醇-蛋白物的偶聯物。
[0017] 運是一種溫和的生物化學反應，通過與酸酢或簇酸反應形成醋鍵或酷胺鍵而得到 的偶聯物，在通常的生理條件下相對穩(wěn)定，并不會發(fā)生斷裂。
[0018] 本發(fā)明進一步設及一種藥物組合物，其含有如上所述的聚乙二醇-腫瘤壞死因子 a或聚乙二醇-腫瘤壞死因子TNFa類似物的偶聯物，W及藥學上可接受的載體。
[0019] 本領域技術人員能夠理解，本發(fā)明的藥物組合物可W根據具體的施用方式被配制 成各種本領域熟知的制劑形式，例如口服劑型（粉劑、片劑、膠囊、軟膠囊、液體藥物、糖漿、 馳丸、散劑、囊劑、粒劑），或表皮制劑（乳膏、軟膏、洗劑、凝膠、香脂、膏藥、糊劑、噴霧劑、氣 霧劑等等），或注射制劑（溶液、懸浮劑、乳劑）。在本發(fā)明范圍內優(yōu)選為注射制劑。
[0020] 根據本發(fā)明的藥物組合物可W包含藥學上可接受的載體、佐劑或稀釋劑，例如：填 充劑、崩解劑、潤滑劑、助懸劑、粘合劑、甜味劑、矯味劑、防腐劑、基質等。填充劑例如：淀粉、 預膠化淀粉、乳糖、甘露醇、甲殼素、微晶纖維素、薦糖等；崩解劑例如：淀粉、預膠化淀粉、 微晶纖維素、簇甲基淀粉鋼、交聯聚乙締化咯、低取代徑丙纖維素、交聯簇甲基纖維素鋼等； 潤滑劑例如：硬脂酸儀、十二烷基硫酸鋼、滑石粉、二氧化娃等；助懸劑例如：聚乙締化咯燒 酬、微晶纖維素、薦糖、瓊脂、徑丙基甲基纖維素等；粘合劑例如，淀粉漿、聚乙締化咯燒酬、 徑丙基甲基纖維素等。本發(fā)明的組合物可W通過利用本領域任何已知方法制成，W使病人 用藥后能提供快速、持久或緩慢釋放的活性成分。
[0021] 本發(fā)明進一步設及如上所述的聚乙二醇-腫瘤壞死因子a或聚乙二醇-腫瘤壞 死因子a類似物的偶聯物或者包含其的藥物組合物在制備用于預防和/或治療腫瘤或癌 癥的藥物中的用途。其中所述的腫瘤或癌癥可W是淋己癌、小細胞性或非小細胞性肺癌、前 列腺癌、腎癌、肝癌、大腸直腸癌、黑色素瘤、乳腺癌。
[0022] 本發(fā)明活性成分的給藥劑量可W根據個體的情況和重量、病情的嚴重程度、藥物 形式、給藥途徑W及給藥周期的不同而不同，其也可W由本領域技術人員進行選擇。劑量可W是每天單次給藥或每天分多次給藥。本發(fā)明聚乙二醇修飾的腫瘤壞死因子a的臨床有 效藥劑量至少為10至3000ng/m2/7-14天。
[0023] 本發(fā)明的藥物組合物通過各種途徑給藥至個體動物如哺乳動物（大鼠、小鼠、馴 化動物或人類），所有的給藥方式均是預期的，例如，給藥可W是皮下、皮內、膜間、栓劑和氣 霧劑給藥形式。 W24] 本發(fā)明中，術語聚乙二醇-TNFa偶聯物是個一般專有名詞，通常表示為 "燈NFaPEG)"。其表示由TNFa的特定基團和活化的聚乙二醇化學反應，經共價鍵連接 而形成的聚合體。其包含所有本發(fā)明的聚乙二醇-TNFa偶聯物和聚乙二醇-TNFa類似 物偶聯物。例如，可W包含TNF aSGPEG5、TNF aSGPEG10、TNF aSGPEG20、TNF aSCMPEG5、 TNF aSCMlO陽G、TNF aSCM20陽G。
[0025]本發(fā)明中所述的腫瘤壞死因子a (TNFa)，也包含了該蛋白分子基因相關的單點、 雙點突變、及多點突變的類似基因蛋白。
