3的氨基酸序列為GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO:5)；
蛋白混合物組:與陰性對照組相同，將相同數(shù)量的PBMC加入到PVDF膜檢測板中，再加入等體積含蛋白CFP10、ESAT-6-和EspC的無血清培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，CFP10、ESAT-6-和EspC濃度均為5Pg/ μ I ；
將上述5組細胞均在37°C、5%C02培養(yǎng)箱中孵育16-20小時；分別取出檢測板，棄培養(yǎng)上清液，用PBS沖洗檢測板3-4遍，再用PBS洗板1-2次，每次來回輕輕晃動5下，最后一次洗板后拍干。在每個孔中加入生物素標記抗人IFN-γ單克隆抗體工作液，置37°C孵育I小時。棄液體，用PBS洗板3-5次，每次來回輕輕晃動5下，最后一次洗板后拍干，每孔加入酶結合物工作液，置37°C孵育I小時。棄液體，用PBS洗板5次，每次來回輕輕晃動5下，最后一次洗板后拍干，每孔加入100 μ I的顯色液，置37°C避光顯色5-10分鐘至斑點大小肉眼清晰可見，棄液體，用去離子水或自來水洗滌檢測板正反面及底座3-5遍，扣干孔里的水，終止顯色，將板放入37°C烘箱干燥4小時或者室溫干燥過夜。顯色結果用CTLImmunoSpot S6 ELISpot分析儀進行自動分析。
[0050]實驗結果:
實驗分析結果如圖4所示，從中可以看出在相同面積內(nèi)，本發(fā)明融合蛋白刺激PBMC所得的斑點數(shù)(237)明顯多于(Gly4Ser)3-融合蛋白組(150)和蛋白混合物組(81)，說明本發(fā)明將蛋白CFP10、ESAT-6-和EspC進行融合表達后，可顯著提高PBMC產(chǎn)生結核相關細胞因子的能力，并且本發(fā)明中對連接肽的改進也帶來了不可預料的效果，現(xiàn)常用的連接肽(Gly4Ser)3用于連接CFP10、ESAT_6和EspC融合表達后效果不及本發(fā)明改進后的連接肽GGGGSGGGSGGSGS。說明使用本發(fā)明連接肽GGGGSGGGSGGSGS能夠提高本發(fā)明融合蛋白的活性，誘導PBMC分泌細胞因子的效果更好。
[0051]實施例8:特異性融合蛋白分別誘導健康人、經(jīng)BCG免疫的健康人及PPD陽性患者的PBMC分泌IFN- γ對比
I)分別選取健康人、經(jīng)BCG(卡介苗)免疫的健康人和PH)陽性患者的肝素鈉抗凝外周靜脈血樣本，密度分層法分離PBMC，經(jīng)過細胞計數(shù)后使用無血清培養(yǎng)基將其稀釋到2.5 X 16個/ml的濃度備用。
[0052]2)采用ELISP0T檢測INF-γ分泌的方法，選擇PVDF膜檢測板(預先使用抗人IFN-γ單克隆抗體包被過夜，4°C條件保存)作為反應板，每孔加入2.5父105個PBMC，每個樣本設置3個檢測孔，分別是陰性對照(加入無血清培養(yǎng)基)、實驗組(加入本發(fā)明融合蛋白)和陽性對照組(加入植物凝集素PHA)，37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育16-20小時。
[0053]3)第二天依次加入生物素標記抗人IFN-γ單克隆抗體、酶結合物工作液，顯色液。顯色結果用CTL ImmunoSpot S6 ELISpot分析儀進行自動分析。
[0054]實驗檢測結果如圖5所不，從結果中可以看出，未感染結核病的健康人和經(jīng)BCG免疫的健康人的PBMC細胞不會被本發(fā)明融合蛋白(實施例2制備的融合蛋白)誘導分泌IFN-γ，即沒有出現(xiàn)斑點，只有PH)陽性樣本的實驗孔中有斑點，說明本發(fā)明融合蛋白的刺激作用不受BCG的影響，對感染結核病的外周血單個核細胞(PBMC)具有很好的特異性的活性，誘導PBMC分泌細胞因子的效果更好。
[0055]實施例9:CFP-10-ESAT-6-EspC融合蛋白與不同融合蛋白的刺激效果對比
采用分子克隆方法分別獲得對CFP-10、ESAT-6和EspC蛋白以不同順序進行連接的融合蛋白，包括 CFP-10- EspC -ESAT-6、ESAT6-CFP10- EspC、ESAT6_EspC -CFP10、EspC-CFP-10-ESAT-6 和 EspC- ESAT-6- CFP-1O0
[0056]分別選用以下融合蛋白對PPD陽性結核患者的PBMC進行處理，并用ELISP0T法檢測各組中PBMC分泌IFN-γ的水平，各組所用到的融合蛋白分別為:
CFP-1O-連接肽-ESAT-6-連接肽-EspC (簡稱 CFP-10- ESAT-6-EspC)、
CFP-1O-連接肽-EspC-連接肽-ESAT-6 (簡稱 CFP-10- EspC-ESAT-6)、
ESAT6-連接肽-CFPlO-連接肽-EspC (簡稱 ESAT-6- CFP-10-EspC)、
