998, 53, 1216 ；3)Chem.Pharm. Bull. 1992, 40, 1481 ；4)Chem.Heterocycl.Compd. 2002, 38, 539〇
[0280]方案lb
[0281]
[0282] 可選擇地，如在方案lb中所示，可使用標(biāo)準(zhǔn)酰胺鍵或肽鍵形成偶聯(lián)試劑使胺 2與酸3偶聯(lián)。本領(lǐng)域有機(jī)化學(xué)家知曉用于酰胺鍵偶聯(lián)的許多試劑并且?guī)缀跛羞@些 試劑可用于實(shí)現(xiàn)偶聯(lián)的酰胺產(chǎn)物。EDAC和三乙胺在四氫呋喃或B0PC1中以及二異丙基 乙胺在氯仿中的組合已被最頻繁地使用，而DEPBT或其它偶聯(lián)試劑諸如PyBop也可使 用。其它有用的偶聯(lián)條件采用擬1'1]((&)丄0^111.5〇(3.〇16111(：〇_.1994,201 ;〇3)工八111· Chem.Soc. 1994, 116, 11580)。此外，DEPBT(3-(二乙氧基磷酰氧基）-1，2, 3-苯并三 嗪-4(3H)_酮）和N，N-二異丙基乙胺，通常稱為許尼希堿，代表了形成酰胺鍵且提供式I 化合物的另外的有效方法。DEPBT可購(gòu)自Aldrich或根據(jù)在OrganicLett.，1999, 1，91中 所述的操作制備。通常，可使用惰性溶劑諸如DMF或THF，而也可使用其它非質(zhì)子溶劑。
[0283] 實(shí)施例
[0284] 以下實(shí)施例說(shuō)明了如上文一般性描述的式I化合物的典型合成法。這些實(shí)施例僅 是說(shuō)明性的，并且不是以任何方式限制本發(fā)明。對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員而言這些試劑和 起始物質(zhì)是容易得到的。
[0285] 化學(xué)實(shí)驗(yàn)
[0286]所詵實(shí)施例的典銦橾作和表征：
[0287] 除非另有說(shuō)明，溶劑和試劑是在從商業(yè)來(lái)源所獲得時(shí)的狀態(tài)直接使用的，在氮?dú)?氣氛下進(jìn)行反應(yīng)。在硅膠60(0. 040-0. 063粒度；EMScience提供）上進(jìn)行快速色譜。1HNMR光譜在BrukerDRX-500f上以 500MHz記錄（或者BrukerDPX-300B或VarianGemini300 上以300MHz記錄，根據(jù)所描述的）?；瘜W(xué)位移以ppm記錄，δ標(biāo)尺相對(duì)于δTMS= 0而言。 以下內(nèi)參比用于以下溶劑中的殘余質(zhì)子：CDC13〇h 7. 26)、CD3OD〇h 3. 30)和DMS0-d6〇H 2. 50)。標(biāo)準(zhǔn)首字母縮略詞用于描述多重性模式：s(單峰），d(雙重峰），t(三重峰），q(四 重峰），m(多重峰），b(寬峰），app(表觀）。偶合常數(shù)（J)以赫茲給出。所有液相色譜（LC) 數(shù)據(jù)是在ShimadzuLC-10AS液相色譜儀上使用SPD-10AVUV-Vis檢測(cè)器及質(zhì)譜記錄的，并 且質(zhì)譜（MS)數(shù)據(jù)測(cè)定使用電噴霧模式的LC的Micromass平臺(tái)。
[0288] HPLC方法（即化合物分離）
[0289] 經(jīng)制備性HPLC純化的化合物稀釋于甲醇（1.2mL)并使用Shimadzu LC-8A或 LC-10A自動(dòng)化制備性HPLC系統(tǒng)純化。
[0290] 所選實(shí)施例的典型操作和表征：
[0291] 中間體AC0C00H或AC0C0C1:
[0292] 中間體AC0C00H或AC0C0C1的制備描述于先前公開的申請(qǐng)（W. Blair, et al.W0-200076521，0· Wallace, et al W0-200204440，T· Wang, et al.W0-200162255和 T. Wang, et al. TO-2002062423)。AC0C00H的某些實(shí)例如下列出。
