中生物合成類視色 素。
[0125]【表3】
[0126]
[0127] (2)使用所制備的重組穿梭載體制備轉(zhuǎn)化體
[0128] 在30°C和250rpm，在3mLYPD(每升20g蛋白胨、10g酵母提取物和20g葡萄糖） 培養(yǎng)基中攪拌釀酒酵母Y2805菌株以進(jìn)行種子培養(yǎng)。第二天，向50mLYH)培養(yǎng)基中接種入 種子培養(yǎng)液（〇. 5mL)，在30°C和180rpm攪拌以進(jìn)行主要培養(yǎng)3小時。
[0129] 在3,OOOrpm和4°C的條件下將培養(yǎng)液離心5分鐘以除去上清液。將細(xì)胞用25mL 的IXΤΕ/0. 1MLiAC緩沖液（10mMTris-HCl、lmMEDTA、100mMLiAC，并且pH7.5)洗滌 1 次，然后重懸浮在0. 5mL的IXTE/0. 1MLiAC緩沖液中以制備水溶性細(xì)胞（感受態(tài)細(xì)胞）。
[0130]將所制備的水溶性細(xì)胞（100μ1)、載體（5μ1)、鮭魚精子DNA(載質(zhì)DNA，Sigma D9156，美國）（5μl)和PEG/LiAC(40%PEG3350(QuiagenNeXtalStockPEG3350(200)， 貨號 133083)、10mMTris-HCl、lmMEDTA、100mMLiAC，并且pH7.5) (0.6mL)混合。將混合 液在30°C靜置30分鐘，然后添加100μ1的DMSO,并再次攪拌。所制備的混合細(xì)胞溶液在 42°C進(jìn)行熱休克處理15分鐘，在冰上冷卻5分鐘，在4°C離心1分鐘，然后除去上清液。所 獲得的球團(tuán)重懸浮在200μ1的TE緩沖液（10mMTris-HCl，ImMEDTA和pH7. 5)中，涂抹 在用作選擇性培養(yǎng)基的UD固體培養(yǎng)基（每升6. 7g的無氨基酸的酵母氮基質(zhì)（Difco?，貨 號 291940)、0· 77g的-UraDOSupplement(Clontech貨號 630416)、20g的右旋糖和 20g的 瓊脂，并且pH5. 8)上，在30°C培養(yǎng)2天以制備轉(zhuǎn)化體。
[0131]實施例1-2.從酵母菌轉(zhuǎn)化體制備類視色素
[0132] (1)酵母菌轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)
[0133] 在UD培養(yǎng)基（3mL)中接種單集落，并在30°C和250rpm攪拌以用于種子培養(yǎng)。
[0134] 在主培養(yǎng)物中，使用包含半乳糖的YPDG培養(yǎng)基（每升20g的蛋白胨、10g的酵母 提取物、l〇g的葡萄糖和l〇g的半乳糖）作為實驗組。作為其對照組，使用不包含半乳糖的 Yro培養(yǎng)基（每升20g的蛋白胨、10g的酵母提取物和20g的葡萄糖）。在培養(yǎng)中，將25mL 的YPDG培養(yǎng)基和YH)培養(yǎng)基分散在300mL帶擋板燒瓶（baffledflask)中，然后將5mL的 十二烷（貨號297879,Sigma，美國）放入兩相培養(yǎng)物的25mL培養(yǎng)基中以進(jìn)行類視色素生 產(chǎn)。
[0135] 起初將培養(yǎng)的菌株以0. 1 (0D_J的細(xì)胞濃度接種，并在30°C和180rpm于攪拌下 培養(yǎng)96小時。通過培養(yǎng)后72小時測定600nm(0D6Mnni)的光密度來評價細(xì)胞生長。
[0136] (2)類視色素的高效液相色譜（HPLC)分析
[0137] 在具有十二烷覆層（overlay)的兩相培養(yǎng)物時，收集包含類視色素的 相，在14,OOOrpm離心10分鐘以除去所有細(xì)胞碎片，然后用于HPLC分析。使用 HPLC(LC-20A,Shimadzu,Kyoto,日本）在370nm(視黃醛）和340nm(視黃醇和乙酸視黃醇 酯）的檢測波長分析十二燒相。使用具有SentryGuardC18(15mmX4. 6mm, 5m)的Symmetry C18(250mmX4. 6mm，5m)的HPLC柱進(jìn)行分析。使用流動相體積比為95:5的甲醇和乙腈。在 流動相流速為1. 〇ml/min、柱溫為40°C的條件下進(jìn)行HPLC分析。
