-57 ;博維（Bowie)和薩奧爾，1989,美國(guó)國(guó) 家科學(xué)院院刊（Proc. Natl. Acad. Sci. USA)86:2152-2156 ;W0 95/17413;或TO 95/22625所 披露的那些?？梢允褂玫钠渌椒òㄒ族e(cuò)PCR、噬菌體展示（例如，洛曼（Lowman)等人， 1991，生物化學(xué)（Biochemistry) 30:10832-10837 ;美國(guó)專利號(hào) 5, 223, 409 ;W0 92/06204)以 及區(qū)域定向誘變（德比什爾（Derbyshire)等人，1986,基因（Gene)46:145;內(nèi)爾（Ner)等 人，1988, DNA 7:127)。
[0036] 可以結(jié)合誘變/改組方法與高通量自動(dòng)化篩選方法來(lái)檢測(cè)由宿主細(xì)胞表 達(dá)的克隆的、誘變的多肽的活性（內(nèi)斯（Ness)等人，1999，自然生物技術(shù)（Nature Biotechnology) 17:893-896)。編碼活性多肽的誘變的DNA分子可以回收自宿主細(xì)胞，并且 使用本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)方法對(duì)其進(jìn)行迅速測(cè)序。這些方法允許迅速確定多肽中單個(gè)氨基酸殘基 的重要性。
[0037] 融合多肽：感興趣多肽可以是一種雜合多肽，其中一種多肽的一個(gè)區(qū)域在另一種 多肽的一個(gè)區(qū)域的N-末端或C-末端處融合。
[0038] 該多肽可以是融合多肽或可裂解的融合多肽，其中另一種多肽在本發(fā)明多肽的 N-末端或C-末端處融合。通過(guò)將編碼另一多肽的多核苷酸融合到本發(fā)明的多核苷酸而 產(chǎn)生融合多肽。用于產(chǎn)生融合多肽的技術(shù)在本領(lǐng)域是已知的，并包括連接編碼多肽的編碼 序列，這樣使得它們?cè)诳騼?nèi)并且使得融合多肽的表達(dá)處于相同的一個(gè)或多個(gè)啟動(dòng)子和終止 子的控制下。融合多肽還可以使用內(nèi)含肽技術(shù)來(lái)構(gòu)建，其中融合多肽在翻譯后產(chǎn)生（庫(kù)珀 (Cooper)等人，1993,歐洲分子生物學(xué)學(xué)會(huì)雜志（EMBO J.) 12:2575-2583 ;道森（Dawson)等 人，1994,科學(xué)（Science) 266:776-779)。
[0039] 融合多肽可以在兩個(gè)多肽之間進(jìn)一步包括一個(gè)裂解位點(diǎn)。在融合蛋白分泌 之時(shí)，該位點(diǎn)被裂解，從而釋放出這兩個(gè)多肽。裂解位點(diǎn)的實(shí)例包括但不限于在以下 文獻(xiàn)中披露的位點(diǎn)：馬?。∕artin)等人，2003,工業(yè)微生物與生物技術(shù)雜志（J. Ind. Microbiol. Biotechnol.) 3:568-576 ;斯維特娜（Svetina)等人，2000，生物技術(shù)雜志 (J. Biotechnol.) 76:245-251 ;拉斯穆森-威爾遜（Rasmussen-Wilson)等人，1997,應(yīng)用 與環(huán)境微生物學(xué)（Appl. Environ. Microbiol. )63:3488-3493 ;沃德（Ward)等人，1995,生 物技術(shù)（Biotechnology) 13:498-503;以及孔特雷拉斯（Contreras)等人，1991，生物技術(shù) 9:378-381 ;伊頓（Eaton)等人，1986,生物化學(xué)（Biochemistry) 25:505-512 ;柯林斯-拉西 (Collins-Racie)等人，1995,生物技術(shù) 13:982-987 ;卡特（Carter)等人，1989,蛋白質(zhì)：結(jié) 構(gòu)、功能以及遺傳學(xué)（Proteins:Structure，F(xiàn)unction，and Genetics)6:240_248 ;以及史蒂 文斯（Stevens)，2003,藥物發(fā)現(xiàn)世界（Drug Discovery World) 4:35-48。
