-連接肽融合基因；切膠回收融合片段作為模板，同時(shí)加入ESAT-6 DNA模板，再用CFPlO的上游引物和ESAT-6的下游引物進(jìn)行重疊PCR，獲取CFPlO-連接肽-ESAT-6融合基因；同理，用CFPlO的上游引物和連接肽鏈2的下游引物進(jìn)行重疊PCR，獲取CFP-10-連接肽-ESAT-6-連接肽融合基因，切膠回收融合片段；最后用CFPlO的上游引物和EspC的下游引物進(jìn)行重疊PCR，獲取CFPlO-連接肽-ESAT-6-連接肽EspC融合基因(其核酸序列如SEQ ID N0:2所示)，切膠回收融合片段。
[0036]4)將CFPlO-連接肽-ESAT-6-連接肽EspC融合基因片段連接到pMD19_T載體上。挑取單克隆，菌液PCR篩選陽(yáng)性克隆，最后酶切鑒定。將表達(dá)載體pET-28a和上述陽(yáng)性克隆的質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切(BamH I和Hind III)，目的基因乙醇沉淀回收，載體過(guò)柱回收。然后用T4 DNA Ligase對(duì)酶切的載體和目的片段進(jìn)行連接，再轉(zhuǎn)化到表達(dá)宿主大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞中。挑取單克隆，菌液PCR鑒定與雙酶切鑒定后獲得的陽(yáng)性菌落進(jìn)行測(cè)序鑒定。選取鑒定正確的重組菌進(jìn)行保種，備用。
[0037]實(shí)施例2:融合蛋白CFP-10-連接肽-ESAT-6-連接肽-EspC的誘導(dǎo)表達(dá)和純化取上述實(shí)施例1鑒定正確的含有CFP-10-連接肽-ESAT-6-連接肽-EspC目的基因片段(其核酸序列如SEQ ID N0:2所示)的重組表達(dá)菌接入20 ml含卡那抗性的LB培養(yǎng)基中，37°C，250rpm，振蕩培養(yǎng)6 h。高壓滅菌2L的LB培養(yǎng)基，每個(gè)IL的錐形瓶中放500ml，共分為4個(gè)瓶子。每個(gè)瓶子中加入2.5ml活化后的菌液，370C，250rpm，振蕩培養(yǎng)約3h，使菌液0D600為0.5。把錐形瓶放入冷水中，并對(duì)搖床降溫，冷卻后再誘導(dǎo)。每瓶中加入IPTGJi其終濃度為0.5mM，放入20°C搖床，200rpm，誘導(dǎo)20小時(shí)。離心:4°C，5000rpm，45min。離心后，棄上清，加入懸菌緩沖液重懸，隨后將液體轉(zhuǎn)移至50ml離心管中，每管內(nèi)液體量30ml，放在-20°C凍存。反復(fù)凍融3個(gè)循環(huán)，冰浴超聲破碎菌體后離心:4°C，7000rpm，45min。吸取離心所得上清、過(guò)濾，把濾液收集到新的50ml離心管中，分別收集上清、沉淀。SDS-PAGE蛋白電泳，考馬斯亮藍(lán)染色后觀察結(jié)果，確定該重組菌可以正確表達(dá)目的蛋白。對(duì)所得的重組菌進(jìn)行擴(kuò)大誘導(dǎo)培養(yǎng)，對(duì)誘導(dǎo)表達(dá)的目的蛋白進(jìn)行收集和純化，即可獲得純化后的融合蛋白CFP-10-連接肽-ESAT-6-連接肽-EspC (其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示)，以下簡(jiǎn)稱(chēng) CFP-10- ESAT-6-EspCo
[0038]實(shí)施例3:密度梯度離心法分離人外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)
使用新鮮肝素鋰或肝素鈉的采血管或真空采血管無(wú)菌抽取待檢人員外周靜脈血4ml，顛倒使抗凝劑和血液混勻待用。準(zhǔn)備2個(gè)15ml離心管，分別加入與采血量等體積的注射用生理鹽水和淋巴細(xì)胞分離液。將新鮮肝素抗凝血與生理鹽水混勻后，勻速緩慢加入分離液中，22°C，1800g離心20min，離心后，可見(jiàn)PBMCs細(xì)胞存在于云霧狀層中。吸取PBMCs細(xì)胞層至新的15ml離心管內(nèi)，用RPM1-1640培養(yǎng)液補(bǔ)齊至12ml，于22°C，600g離心1min0倒掉上清，用RPM1-1640培養(yǎng)液補(bǔ)齊至5ml，輕輕吹打沉淀重懸后，于22°C，350g離心1min0棄上清，加入0.5ml-lml無(wú)血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。采用臺(tái)盼藍(lán)染色手工計(jì)數(shù)法或使用合適的設(shè)備自動(dòng)計(jì)數(shù)。根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果，用無(wú)血清培養(yǎng)基將其稀釋為所需濃度的PBMC細(xì)胞懸液。