[0138]將視黃醛（貨號R2500)、視黃醇（貨號R7632)和乙酸視黃醇酯（貨號R4632)(購 自Sigma)溶解在丙酮中，并用作標(biāo)準(zhǔn)化合物（圖3(A))。
[0139] 如圖3所示，可以看出在轉(zhuǎn)化體中產(chǎn)生的類視色素的峰（圖3(B))在與用作標(biāo)準(zhǔn) 化合物的視黃醇、視黃醛和乙酸視黃醇酯（圖3(A))相同的保留時間處清楚地顯示。因此， 將轉(zhuǎn)化體中產(chǎn)生的類視色素確定為與充當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)化合物的類視色素相同的成分。
[0140] (3)類視色素的液相色譜/質(zhì)譜（LC-MS/MS)分析
[0141] 為了分析由酵母菌轉(zhuǎn)化體產(chǎn)生的類視色素，進(jìn)行液相色譜/質(zhì)譜（LC-MS/MS)。
[0142] 獲得在轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)液中的十二烷相，將其真空蒸發(fā)，并溶解在與十二烷相具有 相同重量的甲醇中然后蒸發(fā)。使用離子阱質(zhì)譜儀分析所產(chǎn)生的類視色素的組成。
[0143]將用作分析裝置的具有SentryGuardC18 (15mmX4.6mm,5m)和ABSCIEXQtrap 3200的（商購自ABSCIEX)用于LC-MS分析。使用流動相體積比為95:5的甲醇和乙腈。
[0144] 在流動相流速為1.Oml/min、柱溫為30°C的條件下進(jìn)行HPLC分析。
[0145] 將視黃醇（貨號R7632)和乙酸視黃醇酯（貨號R4632)(購自Sigma)溶于甲醇中 并用作標(biāo)準(zhǔn)化合物。
[0146] 分析結(jié)果示于圖4中。
[0147] 如圖4所示，可以看出在轉(zhuǎn)化體中產(chǎn)生的類視色素的峰（圖4(B)和4(D))在與用 作標(biāo)準(zhǔn)化合物的視黃醇（圖4(A))和乙酸視黃醇酯（圖4(C))相同的保留時間處清楚地顯 不。
[0148]因此，可以確認(rèn)，將在轉(zhuǎn)化體中產(chǎn)生的類視色素確定為與充當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)化合物的類視 色素相同的成分，并且本發(fā)明的微生物能夠有效地生產(chǎn)類視色素。
[0149] (4)培養(yǎng)結(jié)果
[0150] 培養(yǎng)結(jié)果示于以下表4中。
[0151]【表4】
[0152]
[0153] 如表4中所示，可以看出培養(yǎng)72小時后的細(xì)胞濃度（0D6_J在包含半乳糖的培養(yǎng) 基中培養(yǎng)的實驗組中為22. 8,這大于在不包含半乳糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的對照組的18. 6。
[0154] 在實驗組，產(chǎn)生了 36μg/L的視黃醛、2. 8μg/L的視黃醇和32. 1μg/L的乙酸視黃 醇酯，并產(chǎn)生了總共約71μg/L的類視色素。另一方面，在對照組，產(chǎn)生了 19. 6μg/L的視 黃醛、1. 49μg/L的視黃醇和30. 6μg/L的乙酸視黃醇酯，并產(chǎn)生了總共約51. 7μg/L的類 視色素。
[0155] 當(dāng)轉(zhuǎn)化體中類視色素產(chǎn)生的總量除以細(xì)胞濃度時，實驗組的值為3. 11，而對照組 的值為2. 78。實驗組具有更高的值。經(jīng)確認(rèn)在包含半乳糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的實驗組中誘導(dǎo) 了參與類視色素產(chǎn)生的酶的表達(dá)。
