一種鑒定多花黃精的方法及其專用引物對的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種鑒定多花黃精的方法及其專用引物對。
【背景技術(shù)】
[0002] 多花黃精（Polygonatumcyrtonema)是百合科黃精屬的植物，是中國的特有植物， 作為常用補益藥，其藥用歷史已達2000余年之久，多花黃精主產(chǎn)于四川、貴州、湖南、湖北 等地生長于海拔500米至2100米的地區(qū)，一般生于灌叢、林下和山坡陰處其味甘性平，入 肺、脾、腎三經(jīng)，有補氣潤肺、養(yǎng)陰、健脾益腎的功效。臨床上用于脾胃氣虛，營養(yǎng)不良、肺虛 燥咳，精血不足等癥。
[0003] 2010年版《中國藥典（一部）》規(guī)定作為黃精藥用的有3種基源植物，分別為黃 精（PolygonatumsibiricumRed)、多花黃精（PolygonatumcyrtonemaHua)和漬黃精 (PolygonatumingianumColl,etHemsl·)。為保證用藥安全，人們使用過多種方法對多花 黃精進行真實性鑒定，然而多花黃精及其偽品的形態(tài)和化學(xué)成分高度相似，且傳統(tǒng)形態(tài)學(xué) 和化學(xué)鑒別常受到人為或環(huán)境因素的影響。但目前已報導(dǎo)的多花黃精的分子鑒別方法往往 表現(xiàn)為重現(xiàn)性差、操作復(fù)雜、周期長等缺陷，不能滿足實際需要，因此迫切需要建立快捷而 簡便的真?zhèn)纹疯b定方法，以保障多花黃精臨床用藥的安全。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題如何快速、簡便的鑒定多花黃精。
[0005] 為解決上述問題，本發(fā)明首先提供了一種用于鑒定多花黃精的引物對。
[0006] 本發(fā)明所提供的用于鑒定多花黃精的引物對，可由引物DH-1F和引物DH-2R組成， 所述引物DH-1F和所述引物DH-2R均為單鏈DNA分子，核苷酸序列依次為序列表中的序列 1和序列2。
[0007] 上述用于鑒定多花黃精的引物對中，所述引物DH-1F和所述引物DH-2R的摩爾比 可為1:1。
[0008] 上述用于鑒定多花黃精的引物對的應(yīng)用，可為如下al)-a6)中任一種：
[0009]al)制備用于檢測或輔助檢測多花黃精的試劑盒；
[0010] a2)檢測或輔助檢測待測樣品中是否含有或候選含有多花黃精；
[0011]a3)制備用于鑒定或輔助鑒定多花黃精的試劑盒；
[0012]a4)鑒定或輔助鑒定待測樣品是否為或候選為多花黃精；
[0013]a5)制備用于鑒定或輔助鑒定市售多花黃精的真?zhèn)涡缘脑噭┖校?br>[0014]a6)鑒定或輔助鑒定市售多花黃精的真?zhèn)涡浴?br>[0015] 本發(fā)明還提供了用于鑒定多花黃精的試劑盒。
[0016] 本發(fā)明所提供的用于鑒定多花黃精的試劑盒含有上述用于鑒定多花黃精的引物 對。
[0017] 本發(fā)明還保護上述用于鑒定多花黃精的試劑盒的制備方法，可包括將上述用于鑒 定多花黃精的引物對的各引物分別單獨包裝的步驟。
[0018] 上述用于鑒定多花黃精的試劑盒的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護范圍。上述用于鑒定 多花黃精的試劑盒的應(yīng)用可為如下bl)或b2)或b3):
[0019]bl)檢測或輔助檢測待測樣品中是否含有或候選含有多花黃精；
[0020] b2)鑒定或輔助鑒定待測樣品是否為或候選為多花黃精；
[0021]b3)鑒定或輔助鑒定市售多花黃精的真?zhèn)涡浴?br>[0022] 本發(fā)明還提供了一種檢測待測樣品是否含有或候選含有多花黃精的方法，可包括 如下步驟：提取待測樣品的總DNA，采用上述用于鑒定多花黃精的引物對進行PCR擴增，如 果能夠?qū)崿F(xiàn)有效擴增，則所述待測樣品中含有或候選含有多花黃精；如果不能實現(xiàn)有效擴 增，則所述待測樣品中不含有或候選不含有多花黃精。所述待測樣品可為中藥材，或，所述 中藥材的基源植物，或，取自所述中藥材的基源植物的組織或器官。
[0023] 本發(fā)明還提供了一種鑒定待測樣品是否為或候選為多花黃精的方法，可包括如下 步驟：提取待測樣品的基因組DNA，采用上述用于鑒定多花黃精的引物對進行PCR擴增，如 果能夠?qū)崿F(xiàn)有效擴增，則所述待測樣品為或候選為多花黃精；如果不能實現(xiàn)有效擴增，則所 述待測樣品不為或候選不為多花黃精。所述待測樣品可為中藥材，或，所述中藥材的基源植 物，或，取自所述中藥材的基源植物的組織或器官。
[0024] 本發(fā)明還提供了一種鑒定市售多花黃精的真?zhèn)涡缘姆椒?，可包括如下步驟：提取 市售多花黃精的基因組DNA，采用上述用于鑒定多花黃精的引物對進行PCR擴增，如果能夠 實現(xiàn)有效擴增，則所述市售多花黃精為或候選為真品；如果不能實現(xiàn)有效擴增，則所述市售 多花黃精為或候選為偽品。
