部分與信號放大部分連接在一起，輔助說明在本發(fā)明中，如果還原劑不能成功連接，則不能進行信號放大。
[0049]d、對比情況3:金表面+捕獲探針+鏈霉親和素(SA)+生物素修飾殼聚糖(CS-b1tin)+聚合點樣液。說明金表面及捕獲探針不會產(chǎn)生實驗噪聲。
[0050]實施例1結果及表征見說明書附圖2。
[0051]實施例2:殼聚糖-硝酸鈰銨氧化還原聚合輔助信號放大體系對不同濃度P53基因特征DNA目標序列的檢測
[0052](I)同實施例1步驟(I)。
[0053](2)同實施例1步驟⑵。
[0054](3)超聲清洗后的金基片在室溫下用濃硫酸:雙氧水(v/v = 7:3)浸泡Ih后晾干，于4°C用1uM的末端巰基修飾的捕獲探針DNA點樣3uL，過夜反應，清洗干燥后用100ug/mL的BSA溶液于室溫下浸泡30min后干燥。在上述基片上分別點樣不同濃度目標探針的雜交點樣液(點樣液組成:5XSSC，20%去離子甲酰胺)3uL，42°C下分別反應SOmin后清洗干燥，再點樣信標探針濃度為5uM的雜交點樣液(點樣液組成:5XSSC，20%去離子甲酰胺)3uL，25°C下分別反應80min后清洗干燥再點樣0.lmg/L的SA溶液3uL，4°C下反應1.5h，清洗干燥后點樣pH為5.0的lmg/mL的50萬分子量CS-b1tin 3uL，4°C下分別反應2h后清洗干燥，然后點樣含有氧化劑的單體溶液3uL(溶液組成:2mol/L的丙烯酰胺，0.025mol/L的PEGDA，0.01mol/L的硝酸鈰銨)，37°C下分別反應2h后清洗干燥。
[0055]所述捕獲探針序列為(5，-3，):CCGGTT CAT GCC GCC CAT-SH ；
[0056]所述目標探針序列為(5，-3，):ATG GGC GGC ATG AAC CGG AGG CCC ATC CTC ;(該序列為P53基因特征DNA序列片段)；
[0057]所述信標探針序列為(5，-3’):B1tin-GAG GAT GGG TCT ；
[0058]實施例2結果及表征見說明書附圖3，說明本發(fā)明涉及的信號放大方法對DNA的檢測限為0.05nMo
[0059]實施例3:殼聚糖-硝酸鈰銨氧化還原聚合輔助信號放大體系對P53序列單堿基突變的檢測
[0060](I)同實施例1步驟(I)。
[0061](2)同實施例1步驟(2)。
[0062](3)超聲清洗后的金基片在室溫下用濃硫酸:雙氧水(v/v = 7:3)浸泡Ih后晾干，于4°C用1uM的末端巰基修飾的捕獲探針DNA點樣3uL，過夜反應，清洗干燥后用100ug/mL的BSA溶液于室溫下浸泡30min后干燥。在上述基片上分別點樣不同濃度的待測目標探針雜交點樣液(點樣液組成:5XSSC，20%去離子甲酰胺)3uL，42°C下分別反應80min后清洗干燥，再點樣信標探針濃度為5uM的雜交液3uL，25°C下分別反應80min后清洗干燥，再點樣0.lmg/L的SA溶液3uL，4°C下反應1.5h，清洗干燥后點樣pH為5.0的lmg/mL的50萬分子量CS-b1tin 3uL，4°C下分別反應2h后清洗干燥，然后點樣含有氧化劑的單體溶液3uL(溶液組成:2mol/L的丙烯酰胺，0.025mol/L的PEGDA，0.01mol/L的硝酸鈰銨)，37°C下分別反應2h后清洗干燥。
[0063]所述捕獲探針序列為(5，-3，):CCGGTT CAT GCC GCC CAT-SH ；
[0064]所述目標探針序列為(5’ -3’ ):
[0065](I)全互補序列:ATG GGC GGC ATG AAC CGG AGG CCC ATC CTC ；
[0066](2)單堿基突變序列:ATG GGC GGC ATG AAC CGG AGA CCC ATC CTC ；
[0067]所述信標探針序列為(5’-3’ ):B1tin-GAGGATGGG TCT ；
[0068]實施例3結果及表征見說明書附圖5及附圖6。說明本發(fā)明所涉及的信號放大方法可以檢測P53基因的單堿基突變，且檢測限達到0.1nM。
【主權項】