[0040] 發(fā)明的詳細(xì)說(shuō)明
[0041] 生產(chǎn)方法
[0042] 在第一方面，本發(fā)明涉及在芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞中生產(chǎn)天然非分泌的感興趣多肽 的方法，所述方法包括以下步驟：
[0043] i)在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中，在有助于表達(dá)該多肽的條件下，培養(yǎng)包括一種或多種外源或 異源多核苷酸的芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞，該一種或多種外源或異源多核苷酸編碼不具有分泌 信號(hào)的天然非分泌的感興趣多肽；并且
[0044] ii)無(wú)需進(jìn)行細(xì)胞裂解步驟來(lái)回收該多肽。
[0045] 這些宿主細(xì)胞是在適合于使用本領(lǐng)域中已知的方法產(chǎn)生該多肽的一種營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng) 基中培養(yǎng)的。例如，可以通過(guò)在適合的培養(yǎng)基中和在允許表達(dá)和/或分離該多肽的條件下， 進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，或者在實(shí)驗(yàn)室或工業(yè)發(fā)酵罐中進(jìn)行小規(guī)?；虼笠?guī)模發(fā)酵（包括連續(xù)，分批， 分批補(bǔ)料，或固態(tài)發(fā)酵）來(lái)培養(yǎng)細(xì)胞。該培養(yǎng)是使用本領(lǐng)域中已知的程序，在一種適合營(yíng)養(yǎng) 培養(yǎng)基中發(fā)生，該培養(yǎng)基包括碳和氮來(lái)源及無(wú)機(jī)鹽。適合的培養(yǎng)基可從商業(yè)供應(yīng)商獲得或 可以根據(jù)公開(kāi)的組成（例如，在美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心的目錄中）制備。該溫度典型地 是在30°C -40°C的范圍內(nèi)，并且該pH典型地是在5-8的范圍內(nèi)。本發(fā)明的方法實(shí)現(xiàn)了感興 趣多肽的較高產(chǎn)量，即，至少lg/Ι的發(fā)酵液，優(yōu)選至少l〇g/l并且更優(yōu)選至少20g/l。
[0046] 可以使用特異性針對(duì)該多肽的本領(lǐng)域已知的方法來(lái)檢測(cè)該多肽。這些檢測(cè)方法包 括但不限于，特異性抗體的使用、酶產(chǎn)物的形成或酶底物的消失。例如，可以使用酶測(cè)定來(lái) 確定該多肽的活性。
[0047] 可以使用本領(lǐng)域已知的方法來(lái)回收多肽。例如，該多肽可以通過(guò)常規(guī)程序，包括但 不限于，收集、離心、過(guò)濾、萃取、噴霧干燥、蒸發(fā)或沉淀，從該營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基回收。在一個(gè)方面 中，回收包括該多肽的發(fā)酵液。
[0048] 可以通過(guò)本領(lǐng)域中已知的多種程序來(lái)純化該多肽以獲得基本上純的多肽，這些程 序包括但不限于：色譜法（例如，離子交換色譜、親和色譜、疏水作用色譜、色譜聚焦、以及 尺寸排阻色譜）、電泳程序（例如，制備型等電點(diǎn)聚焦）、差別溶解度（例如，硫酸銨沉淀）、 SDS-PAGE、或萃取（參見(jiàn)例如，蛋白質(zhì)純化（Protein Purification)，詹森（Janson)和賴登 (Ryden)編輯，VCH 出版社（VCH Publishers)，紐約，1989)。