[0039]實(shí)施例4:ELISA檢測(cè)本發(fā)明融合蛋白誘導(dǎo)PI3D陽(yáng)性患者的PBMC分泌IL_2的作用
(I)分別選取PF1D (結(jié)核菌素試驗(yàn))陽(yáng)性結(jié)核患者、未感染結(jié)核分枝桿菌的人的肝素鈉抗凝外周靜脈血樣本，按實(shí)施例3中的密度分層法分離PBMC，經(jīng)過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)后使用無(wú)血清培養(yǎng)基將PBMC稀釋到2.5 X 16個(gè)/ml的濃度，將細(xì)胞接種至96孔板中，每孔加入2.5 X 10 5個(gè)細(xì)胞，將實(shí)施例2制備的融合蛋白CFP-10-連接肽-ESAT-6-連接肽-EspC用無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋為濃度5yg/ml的工作液，向?qū)嶒?yàn)孔中加入已配制好的融合蛋白工作液，37°C、5% CO2條件下孵育18小時(shí)，取細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行相關(guān)細(xì)胞因子的檢測(cè)。
[0040](2)采用預(yù)先包被了抗人IL-2單克隆抗體的ELISA板，加入上步所提細(xì)胞培養(yǎng)上清液，室溫孵育2小時(shí)，用Wash buffer清洗ELISA板3_5次，往檢測(cè)孔中加入抗人IL_2抗體，室溫孵育I小時(shí)，然后去除抗體，用Wash buffer清洗ELISA板3_5次，再加入HRP標(biāo)記的二抗，37°C孵育I小時(shí)，然后去除二抗，用Wash buffer清洗ELISA板3-5次，加入配制好的TMB顯色底物，室溫下避光顯色20分鐘，最后加入終止液終止顯色，30分鐘內(nèi)用酶標(biāo)儀進(jìn)行結(jié)果分析。
[0041]檢測(cè)結(jié)果如圖1所示，從中可以看出與健康人相比，PPD陽(yáng)性患者的PBMC在經(jīng)過(guò)融合蛋白CFP-lO-ESAT-6-EspC刺激后其IL-2的分泌量有明顯提高。
[0042]實(shí)施例5:酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法(ELISP0T)檢測(cè)本發(fā)明融合蛋白誘導(dǎo)PPD陽(yáng)性的PBMC分泌IFN-γ水平
I)選取PH)(結(jié)核菌素試驗(yàn))陽(yáng)性結(jié)核患者的肝素鈉抗凝外周靜脈血樣本，按實(shí)施例3中的密度分層法分離PBMC，經(jīng)過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)后使用無(wú)血清培養(yǎng)基將其稀釋到2.5 X 16個(gè)/ml的濃度備用。
[0043]2)選擇PVDF膜檢測(cè)板(預(yù)先使用抗人IFN-γ單克隆抗體包被過(guò)夜，4°C條件保存)作為反應(yīng)板，每孔加入2.5 X 15個(gè)上步制備的PBMC，每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)檢測(cè)孔，分別是空白對(duì)照(加入無(wú)血清培養(yǎng)基)、實(shí)驗(yàn)孔(加入實(shí)施例2制得的融合蛋白進(jìn)行刺激，濃度為5Pg/ml)和陽(yáng)性對(duì)照孔(加入植物凝集素PHA進(jìn)行刺激，濃度為5Pg/ml)，37°C、5% 0)2培養(yǎng)箱中孵育16-20小時(shí)。