[0293]
[0294] 制備式I的一般橾作：
[0295] A)
[0296]
[0297] 將2-酮基酸（1當(dāng)量）、胺（1-5當(dāng)量）、3_(二乙氧基磷酰氧基）-1，2,3_苯并三 嗪-4 (3H)-酮（DEPBT)或0-(1H-苯并三唑-1-基）-N，N，Ν'，Ν'-四甲基脲鑰六氟硼酸鹽 (TBTU) (1-5當(dāng)量）或（2-(7-氮雜-1Η-苯并三唑-1-基）-1，1，3, 3-四甲基脲鑰六氟磷酸 鹽）（HATU) (1 - 5當(dāng)量）和許尼希堿或N-甲基嗎啉（1-100當(dāng)量）混合于THF或DMF中。將 混合物在室溫或115°C攪拌17小時(shí)。將THF或DMF經(jīng)減壓蒸發(fā)除去并將殘留物在乙酸乙 酯和飽和的NaHC(yK溶液之間分配。將水層用乙酸乙酯萃取。合并有機(jī)相并經(jīng)無(wú)水MgS04 干燥。真空濃縮得到粗產(chǎn)物，將其經(jīng)滴定或重結(jié)晶或硅膠柱色譜法或Shimadzu自動(dòng)化制備 性HPLC系統(tǒng)純化。
[0298] B)
[0299]
[0300] 將2-酮基?；龋?當(dāng)量）、胺（1-5當(dāng)量）和許尼希堿或Et3N(l-100當(dāng)量）在 THF或DMF中混合。將混合物在室溫或115°C攪拌17小時(shí)。將THF或DMF經(jīng)減壓蒸發(fā)除去 并將殘留物在乙酸乙酯和飽和NaHOVK溶液之間分配。將水層用乙酸乙酯萃取。合并有 機(jī)相并經(jīng)無(wú)水MgS04干燥。真空濃縮得到粗產(chǎn)物，將其經(jīng)滴定或重結(jié)晶或硅膠柱色譜法或 Shimadzu自動(dòng)化制備性HPLC系統(tǒng)純化。
[0301]


















[0328] 化合物2001的合成：
[0329]步驟1:
[0330]
[0331] 在氮?dú)鈿夥障略赑將溴化氰（22g)緩慢加入至苯胺（10g)在無(wú)水乙醚（150mL)中 的經(jīng)攪拌溶液中。將反應(yīng)混合物在室溫?cái)嚢杓s3小時(shí)。將反應(yīng)混合物經(jīng)硅藻土填料濾過(guò)并 用乙醚（3x20mL)洗滌。將濾液減壓濃縮得到粗的N-苯基氨基氰（8g)，其為棕色液體，其 無(wú)需純化即可用于下一步反應(yīng)。1HNMR(DMS0-d6):δ6. 97-7. 03(m，3H)，7. 30-7. 36(m，2H), 10. 13(bs, 1H)。MS:117. 2(M-1)+。
[0332]步驟2:
[0333]
[0334] 在氮?dú)鈿夥障略?°C向N-苯基氨基氰（8g)在無(wú)水乙醚（50mL)中的經(jīng)攪拌溶液中 緩慢加入HC1在無(wú)水乙醚中的溶液（20mL)。將反應(yīng)混合物在室溫?cái)嚢杓s30分鐘。將析出的 鹽經(jīng)布氏漏斗濾過(guò)并在氮?dú)鈿夥障掠靡颐眩?x20mL)洗滌。將N-苯基氨基氰的鹽酸鹽吸收 于無(wú)水乙醇（100mL)中，在氮?dú)鈿夥障戮徛尤脞Z/碳（2g)。使用氣囊將反應(yīng)混合物在氫 氣氣氛下攪拌16小時(shí)。反應(yīng)完成后，將反應(yīng)混合物經(jīng)硅藻土填料濾過(guò)并用甲醇（3x20mL) 洗滌。將濾液減壓濃縮得到預(yù)期的N-苯基甲脒（7g)，其為無(wú)色液體。MS:119. 1(M-1)+。
[0335]步驟 3:
[0336]