[0026] 本發(fā)明所述的"聚乙二醇化腫瘤壞死因子（蛋白）"、"聚乙二醇修飾的腫瘤壞死因 子（蛋白）"的意思是等同的，其等同于聚乙二醇-腫瘤壞死因子a偶聯物或聚乙二醇-腫 瘤壞死因子a類似物的偶聯物。
[0027] 本發(fā)明中所述的聚乙二醇按聚合單位、聚合方式的不同，分為直鏈和支鏈型；按聚 合度的不同可W劃分出不同分子量大小的聚乙二醇，如陽G5000、陽G10000、陽G20000 等等。
[0028] 本發(fā)明可W根據被修飾生物大分子的特點，利用一次化學反應、采用單一分 子量或不同分子量的聚乙二醇對TNFa W及腫瘤壞死因子a突變表達蛋白衍生物 (TNF a mutin)的表面氨基酸進行不同方式和不同程度的修飾，從而延長該藥物的生物活性 半衰期，增加水溶性，及降低生物大分子的毒副作用，在非腸道給藥條件下獲得預期的長效 治療效果。
[0029]W下將通過具體實施例和附圖詳細說明書本發(fā)明。
【附圖說明】
[0030] 圖1為顯示祀T28a(+)表達質粒的結構的圖。
[0031] 圖2為SDS-聚丙締酷胺凝焦電泳測定TNFa蛋白和TNFaSGPEG20純度的圖。
【具體實施方式】
[0032] W下結合實施例進一步說明本發(fā)明，但運些實施例僅用來說明本發(fā)明，而不W任 何方式限制本發(fā)明的范圍。 陽03引實施例1 TNFa蛋白的基因表達
[0034]運用全化學合成方法，將下列TNFa基因編制成大腸桿菌特殊的氨基酸表達密 碼（Pennica,D.化dwin, G. E. , Hayf lick, J. S. , at al,化ture, 1984, 312 (20/27), 724-729 ,Human tumour necrosis f過ctor:precursor structure, expression過打d homology to lymphotoxi打)置人表達質粒pET28a(+) (pET System Novagen Manual Ilth Edition, User Protocol TB055Rev. C 0611JN)中，然后根據Novagen公司本方法手冊中的常規(guī) 程序（NovagenUserProtocolTB055Rev.C0611JN)，將質粒穿入大腸桿菌化2UDE3)、I3L21值E3)sS(Novagen祀TSystemManual11化Edition)中，然后從將上述表達質粒的大 腸桿菌的瓊脂培養(yǎng)皿中挑選單一菌落，置入5mL的無菌LB(Luria-Bertani)培養(yǎng)基中（購 自國藥集團化學試劑有限公司），于37°C，按照標準操作手冊方式培養(yǎng)。然后按照1 %比例 逐步放大到5升的培養(yǎng)基，至菌密度ODze。為0.6-0. 8時，降溫至18°C，加入一定濃度的異丙 基-0 -D-硫代半乳糖巧（IPTG)誘導TNFa蛋白表達16小時。大腸桿菌體用500化pm離 屯、沉淀收集，然后用預冷（4°C)裂解緩沖液，于超聲破碎儀中破菌。祀T28a(+)表達的質粒 結構見圖1。
[0035] TNFa基因氨基酸序列
[00川實施例2TNFa蛋白類似物（突變體）的基因表達