[0049] 在一個(gè)替代性方面中，沒(méi)有回收該多肽，而是將表達(dá)該多肽的本發(fā)明的宿主細(xì)胞 用作該多肽的來(lái)源。
[0050] 天然非分泌多肽
[0051] -種本發(fā)明的天然非分泌的且沒(méi)有信號(hào)肽的感興趣多肽可以從任何屬的微生物 中獲得。出于本發(fā)明的目的，如在此結(jié)合一種給定的來(lái)源使用的術(shù)語(yǔ)"從...獲得"應(yīng)意指 由多核苷酸編碼的多肽是由該來(lái)源或者由其中已經(jīng)插入來(lái)自該來(lái)源的多核苷酸的一種菌 株產(chǎn)生的。
[0052] 該多肽可以是細(xì)菌多肽。例如，該多肽可以是一種革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌多肽，如具有 酶活性的芽孢桿菌屬（Bacillus)、梭菌屬（Clostridium)、腸球菌屬（Enterococcus)、土 芽抱桿菌屬（Geobacillus)、乳酸桿菌屬屬（Lactobacillus)、乳球菌屬（Lactococcus)、 海洋芽孢桿菌屬（Oceanobacillus)、葡萄球菌屬（Staphylococcus)、鏈球菌屬 (Streptococcus)、或鏈霉菌屬（Streptomyces)多肽；或一種革蘭氏陰性細(xì)菌多肽，如 彎曲桿菌屬（Campylobacter)、大腸桿菌（E. col i)、黃桿菌屬（Flavobacterium)、梭桿 菌屬（Fusobacterium)、螺桿菌屬（Helicobacter)、泥桿菌屬（Ilyobacter)、奈瑟氏菌 屬（Neisseria)、假單胞菌屬（Pseudomonas)、沙門氏菌屬（Salmonella)或脲原體屬 (Ureaplasma)多月太。
[0053] 在一方面，該多肽是嗜堿芽孢桿菌（Bacillus alkalophilus)、解淀粉芽孢桿 菌（Bacillus amyloliquefaciens)、短芽抱桿菌（Bacillus brevis)、環(huán)狀芽抱桿菌 (Bacillus circulans)、克勞氏芽抱桿菌（Bacillus clausii)、凝結(jié)芽抱桿菌（Bacillus coagulans)、堅(jiān)硬芽抱桿菌（Bacillus firmus)、燦爛芽抱桿菌（Bacillus lautus)、遲 緩芽抱桿菌（Bacillus lentus)、地衣芽抱桿菌（Bacillus licheniformis)、巨大芽抱 桿菌（Bacillus megaterium)、短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus)、嗜熱脂肪芽孢桿菌 (Bacillus stearothermophilus)、枯草芽抱桿菌（Bacillus subtilis)、或蘇云金芽抱桿 菌（Bacillus thuringiensis)多肽。
[0054] 在另一個(gè)方面中，該多肽是似馬鏈球菌、釀膿鏈球菌、乳房鏈球菌、或馬鏈球菌獸 瘟亞種多肽。
[0055] 在另一個(gè)方面，該多肽是不產(chǎn)色鏈霉菌、除蟲鏈霉菌、天藍(lán)鏈霉菌、灰色鏈絲菌、或 淺青紫鏈霉菌多肽。
[0056] 在另一個(gè)方面中，該多肽衍生自嗜熱細(xì)菌或低嗜熱細(xì)菌（thermophilic or hypothermophilie bacterium)，所述細(xì)菌來(lái)自 Aeropylum、產(chǎn)液菌屬（Aquifex)、古生 球菌屬（Archaeoglubus)、網(wǎng)團(tuán)菌屬、地?zé)峋鷮伲℅eothermobacterium)、甲燒嗜熱菌屬 (Methanopyrus)、火球菌屬、火葉菌屬、硫化葉菌屬、熱袍菌屬、和棲熱菌屬的屬類。一種嗜 熱生物具有至少50°C的最適溫度，并且可以在高達(dá)70°C -80°C的溫度下存活。低嗜熱生物 (hypothermophilic organism)具有至少80°C的最適溫度，并且需要80°C _105°C的生長(zhǎng)溫 度。