[0025] 上述任一所述方法中，所述"能夠?qū)崿F(xiàn)有效擴增"可為PCR擴增產(chǎn)物中含有 300-400bp的DNA片段。
[0026] 上述任一所述方法中，所述"不能實現(xiàn)有效擴增"可為PCR擴增產(chǎn)物中不含有 300-400bp的DNA片段。
[0027] 所述300-400bp的DNA片段可為330bp的DNA片段。
[0028] 所述330bp的DNA片段具體可為序列表中序列3所示的DNA片段。
[0029] 上述任一所述方法中，進行所述PCR擴增時，采用的退火溫度可為58°C~62°C。
[0030] 上述任一所述方法中，進行所述PCR擴增時，采用的退火溫度具體可為58°C。
[0031] 上述任一所述方法中，進行所述PCR擴增時，采用的擴增程序具體可為94°C5min; 94°C45s，58°Clmin，30 個~40 個循環(huán)；72°C7min。
[0032] 上述任一所述方法中，進行所述PCR擴增時，采用的擴增程序具體可為94°C5min; 94°C45s，58°Clmin，35 個循環(huán)；72°C7min。
[0033] 上述任一所述方法中，進行所述PCR擴增時，采用的待測樣品的基因組DNA的濃度 可為 10ng~200ng。
[0034] 上述任一所述方法中，進行所述PCR擴增時，采用的待測樣品的基因組DNA的濃度 具體可為l〇〇ng。
[0035] 上述任一所述中藥材可為多花黃精（Polygonatumcyrtonema)和/或玉竹 (Polygonatumodoratum(Mill.)Druce)和/或小黃精（PolygonatumuncinatumDiels)和 / 或苦黃精和 / 或馬鈴薯（Solanumtuberosum)和 / 或紅薯（Ipomoeabatatas(L. )Lam.) 和 / 或山藥（DioscoreaoppositaThunb.)和 / 或生姜（ZingiberofficinaleRoscoe) 和 / 或芋頭（Colocasiaesculenta(L. )Schoot) 〇
[0036] 利用本發(fā)明提供的鑒定多花黃精的方法及其專用引物對能夠快捷而簡便的鑒定 多花黃精，以保障多花黃精臨床用藥的安全，具有重大的推廣前景和應(yīng)用價值。
【附圖說明】
[0037] 圖1為多花黃精及混渚品的基因組DNA。
[0038] 圖2為通用引物對PCR擴增凝膠電泳圖。
[0039] 圖3為特異性PCR引物對的特異性檢測。
【具體實施方式】
[0040] 下面結(jié)合【具體實施方式】對本發(fā)明進行進一步的詳細描述，給出的實施例僅為了闡 明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。
[0041] 下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0042] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0043]以下實施例中的定量試驗，均設(shè)置三次重復(fù)實驗，結(jié)果取平均值。
[0044]本實施例中的多花黃精（Polygonatumcyrtonema)、玉竹（Polygonatum odoratum(Mill. )Druce)、小黃精（PolygonatumuncinatumDiels)、苦黃精、馬鈴薯 (Solanumtuberosum)、紅墓(Ipomoeabatatas(L. )Lam.)、山藥(Dioscoreaopposita Thunb.)、生姜(ZingiberofficinaleRoscoe)以及芋頭(Colocasiaesculenta(L.) Schoot)均為在采集地采集。采集信息見表1。各中藥材均符合中國藥典（2010年版）一 部正文各藥材項下的有關(guān)規(guī)定，通過鑒定，各位中藥材實物與名稱相符，質(zhì)量符合標(biāo)準(zhǔn)。
[0045] 表1.實驗材料信息表

[0048] 實施例1、制備用于鑒定多花黃精的試劑盒及其使用方法
[0049] -、用于鑒定多花黃精的引物對的設(shè)計與合成
[0050] 從GenBank查找多花黃精及混淆品的psba-trnh序列和測序結(jié)果，使用BioEdit 軟件進行序列分析，校對和對比，找出多花黃精特有的變異位點，發(fā)現(xiàn)多花黃精114bp處為 C，而其他混淆品為T，410bp處正品多花黃精為A，而其他混淆品為C。根據(jù)多花黃精特有的 變異位點設(shè)計并合成用于多花黃精鑒定的大量PCR引物對。
[0051] 對獲得的大量PCR引物對依次進行篩選、效果驗證、特異性驗證和靈敏度驗證，最 終獲得一對特異性、靈敏度最佳的引物對如下：
[0052]引物DH-1F:5' -TGTATTAAGAATCGTTGAAGGAGTC-3'（序列表中序列 1);
[0053]引物DH-2R:5' -AGCTAATCATTTATCGAGAAAAATT-3'（序列表中序列 2)。
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