ESAT6-連接肽-EspC -連接肽-CFPlO (簡稱 ESAT-6- EspC-CFP-lO)、
EspC-連接肽-CFP-10-連接肽-ESAT-6 (簡稱 EspC-CFP-lO- ESAT-6)、
EspC-連接肽-ESAT-6-連接肽-CFP-10 (簡稱 EspC-ESAT-6- CFP-10)、
CFP-10-連接肽-ESAT-6-連接肽-Rvl978 (簡稱 CFP-10- ESAT-6- Rvl978)、
CFP-10-連接肽-ESAT-6-連接肽-Rv3425 (簡稱 CFP-10- ESAT-6- Rv3425)；
其中Rvl987和Rv3425分別為RD2區(qū)和RDll區(qū)相應基因編碼的蛋白；
上述連接肽的氨基酸序列均為GGGGSGGGSGGSGS (SEQ ID NO:3);同時設置陰性對照(無血清培養(yǎng)基)和陽性對照(用植物凝集素PHA處理);具體的處理過程和檢測方法同以上實施例所述。
[0057]實驗檢測結果如圖6所示，從中可以看出，融合蛋白CFP-lO-ESAT-6-EspC處理組中檢測的斑點數(shù)最多，其次是CFP-10、ESAT-6和EspC按其他順序連接而成的融合蛋白，而CFP-10、ESAT-6和其他抗原蛋白(Rvl978、Rv3425)連接而成的融合蛋白對PBMC的刺激效果最差。說明本明發(fā)將CFP-10、ESAT-6和EspC三種抗原蛋白通過特定連接肽連接而成的融合肽產(chǎn)生了不可預料的效果，具有可特異性顯著誘導外周血單個核細胞產(chǎn)生結核相關細胞因子(INF-y、IL-2與TNF-α等)的能力，尤其是融合肽CFP-lO-ESAT-6-EspC產(chǎn)生的誘導效果最為顯著。
[0058]上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
【主權項】
1.一種融合蛋白，其特征在于，包含CFP-1O、ESAT-6和EspC三個蛋白，蛋白之間通過連接肽連接。2.根據(jù)權利要求1所述的融合蛋白，其特征在于:連接肽氨基酸序列為GGGGSGGGSGGSGS (SEQ ID NO:3)。3.根據(jù)權利要求1所述的融合蛋白，其特征在于:CFP-10、ESAT-6和EspC蛋白為全序列蛋白或表達抗原活性的部分功能區(qū)域多肽。4.根據(jù)權利要求1~3所述的融合蛋白，其特征在于:該融合蛋白為CFP-10-連接肽-ESAT-6-連接肽-EspC、CFP-1O-連接肽-EspC-連接肽-ESAT-6、ESAT6-連接肽-CFPlO-連接肽-EspC、ESAT6-連接肽-EspC -連接肽-CFP10、EspC_ 連接肽-CFP-10-連接肽-ESAT-6或者EspC-連接肽-ESAT-6-連接肽-CFP-10。5.根據(jù)權利要求1~3所述的融合蛋白，其特征在于:該融合蛋白為CFP-10-連接肽-ESAT-6-連接肽-EspC。6.根據(jù)權利要求5所述的融合蛋白，其特征在于:融合蛋白CFP-10-連接肽-ESAT-6-連接肽-EspC的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。7.根據(jù)權利要求6所述的融合蛋白，其特征在于:編碼融合蛋白CFP-10-連接肽-ESAT-6-連接肽-EspC的核酸序列如SEQ ID NO:2所示。8.權利要求1-7任一項所述的融合蛋白能夠誘導外周血單個核細胞產(chǎn)生結核相關細胞因子的融合蛋白。9.權利要求1-7任一項所述的融合蛋白作為結核病檢測抗原的應用。10.權利要求1-7任一項所述的融合蛋白在結核病預防治療中作為刺激物的應用。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于誘導外周血單個核細胞產(chǎn)生結核特異性細胞因子的融合蛋白。本發(fā)明的融合蛋白包含CFP-10、ESAT-6和EspC三個蛋白，蛋白之間通過連接肽連接。本發(fā)明提供的融合蛋白與現(xiàn)有的刺激物相比，其作用更高效、敏感性更強、特異性更高、刺激效果好。同時，本發(fā)明融合蛋白刺激PBMC產(chǎn)生大量結核桿菌抗原特異性的IFN-γ、IL-2、TNF-α等結核相關因子，且這一刺激誘導反應不受卡介苗的干擾。本發(fā)明將更有效的提高結核病的檢出率，對結核病的控制具有積極的意義。本發(fā)明的融合蛋白作為刺激物，可應用于結核病致病及免疫預防機制的研究，以及進一步的對結核病的控制中。
【IPC分類】C07K19/00, G01N33/68
【公開號】CN105218681
【申請?zhí)枴緾N201510697756
【發(fā)明人】黃曦, 馮思源, 楊錕, 田國寶, 吳敏昊
【申請人】中山大學
【公開日】2016年1月6日
【申請日】2015年10月21日