[0057] 該多肽可以是一種真菌多肽。例如，該多肽可以是酵母多肽，例如假絲酵 母屬（Candida)、克魯弗酵母屬（Kluyveromyces)、畢赤酵母屬（Pichia)、酵母菌屬 (Saccharomyces)、裂殖酵母屬（Schizosaccharomyces)、或耶氏酵母屬（Yarrowia) 多肽；或絲狀真菌多肽，例如枝頂孢霉屬（Acremonium)、傘菌屬（Agaricus)、鏈格孢 屬（Alternaria)、曲霉屬（Aspergillus)、短梗霉屬（Aureobasidium)、葡萄座腔菌 屬（Botryospaeria)、擬錯(cuò)菌屬（Ceriporiopsis)、毛卩彖殼屬（Chaetomidium)、金孢子 菌屬（Chrysosporium)、麥角菌屬（Claviceps)、旋抱腔菌屬（Cochliobolus)、鬼傘 屬（Coprinopsis)、乳白蟻屬（Coptotermes)、棒囊殼屬（Corynascus)、隱叢赤殼菌屬 (Cryphonectria)、隱球菌屬（Cryptococcus)、色二抱屬（Diplodia)、黑耳屬（Exidia)、 線黑粉酵母屬（Filibasidium)、鐮孢屬（Fusarium)、赤霉屬（Gibberella)、全鞭毛蟲屬 (Holomastigotoides)、腐質(zhì)霉屬（Humicola)、耙齒菌屬（Irpex)、蘑燕屬（Lentinula)、 小腔球菌屬（Leptospaeria)、梨抱菌屬（Magnaporthe)、黑果菌屬（Melanocarpus)、 多孔菌屬（Meripilus)、毛霉屬（Mucor)、毀絲霉屬（Myceliophthora)、新美鞭菌 屬（Neocallimastix)、脈抱菌屬（Neurospora)、擬青霉屬（Paecilomyces)、青霉菌 屬（Penicillium)、平革菌屬（Phanerochaete)、瘤胃壺菌屬（Piromyces)、某真菌屬 (Poitrasia)、假黑盤菌屬（Pseudoplectania)、假披發(fā)蟲屬（Pseudotrichonympha)、 根毛霉菌屬（Rhizomucor)、裂糟菌屬（Schizophyllum)、柱頂孢屬（Scytalidium)、踝 節(jié)菌屬（Talaromyces)、嗜熱子囊菌屬（Thermoascus)、梭孢殼霉屬（Thielavia)、彎頸 霉屬（Tolypocladium)、木霉屬（Trichoderma)、長(zhǎng)毛盤菌屬（Trichophaea)、輪枝孢屬 (Verticillium)、小包腳燕屬（Volvariella)或炭角菌屬（Xylaria)多肽
[0058] 在另一個(gè)方面，該多肽是卡氏酵母、釀酒酵母、糖化酵母、道格拉氏酵母、克魯弗酵 母、諾地酶母、或卵形酵母多肽。
[0059] 在另一個(gè)方面，該多肽是解纖維枝頂孢霉（Acremonium cellulolyticus)、棘孢曲 霉（Aspergillus aculeatus)、泡盛曲霉（Aspergillus awamori)、臭曲霉（Aspergillus foetidus)、煙曲霉（Aspergillus fumigatus)、日本曲霉（Aspergillus japonicus)、構(gòu) 巢曲霉（Aspergillus nidulans)、黑曲霉（Aspergillus niger)、米曲霉（Aspergillus oryzae)、狹邊金孢子菌（Chrysosporium inops)、嗜角質(zhì)金孢子菌（Chrysosporium keratinophilum)、拉克淖金抱子菌（Chrysosporium lucknowense)、類狀金抱子菌 (Chrysosporium merdarium)、毯金抱子菌（Chrysosporium pannicola)、昆士蘭金抱子 菌（Chrysosporium queenslandicum)、熱帶