[0044]3)取出檢測(cè)板，棄培養(yǎng)上清液，用PBS沖洗檢測(cè)板3-4遍，再用PBS洗板1_2次，每次來(lái)回輕輕晃動(dòng)5下，最后一次洗板后拍干。在每個(gè)孔中加入ΙΟΟμΙ標(biāo)記抗體工作液，置37°C孵育I小時(shí)。棄液體，用PBS洗板3-5次，每次來(lái)回輕輕晃動(dòng)5下，最后一次洗板后拍干，每孔加入酶結(jié)合物工作液，置37°C孵育I小時(shí)。棄液體，用PBS洗板5次，每次來(lái)回輕輕晃動(dòng)5下，最后一次洗板后拍干，每孔加入100 μ I的顯色液，置37°C避光顯色5-10分鐘至斑點(diǎn)大小肉眼清晰可見(jiàn)，棄液體，用去離子水或自來(lái)水洗滌檢測(cè)板正反面及底座3-5遍，扣干孔里的水，終止顯色，將板放入37°C烘箱干燥4小時(shí)或者室溫干燥過(guò)夜。顯色結(jié)果用CTL ImmunoSpot S6 ELISpot分析儀進(jìn)行自動(dòng)分析。
[0045]實(shí)驗(yàn)分析結(jié)果如圖2所示，從中可以看出PI3D陽(yáng)性的PBMC在經(jīng)過(guò)本發(fā)明融合蛋白刺激后其IFN-γ的分泌量有明顯提高。
[0046]實(shí)施例6:ELISP0T方法檢測(cè)本發(fā)明融合蛋白誘導(dǎo)PPD陽(yáng)性的PBMC分泌TNF-α水平
(I)選取Pro陽(yáng)性結(jié)核患者的肝素鈉抗凝外周靜脈血樣本，密度分層法分離PBMC，經(jīng)過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)后使用無(wú)血清培養(yǎng)基將其稀釋到2.5X 16個(gè)/ml的濃度備用。
[0047](2)采用ELISP0T檢測(cè)的方法，選擇PVDF膜檢測(cè)板(預(yù)先使用抗人TNF-α單克隆抗體包被過(guò)夜，4°C條件保存)作為反應(yīng)板，每孔加入2.5 X 15個(gè)PBMC，每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)檢測(cè)孔，分別是空白對(duì)照、實(shí)驗(yàn)孔(加入實(shí)施例2制得的融合蛋白)和陽(yáng)性對(duì)照孔(加入植物凝集素PHA)，37°C、5%C02培養(yǎng)箱中孵育16-20小時(shí)。第二天依次加入生物素標(biāo)記抗人TNF-α單克隆抗體、酶結(jié)合物工作液，顯色液。顯色結(jié)果用CTL ImmunoSpot S6 ELISpot分析儀進(jìn)行自動(dòng)分析。
[0048]上述實(shí)驗(yàn)分析結(jié)果如圖3所示，從中可以出pro陽(yáng)性的PBMC在經(jīng)過(guò)本發(fā)明融合性蛋白刺激后其TNF- α的分泌量有明顯提高ο
[0049]實(shí)施例7:本發(fā)明融合蛋白對(duì)外周血單個(gè)核細(xì)胞產(chǎn)生結(jié)核相關(guān)細(xì)胞因子的誘導(dǎo)作用實(shí)驗(yàn)
實(shí)驗(yàn)方法:
本實(shí)驗(yàn)設(shè)置5組，各組的實(shí)驗(yàn)設(shè)置如下所述:
陰性對(duì)照組:將PPD陽(yáng)性結(jié)核患者的PBMC加入到PVDF膜檢測(cè)板(預(yù)先使用抗人IFN-γ單克隆抗體包被過(guò)夜，4°C條件保存)中，每孔加入2.5X101 ?81^，再加入50“1無(wú)血清培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)；
陽(yáng)性對(duì)照組:與陰性對(duì)照組相同，將相同數(shù)量的PBMC加入到相同的PVDF膜檢測(cè)板中，再加入等體積含植物凝集素PHA的無(wú)血清培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)；
本發(fā)明融合蛋白組:與陰性對(duì)照組相同，將相同數(shù)量的PBMC加入到PVDF膜檢測(cè)板中，再加入等體積含實(shí)施例2制備的融合蛋白的無(wú)血清培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，融合蛋白的工作液濃度為5 Pg/ μ I ;
(Gly4Ser) 3-融合蛋白組:與陰性對(duì)照組相同，將相同數(shù)量的PBMC加入到PVDF膜檢測(cè)板中，再加入等體積含(Gly4Ser) 3-融合蛋白的無(wú)血清培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)；(Gly4Ser)3-融合蛋白濃度為5Pg/yl ;所述(Gly4Ser) 3_融合蛋白為CFPlO-連接肽(Gly4Ser) 3-ESAT-6-連接肽(Gly4Ser) 3_EspC，其中連接肽(Gly4Ser)