[0337] 在氮?dú)庀略?°C向N-芐基氮雜革酮（5g)在無(wú)水乙醚（50mL)中的經(jīng)攪拌溶液中 緩慢加入HC1在無(wú)水乙醚中的溶液（20mL)。將反應(yīng)混合物在室溫?cái)嚢杓s30分鐘。將析出 的鹽經(jīng)布氏漏斗濾過(guò)并在氮?dú)鈿夥障掠靡颐眩?x20mL)洗滌。將N-芐基氮雜蕈酮的鹽酸 鹽吸收于乙酸（15mL)和HBr在乙酸（15mL)中的混合物中，然后在氮?dú)鈿夥障戮徛尤脘?(4g)。將反應(yīng)混合物在室溫?cái)嚢?小時(shí)。將反應(yīng)混合物減壓濃縮除去揮發(fā)物并將殘留物 用乙醚（10mL)稀釋。析出固體，傾析溶劑并重復(fù)進(jìn)行操作三至四次。將固體減壓干燥得 到1-芐基-5-溴-2, 3, 6, 7-四氫-1H-氮雜革-4-醇的HBr鹽（9g)，其無(wú)需任何純化即可 進(jìn)一步使用。4NMR(DMS0-d6) :δ2. 6-2. 95 (m, 3H)，3. 05-3. 17 (m, 1H)，3. 25-3. 41 (m, 1H)， 3· 45-3. 60 (m，2H)，4· 43-4. 48 (m，2H)，5· 12-5. 19 (m，1H)，7· 34-7. 55 (m，5H)，9· 96-10. 09 (bs, 1H)。MS:284. 2(M+1)+。
[0338]步驟 4:
[03391
[0340] 在氮?dú)鈿夥障聦⒔饘兮c（1.6g)緩慢加入至無(wú)水乙醇（lOOmL)中。將反應(yīng)混合物 在室溫?cái)嚢柚钡剿薪饘兮c溶解，之后加入N-苯基甲脒（4g)，隨后在氮?dú)鈿夥障录尤?-芐 基-5-溴-2, 3, 6, 7-四氫-1H-氮雜萆-4-醇（10g)。將反應(yīng)混合物在80°C在氮?dú)鈿夥?下攪拌16小時(shí)，之后冷卻至室溫。將反應(yīng)混合物減壓濃縮除去乙醇并將殘留物用冰冷的 水（50mL)稀釋。將產(chǎn)物用乙酸乙酯（3x50mL)萃取并將合并的有機(jī)層用鹽水（50mL)洗 滌。將有機(jī)層經(jīng)無(wú)水Na2S04干燥并使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮。將所得的粗產(chǎn)物經(jīng)柱色譜（使用 MeOH/CHCl3 (0. 3:9. 7)作為洗脫劑）純化得到6-芐基-1-苯基-1，4, 5, 6, 7, 8-六氫咪唑并 [4, 5-d]氮雜蕈（700mg)，其為棕色液體。1HNMR(DMS0-d6) :δ2. 59-2. 62 (m, 2H)，2. 75-2. 8 3 (m，6H)，3· 76 (s，2H)，7· 24-7. 30 (m，1H)，7· 32-7. 38 (m，2H)，7· 44-7. 50 (m，4H)，7· 50-7. 52 ( m，1H)，7· 52-7. 54 (m，2H)，7· 59 (s，1H)。MS: 304. 2 (M+l)+。
[0341]步驟 5:
[0342]
[0343] 在氮?dú)鈿夥障孪?-芐基-1-苯基-1，4, 5, 6, 7, 8-六氫咪唑并[4, 5_d]氮雜革 (〇.65g)在無(wú)水甲醇（20mL)中的經(jīng)攪拌溶液中緩慢加入氫氧化鈀（0.3g)。將反應(yīng)混合物 在3kg壓力在氫氣氣氛下攪拌16小時(shí)。反應(yīng)完成后，將反應(yīng)混合物經(jīng)硅藻土填料濾過(guò)并 用甲醇（3x20mL)洗滌。將濾液減壓濃縮得到預(yù)期的1-苯基-1，4, 5, 6, 7, 8-六氫咪唑并 [4, 5-d]氮雜輩:（160mg)，其為棕色固體。1HNMR(DMS0-d6) :δ2. 57-2. 61 (m, 2H)，2. 79-2. 8 5 (m，2H)，3· 56-3. 61 (m，2H)，3· 79-3. 85 (m，2H)，7· 35-7. 38 (m，2H)，7· 44-7. 51 (m，3H)，7· 65(s，1H) 〇MS:213. 2(Μ+1)+〇
[0344]步驟6:
[0345]