1.一種氧化還原聚合輔助信號放大方法，其特征在于:將還原劑連接在待檢測生物體系中所用的信號標記分子上，然后加入可與其產(chǎn)生活性自由基從而形成氧化還原對的氧化劑，并同時加入單體，對應的氧化劑還原劑組成可通過反應產(chǎn)生的活性自由基引發(fā)單體原位聚合，放大被測物質信號。2.按照權利要求1的一種氧化還原聚合輔助信號放大方法，其特征在于:在加入單體和氧化劑的時候還加入交聯(lián)劑，交聯(lián)劑用量微量，相對于單體的物質的量為0.5-2%。3.按照權利要求1或2的一種氧化還原聚合輔助信號放大方法，其特征在于:氧化劑、單體溶液直接滴加到與還原劑連接后的信號標記分子物質上。4.按照權利要求1或2的一種氧化還原聚合輔助信號放大方法，其特征在于:待檢測生物分子為DNA序列片段或RNA序列片段或及其單點突變序列，或微量蛋白質。尤其可用于疾病相關微量DNA、RNA序列片段或及其單點突變序列，或疾病相關微量蛋白質。5.按照權利要求1或2的一種氧化還原聚合輔助信號放大方法，其特征在于:還原劑為富含羥基類聚合物物質或維生素C，對應的可產(chǎn)生活性自由基的氧化劑為四價鈰鹽、過氧化氫。6.按照權利要求1或2的一種氧化還原聚合輔助信號放大方法，其特征在于:富含羥基類聚合物物質組成，結構中富含大量活性氨基及羥基的富含羥基類聚合物物質，或人工合成的重復單元富含羥基的聚合物。7.按照權利要求1或2的一種氧化還原聚合輔助信號放大方法，其特征在于:當還原劑為天然大分子物質殼聚糖時，其化學修飾的步驟包括如下: (1)將生物素、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)和二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)溶解于N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，其中N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)和二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)相對于生物素過量，40-60°C (優(yōu)選50°C )下反應至少24h，然后趁熱過濾，向濾液中加入大量無水乙醚，攪拌至白色沉淀不再明顯出現(xiàn)時將之放入冰浴中靜止至少2h后過濾，收集得到白色沉淀，再將以上粗產(chǎn)物置于熱的異丙醇中攪拌溶解后置于冰箱中，過濾收集結晶，再次重結晶后真空干燥，得到末端NHS化的生物素； (2)將殼聚糖分散在DMSO溶液中，加入單元糖摩爾當量1-10%的生物素活性酯，并加入與活性酯相同摩爾當量的無水三乙胺，室溫下攪拌至少48h，所得粗產(chǎn)物用滲析袋在乙酸水溶液中滲析，滲析未反應的小分子，待滲析至溶液透明時，再用去離子水充分滲析后冷凍干燥，得到生物素修飾的殼聚糖。8.按照權利要求7的一種氧化還原聚合輔助信號放大方法，其特征在于:N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)、二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)和生物素的摩爾比1.1:1.1:1。9.按照權利要求1或2的一種氧化還原聚合輔助信號放大方法，其特征在于:將上述生物素修飾的殼聚糖與末端生物素修飾的信號標記分子反應。10.按照權利要求1或2的一種氧化還原聚合輔助信號放大方法，其特征在于:在末端生物素修飾的信號標記分子物質上滴加鏈霉親和素反應后，再滴加生物素修飾的殼聚糖進行反應，滴加生物素修飾的殼聚糖溶液可根據(jù)需要調節(jié)pH值進行優(yōu)化。
【專利摘要】一種新型氧化還原聚合輔助信號放大用于分子診斷的方法，屬于分子診斷技術領域。本發(fā)明利用連接于待檢測物質上的還原劑如富含羥基類大分子物質、維生素C等，與氧化劑如四價鈰鹽、過氧化氫等構成氧化還原對，發(fā)生氧化還原反應產(chǎn)生活性自由基，從而在常溫、常壓、水溶液等極其溫和的條件下引發(fā)單體原位聚合，達到放大被測物質信號的目的。利用本發(fā)明所述方法對p53基因序列及其單點突變序列進行檢測，檢測靈敏度可達0.1nM，且具有極高的裸眼分辨能力。本發(fā)明所述信號放大及檢測方法還可用于其他疾病基因及蛋白質的檢測等相關領域。
【IPC分類】C12Q1/68, G01N33/68
【公開號】CN105154521
【申請?zhí)枴緾N201510246917
【發(fā)明人】楊晶, 文飛, 莊得權
【申請人】北京化工大學
【公開日】2015年12月16日
【申請日】2015年5月14日