[0156] 實施例2-1.棒狀桿菌轉(zhuǎn)化體的制備
[0157] 另外，如上所述，在累積番茄紅素的所述轉(zhuǎn)化體中，導(dǎo)入包含異源篩選的類視色素 生物合成基因（crtE、crtB、crtl、idi、crtY和BCMO)的穿梭載體，從而制備能夠產(chǎn)生類視 色素的棒狀桿菌轉(zhuǎn)化體。這將在以下部分更詳細(xì)地描述。
[0158] (1)谷氨酸棒狀桿菌的編碼類胡蘿卜素-ε-環(huán)化酶的基因crtYe/f的失活
[0159] 為了抑制癸異戊二烯黃素產(chǎn)生和累積番茄紅素，使編碼SEQIDNO22和SEQID NO23的氨基酸序列的crtYe/f基因（組）失活。
[0160]為了使crtYe/f基因失活，使用自殺載體pK19mobsacB("Handbookof Corynebacteriumglutamicum"，LotharEggeling等，ISBN0-8493-1821-1,2005，CRC出 版社）。
[0161] 基因的上游部分1036bp使用引物25和26擴(kuò)增?；虻南掠尾糠?057bp使用引 物27和28擴(kuò)增。
[0162] 使用兩個擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物作為模板，使用引物25和28來進(jìn)行PCR擴(kuò)增，使crtYe/ f基因缺失，獲得具有21bp的連接序列、長度為2102bp的PCR產(chǎn)物。將所獲得的2102bp 產(chǎn)物用Hindlll和Sbfl切割，并插入載體pK19m〇bsaCB的相同位點以制備重組自殺載體 pK19mobsacB-KOY〇
[0163] 通過谷氨酸棒狀桿菌手冊所述的方法用所制備的重組載體轉(zhuǎn)化谷氨酸棒狀桿菌 ATCC13032。
[0164]在"HandbookofCorynebacteriumglutamicum"（由CRC出版社于 2005 年出版） 已經(jīng)報道了通過兩步同源重組使特定基因位點缺失的方法。
[0165] 當(dāng)如上制備的pK19mobsacB-K0Y質(zhì)粒轉(zhuǎn)化棒狀桿菌以進(jìn)行缺失時發(fā)生第一次重 組。在該情況下，將載體序列插入（整合到）基因組，其可通過卡那霉素抗性進(jìn)行篩選。由 于具有插入有重組載體的基因組的菌株通過sacB基因產(chǎn)生果聚糖鹿糖酶（levansurase)， 其在10%蔗糖中顯示靈敏度。另外，當(dāng)使用以下表5的引物29和30將第一重組物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增時，如果獲得大小為169bp和987bp的PCR產(chǎn)物，則再次可以確定重組。
[0166] 通過第二次重組除去用于基因缺失的重組載體，其篩選為對蔗糖具有抗性。更具 體而言，為了進(jìn)行第二次重組，將第一次重組物接種至5mlBHI培養(yǎng)基（每升12. 5g的牛 腦、5g的牛心、10g的蛋白胨、5g的氯化鈉、2g的葡萄糖和2. 5g的磷酸二氫鈉）中，在30°C 和250rpm攪拌，并培養(yǎng)12小時。
[0167] 使用BHI培養(yǎng)基將培養(yǎng)液稀釋至初始濃度的10 3、10 4和10 5,將各自100μ1涂抹 在包含10%蔗糖的LB(每升10g的胰蛋白胨、5g的酵母提取物和10g的氯化鈉）瓊脂板 上，在30°C培養(yǎng)3天以獲得集落。當(dāng)使用引物29和30將第二重組物進(jìn)行PCR擴(kuò)增時，如果 獲得169bp的PCR產(chǎn)物則再次可以確定重組。該集落對20yg/ml的卡那霉素易感，并且不 生長，并最終制備了其中谷氨酸棒狀桿菌ATCC13032的crtYe/f基因失活的AcrtYe/f菌 株。
[0168]【表5】
[0169]
[0170] (2