[0346]向 2- (4-甲氧基-7- (3-甲基-1H-1, 2, 4-三唑-1-基）-1H-吡咯并[2, 3-c] 吡啶-3-基）-2-氧代乙酸（200mg)在無(wú)水DMF(5mL)中的經(jīng)攪拌溶液中加入1-苯 基-1,4, 5, 6, 7, 8-六氫咪唑并[4, 5-d]氮雜.蕈（150mg)在無(wú)水二氯甲燒（5mL)中的溶 液、2-氯-1，3-二甲基咪唑鑰氯化物（54mg)和iPr2NEt(0. 5mL)。將反應(yīng)混合物在室溫 攪拌16小時(shí)，之后將溶劑減壓除去。將所得的油狀物用二氯甲烷（50mL)稀釋，用10% NaHC03(10mL)和鹽水（10mL)洗滌。將有機(jī)層經(jīng)無(wú)水Na2S04干燥并使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃 縮。將所得的粗品經(jīng)柱色譜（使用Me0H/CHCl3(1.0:9.0)作為洗脫劑）純化得到化合 物 2001 (30mg)，其為白色固體。1HNMR(400MHz,DMS0-d6) :δ2. 50 (s, 3H)，2. 70-2. 73 (t, 1H)，2· 76-2. 78 (t，1H)，2· 88-2. 95 (m，2H)，3· 63-3. 65 (t，2H)，3· 82-3. 84 (m，2H)，3· 94 (s， 3H)，7. 35 - 7. 59 (m，5H)，7. 68 (s，1H)，7. 86-7. 87 (d，1H)，8. 19-8. 22 (d，1H)，9. 23 (s，1H)，12 ? 37(bs，1H)。MS:497. 2(M+1)+。
[0347] 實(shí)施例的生物學(xué)數(shù)據(jù)
[0348] ."μΜ"表示微摩爾；
[0349] ."mL"表示毫升；
[0350] ."μ1"表示微升；
[0351] ?"mg"表示毫克；
[0352] 用于獲得表1所報(bào)道的結(jié)果的物質(zhì)和試驗(yàn)操作描述于下文。
[0353]細(xì)胞：
[0354] ·病毒制備-伸人懷腎細(xì)朐系293T(HEK293T)繁殖于Dulbecco's改良Eagle 培養(yǎng)基（11^;[1：1'08611，031'18匕3(1，0六）中，該培養(yǎng)基中含有10%胎牛血清（?133,3丨81]^，31:· Louis，M0)。人T細(xì)胞白血病細(xì)胞MT2(AIDSResearchandReferenceReagent Program,Cat. 237)繁殖于RPMI1640(Invitrogen,Carlsbad,CA)中，其含有 10%胎牛血清 (FBS,Hyclone,Logan,UT) 〇
[0355] ?病毒感染-通討用表汰HIV-1LAI包膜的質(zhì)粒以及含有HIV-1LAI前病毒cDNA的 質(zhì)粒（其中包膜基因被熒火蟲螢光素酶報(bào)道基因替換）來(lái)共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，以制備單 圓感染報(bào)道子病毒（Chenetal·，Ref. 41)。使用制造商（Invitrogen,Carlsbad,CA)描述 的LipofectAMINEPLUS試劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染。
[0356] 試驗(yàn)操作
[0357] 1.使MT2細(xì)胞接種于黑色384孔板中，細(xì)胞密度為5X103個(gè)細(xì)胞/孔，在含有10% FBS的 25μ1RPMI1640 中。
[0358] 2.將化合物（稀釋于二甲基亞砜和生長(zhǎng)培養(yǎng)基中）以12. 5μ1/孔加入至細(xì)胞中， 使最終測(cè)定濃度為彡50ηΜ。
[0359] 3.將12. 5μ1的在Dulbecco's改良Eagle培養(yǎng)基中的單圓感染報(bào)道子病毒加至 接種的細(xì)胞和化合物中，約〇. 01的感染復(fù)數(shù)（Μ0Ι)，使最終體積為50μ1/孔。
[0360] 4.使病毒感染的細(xì)胞在37°C的C02溫育器中溫育，感染之后72h收獲。