[0042] 運用全化學合成方法，將下列TNFaA2化、TNFaG3化、TNFaA2化G3化基因編制成 大腸桿菌特殊的氨基酸表達編碼，置入表達質粒祀T28a(+)之中。在全化學合成TNFa基 因編碼時：1)將第21序列的丙基酸密碼，改成賴氨酸密碼，2)將第31位甘氨酸密碼改為賴 氨酸密碼，3)將第21序列的丙基酸密碼，第31位甘氨酸密碼同時改成賴氨酸密碼，然后根 據Novagen公司方法手冊中的程序（NovagenUserProtocolTB055Rev.C0611JN)，植入 pET28a(+)質粒（pETSystemNovagenManualIlthEdition，UserProtocolTB055Rev. C0611JN)，即可表達上述TNFa類似物突變體蛋白。有關上述TNFa蛋白類似物在大腸桿 菌化21 0E3)、BL21 〇)E3)sS瓊脂培養(yǎng)皿培養(yǎng)，無菌LB培養(yǎng)基放大，破菌，上清液收集，蛋白 純化等程序，均按照Novagen公司的方法手冊，如同上述實施例1，按照標準操作手冊方式 培養(yǎng)。
[0043]TNFa突變基因氨基酸序列

[0062] 實施例3TNFa蛋白及其突變體的純化
[0063] 如上實施例1和2中得到的裂解緩沖液破菌后的上清液包含著大量的水溶性表達 蛋白。將破菌后的上清液W1. 0毫升/每分鐘流速緩慢通過速流通儀離子（Ni-Se地aroseTM GFastFlow)親和柱（GEHealthcareBioscienceAB,Sweden),將TNFa蛋白留置于儀離子 柱上，然后用特制儀離子柱洗脫溶液，0.6M咪挫組胺（imidazole)水溶液洗脫，初步純化的 (〉95%)TNFa蛋白。將由此得到的蛋白通過速流通陰離子（SPS巧ha;rose?FastFlow)樹 脂交換柱（GEHealthcareBioscienceAB,Sweden),將蛋白留置于此樹脂離子交換柱上， 然后用含0. 5M化Cl的憐酸鹽緩沖液（pH8. 5)洗脫，得到進一步高度純化的（>99. 5%) TNFa蛋白。TNFa的突變衍生蛋白燈NFaA2化、TNFaG3化、TNFaA2化G3化）W同樣方法 純化。
[0064] 實施例4TNFa蛋白濃度、純度分析（SDS-聚丙締酷胺凝膠電泳（SDS-PAGE)蛋白 分析） W65] 蛋白濃度分析方法：采用化a壯ord-Low巧方法來測定蛋白質的濃度。該方法基于 不同濃度的蛋白質所結合的染料考馬斯亮藍的數據也有所不同而建立。首先W已知不同濃 度的標準蛋白所結合染料的量為依據，繪出標準曲線。然后，通過測定蛋白的染料結合量推 斷出該蛋白質樣品濃度。
[0066] 蛋白純度分析方法：蛋白生物大分子，由于分子量不同，在同一電場條件下，可由 SDS-聚丙締酷胺凝膠電泳（SDSPAG巧將不同分子量、不同種類的蛋白生物大分子分開。在 確定雜蛋白是否存在的同時，也可W確定未知蛋白質的純度和蛋白分子的大小。
[0067] 圖2為SDS-聚丙締酷胺凝焦電泳測定TNFa蛋白和TNFaSGPEG20純度的圖。由 圖2可知，實施例1中，裂解緩沖液破菌后的上清液包含著大量的水溶性表達蛋白，經過儀 離子親和柱純化后，可得到大量的低純度（>95%)TNFa蛋白。再進一步用離子交換樹脂純 化可W得到高純度（>99%)的TNFa蛋白。經過甲氧基陽G班巧酷亞胺戊二酸醋修飾后所 得的TNFaSGPEG20分子量增大而留滯于高分子量區(qū)域。 W側按照如上方法分析了各個TNFa蛋白突變體燈NFaA2化、TNFaG3化、TNFaA2化G3化