[0361] 5.如制造商描述的，使用螢光素酶報(bào)道基因測(cè)定試劑盒 (Steady-Glo,Promega，Madison,WI)，通過(guò)測(cè)量感染細(xì)胞中熒光素酶表達(dá)來(lái)監(jiān)測(cè)病毒感染。 然后使用EnVisionMultilabel板讀取器（PerkinElmer,Waltham,MA)，通過(guò)測(cè)量焚光來(lái)定 量熒光素酶活性。
[0362] 6.通過(guò)以下方式計(jì)算每種化合物的抑制百分?jǐn)?shù)：對(duì)在每種化合物存在時(shí)感染的 細(xì)胞中熒光素酶表達(dá)的水平定量為不存在化合物時(shí)感染的細(xì)胞觀察到的百分?jǐn)?shù)，再用100 減去此測(cè)定的值。
[0363] 7.EC5。提供了比較本發(fā)明化合物抗病毒效能的方法。用MicrosoftExcelXlfit 曲線擬合軟件計(jì)算50%抑制的有效濃度（EC5。）。對(duì)于每一種化合物，通過(guò)使用四參數(shù)邏輯 模型（模型205)，以10種不同濃度計(jì)算的抑制百分?jǐn)?shù)生成曲線?；衔锏腅C5。數(shù)據(jù)顯示 于表2中。表1是表2中的數(shù)據(jù)的索引。
[0364] 表1.EC5。的索引生物學(xué)數(shù)據(jù)
[0365]





[0372] 前文描述僅僅是說(shuō)明性的，并且不應(yīng)理解為以任何方式限制本發(fā)明的范圍或基本 原則。事實(shí)上，除了本文顯示和描述的那些以外，對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，根據(jù)實(shí)施例和 前文描述，本發(fā)明的各種修改都是顯而易見的。這些修改也將落入所附權(quán)利要求書的范圍 內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種或多種式I化合物，包括其藥用鹽： 其中A選自：其中 a、b、c、d和 e 獨(dú)立選自氫、鹵素、氰基、硝基、C00R56、XR57、NAT、C (0) R7、C (0) NR55R56、B、 Q和E ; B 選自-C( = NR46) (R47)、C(0)NR4°R41、芳基、雜芳基、雜脂環(huán)基、S(0) 2Rs、S(0)2NR4°R41、 C(0)R7、XRSa、（C16)烷基NR4°R 41、（C16)烷基C00Rsb;其中所述芳基、雜芳基和雜脂環(huán)基任選 取代有一至三個(gè)相同或不同的鹵素或一至三個(gè)相同或不同的選自基團(tuán)F的取代基；其中所 述芳基為萘基或經(jīng)取代的苯基；其中所述雜芳基為單環(huán)或二環(huán)系統(tǒng)，對(duì)于單環(huán)系統(tǒng)而言其 含有3至7個(gè)環(huán)原子且在稠合的二環(huán)系統(tǒng)中含有至多12個(gè)環(huán)原子，所述環(huán)原子包括1至4 個(gè)雜原子；其中所述雜脂環(huán)基為3至7元單環(huán)，其可在環(huán)骨架中含有1至2個(gè)雜原子且其可 稠合至苯或吡啶環(huán)； Q選自扣6)烷基、（C3 7)環(huán)烷基和（C2 6)烯基；其中所述（Q 6)烷基和（C2 6)烯基任 選取代有一至三個(gè)相同或不同的鹵素或一至三個(gè)相同或不同的選自以下的取代基：c(0) NR55R56、羥基、氰基和XR57; E選自（Q 6)烷基、（C3 7)環(huán)烷基和（C2 6)烯基；其中所述（Q 6)烷基和（C2 6)烯基獨(dú)立 地任選取代有選自以下的成員：苯基、雜芳基、SMe、SPh、-C(0)NR56R57、C(0)R 57、S0JQ 6)烷 基和S02Ph ;其中所述雜芳基為單環(huán)系統(tǒng)，其含有3至7個(gè)環(huán)原子，所述環(huán)原子包括1至4個(gè) 雜原子； F選自（Q 6)烷基、（C3 7)環(huán)